一种温泉水在化妆品中的应用

摘要

本发明公开了一种温泉水在化妆品中的应用。温泉水作为化妆品中的保湿活性成分；每升温泉水含有如下成分：Na+75-114mg、Ca2+16-24mg、Mg2+0.33-0.5mg和Sr+0.36-0.55mg。本发明温泉水中的钠、钙、镁、锶离子可协同提高皮肤中HA的含量，以及皮肤中CD44、HAS2和AQP3的表达量，从而提高皮肤保湿能力。

权利要求

1.一种温泉水在化妆品中的应用，其特征在于，所述温泉水作为所述化妆品中的保湿活性成分；每升所述温泉水含有如下成分：Na+75-114mg、Ca2+16-24mg、Mg2+0.33-0.5mg和Sr+

0.36-0.55mg。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述温泉水的pH值为6.8-7.5；

和/或，每升所述温泉水中，所述Na+的含量为94.4mg；

和/或，每升所述温泉水中，所述Ca2+的含量为19.9mg；

和/或，每升所述温泉水中，所述Mg2+的含量为0.42mg；

+

和/或，每升所述温泉水中，所述Sr的含量为0.46mg。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述温泉水的pH值为6.95-7.02。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，每升所述温泉水还含有如下成分：K+5.9-

8.9mg、Li+0.4-0.63mg、Mn2+0.0168-0.0252mg、F-1.2-1.8mg、SO42-30-46mg和H2SiO3 20-

32mg。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，每升所述温泉水还含有如下成分：K+7.4mg、Li+0.52mg、Mn2+0.021mg、F-1.5mg、SO42-37.9mg和H2SiO3 26.2mg。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述温泉水的取水口为日多温泉。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述温泉水采用滤膜进行过滤除菌，所述滤膜的孔径为0.22μm。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述保湿活性成分为提高皮肤中透明质酸的含量，以及皮肤中透明质酸受体、透明质酸合成酶2和水通道蛋白3的表达量的活性成分。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述温泉水先用除温泉水以外的水进行稀释然后再应用于化妆品中，稀释后温泉水的浓度为0.1％-5％，所述百分比为温泉水的体积占温泉水和除温泉水以外的水的总体积的百分比。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述稀释后温泉水的浓度为0.5％-1％；

和/或，所述除温泉水以外的水为去离子水、蒸馏水和超纯水一种或多种。

说明书

一种温泉水在化妆品中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种温泉水在化妆品中的应用。

背景技术

[0002] 皮肤覆盖于人体表面，与外界环境直接接触，除了能够保护机体免受外界各种因素的伤害，同时还能作为一面镜子反映机体的健康状态。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成，并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。皮肤可以阻止外界的一些不利因素(如物理因素、化学因素、生物因素等)进入人体，阻止其对机体造成损害；同时可以避免人体表皮及真皮内水分等物质的迅速丢失从而维持人体本身皮肤屏障功能的稳定。健康的皮肤应保持角质层的含水量处于10％-30％之间，当肌肤表层即角质层的水分达到15-30％时，皮肤会柔软光滑没有细纹；当角质层水分逐渐流失，当含量低于10％时，角质层的代谢功能就会出现紊乱，皮肤就会出现干燥、细纹、紧绷、粗糙及脱屑等现象。

[0003] 透明质酸(HA)是一种酸性粘多糖，人体皮肤含有大量的HA，HA具有非常好的保水作用，与皮肤保湿息息相关。HA的含量与透明质酸合成酶 2(Hyaluronan Synthase 2，HAS2)表达水平紧密相关，同时HA发挥生物学功效与其在细胞上的透明质酸受体(CD44)数量密切相关。水通道蛋白3 (AQP3)主要负责水分子或小分子物质如甘油在细胞膜内外的运输，对于皮肤保湿至关重要。

[0004] 因此，研究如何提高皮肤中HA含量，以及皮肤中CD44、HAS2和AQP3 的表达量，对于皮肤保湿具有重要意义。

[0005] 位于西藏拉萨市墨竹工卡县的冈底斯—念青唐古拉山脉以南的喜马拉雅地热带，海拔4260～4360m处有一片温泉区，泉区气候温湿，该区域即为日多温泉区。

[0006] 日多温泉水是热泉水，地表水温最高达81℃，富含7重微量元素，符合国家理(医)疗热矿泉水水质标准，富含21种的矿物元素，pH值为6.5～8.5，呈中偏弱碱性，对人体大有益处，具有活血化瘀、调理血压等保健功效。并且，日多温泉水中含有大量自然界的益生菌。益生菌以鞘脂单胞菌科鞘氨醇单胞菌属为主，能产生胞外多糖高聚物，具有生物学功能。此外，日多温泉还含有大量硫元素，抑制一些细菌的生长。

[0007] 然而，目前还鲜有文献报道将日多温泉水用于具有保湿功效的化妆品中。

发明内容

[0008] 本发明所解决的技术问题在于提供了一种温泉水在化妆品中的保湿应用。皮肤中HA的含量，CD44、HAS2和AQP3的表达量与皮肤保湿能力息息相关，本发明的含温泉水的化妆品能够提高皮肤中HA的含量，CD44、 HAS2和AQP3的表达量，从而提高皮肤保湿能力。

[0009] 本发明人研究发现：位于西藏拉萨市墨竹工卡县日多乡境内的日多温泉水可提高皮肤中HA的含量，以及皮肤中CD44、HAS2和AQP3的表达量，达到提高皮肤保湿能力的功效。由此，对日多温泉水的成分进行了表征分析，发现温泉水中的钠、钙、镁、锶离子可协同提高皮肤中HA的含量，以及皮肤中CD44、HAS2和AQP3的表达量，进而达到保湿功效。

[0010] 最终本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题。

[0011] 本发明提供了一种温泉水在化妆品中的保湿应用，所述温泉水作为所述化妆品中的保湿活性成分；每升所述温泉水含有如下成分：Na+75-114mg、 Ca2+16-24mg、Mg2+0.33-0.5mg和Sr+0.36-0.55mg。

[0012] 本发明中，所述温泉水的pH值一般为6.8-7.5，较佳地为6.95-7.02。

[0013] 本发明中，每升所述温泉水中，所述Na+的含量较佳地为94.4mg。

[0014] 本发明中，每升所述温泉水中，所述Ca2+的含量较佳地为19.9mg。

[0015] 本发明中，每升所述温泉水中，所述Mg2+的含量较佳地为0.42mg。

[0016] 本发明中，每升所述温泉水中，所述Sr+的含量较佳地为046mg。

[0017] 本发明中，每升所述温泉水较佳地还含有如下成分：K+5.9-8.9mg、Li+ 0.4-0.63mg、Mn2+0.0168-0.0252mg、F-1.2-1.8mg、SO42-30-46mg和H2SiO3 20-32mg；更佳地为K++ 2+ - 2-
7.4mg、Li0.52mg、Mn 0.021mg、F1.5mg、SO4  37.9mg和H2SiO3 26.2mg。

[0018] 本发明中，所述温泉水还可含有其它极微量的元素或离子，例如Zn、 Cu、Fe、Al、Cl元素和/或CO32-，此处极微量是指采用常规方法无法检测出其含量。

[0019] 本发明中，所述温泉水的水源地不作特殊限定，只要该温泉水包括如上含量范围内的钠、钙、镁、锶离子即可。较佳地，所述温泉水的取水口为日多温泉，日多温泉位于拉萨市墨竹工卡县日多乡境内，海拔4000余米，其地表温度一般在65-83℃之间，pH值在6.8-7.5之间。

[0020] 其中，日多温泉的具体取水时节、取水位点、取水深度等不同，温泉水中的上述成分含量会有所不同，但只要所需的成分含量在本发明限定的范围内，即可实现本发明提高皮肤中HA的含量，以及皮肤中CD44、HAS2和 AQP3的表达量的效果，进而达到保湿功效。

[0021] 本发明中，所述温泉水较佳地采用滤膜进行过滤除菌，所述滤膜的孔径较佳地为0.22μm。

[0022] 本发明中，所述保湿活性成分为提高皮肤中HA的含量，以及皮肤中 CD44、HAS2和AQP3的表达量的活性成分。

[0023] 本发明中，所述化妆品为本领域技术术语，指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品，包括护肤品和彩妆品。

[0024] 本发明中，对于化妆品的种类不作特殊限定，其可为基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品等。本发明中，对于化妆品的剂型也无特殊限定，具体可根据不同目的进行合理选择。

[0025] 本发明中，所述温泉水应用于化妆品时，一般是将温泉水从取水时的较高温度冷却到常温再使用，其中，所述常温为本领域技术术语，一般为15- 35℃。

[0026] 本发明中，所述温泉水应用于化妆品时，较佳地用除温泉水以外的水进行稀释，稀释后温泉水的浓度为0.1％-5％，较佳地为0.5％-1％，所述百分比为温泉水的体积占温泉水和除温泉水以外的水的总体积的百分比；其中，所述除温泉水以外的水为常规用于化妆品中的水的类型，包括去离子水、蒸馏水或超纯水等，较佳地为去离子水。

[0027] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

[0028] 本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0029] 本发明的积极进步效果在于：

[0030] 本发明首次发现位于西藏拉萨市墨竹工卡县日多乡境内的日多温泉水中的钠、钙、镁、锶离子可协同提高皮肤中HA的含量，以及皮肤中CD44、 HAS2和AQP3的表达量，从而提高皮肤保湿能力。

附图说明

[0031] 图1为效果实施例2通过免疫组化测定的HA结合蛋白的含量对比图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水。

[0032] 图2为效果实施例2通过免疫组化测定的CD44蛋白表达量的对比图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水， c是实施例2终浓度为1％的日多温泉水。

[0033] 图3为效果实施例2通过免疫荧光染色测定的HAS2蛋白表达量的对比图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，c是实施例2终浓度为1％的日多温泉水。

[0034] 图4为效果实施例2对HAS2的免疫荧光半定量分析图，其中，“NT”为空白对照组，“0.5％温泉水”为实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，“1％温泉水”为实施例2终浓度为1％的日多温泉水。

[0035] 图5为效果实施例2通过免疫荧光染色测定的AQP3蛋白表达量的比较图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，c是实施例2终浓度为1％的日多温泉水。

[0036] 图6为效果实施例2对AQP3的免疫荧光半定量分析图，其中，“NT”为空白对照组，“0.5％温泉水”为实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，“1％温泉水”为实施例2终浓度为1％的日多温泉水。

具体实施方式

[0037] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0038] 下述实施例中，所用的日多温泉水取自位于西藏拉萨市墨竹工卡县日多乡境内的日多温泉，海拔4000余米，地表温度在65-83℃之间。

[0039] 下述实施例中，所用温泉水中的成分含量采用国家标准GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法进行检测。

[0040] 下述实施例中，所用的其它原料和试剂皆可市售获得。

[0041] 实施例1-2

[0042] 日多温泉水活性物的配制：

[0043] 温泉水从水源地取来之后，用0.22um的滤膜过滤除菌。

[0044] 本实施例1-2所用的日多温泉水pH值在6.95-7.02之间，其成分如下表 1所示。

[0045] 表1

[0046]

[0047]

[0048] 实施例1-2中按照下表2配制日多温泉水活性物。

[0049] 表2

[0050]

[0051] 注：百分比为温泉水的体积占温泉水和去离子水的总体积的百分比。

[0052] 实施例3

[0053] 日多温泉水活性物的配制：

[0054] 温泉水从水源地取来之后，用0.22um的滤膜过滤除菌。

[0055] 本实施例所用的日多温泉水pH值在6.95-7.02之间，其成分如下表3所示。

[0056] 表3

[0057]成分 单位 含量测定值
钠离子 mg/L 75.5
钙离子 mg/L 16.0
钾离子 mg/L 8.9
镁离子 mg/L 0.5
锌离子 mg/L 未检出(<0.005)
锶离子 mg/L 0.55
铜离子 mg/L 未检出(<0.0001)
锂离子 mg/L 0.46
锰离子 mg/L 0.0168
铁离子 mg/L 未检出(<0.005)
偏硅酸 mg/L 32
铝离子 mg/L 未检出(<0.001)
硒离子 mg/L 未检出(<0.001)
碳酸根 mg/L 未检出(<0.5)
氯离子 mg/L 未检出(<0.1)
硫酸根 mg/L 30
氟离子 mg/L 1.8

[0058] 取上述温泉水10mL加入蒸馏水进行稀释，获得终浓度为0.5％的日多温泉水活性物，百分比为温泉水的体积占温泉水和去离子水的总体积的百分比。

[0059] 按照效果实施例1-2的方法进行皮肤模型的制备和皮肤模型真表皮等各层结构关键蛋白表征，结果表明该浓度下的温泉水的效果与实施例1的温泉水效果相当，能够提高HA的含量，CD44、HAS2和AQP3的表达量，从而提高皮肤保湿能力。

[0060] 实施例4

[0061] 日多温泉水活性物的配制：

[0062] 温泉水从水源地取来之后，用0.22um的滤膜过滤除菌。

[0063] 本实施例所用的日多温泉水pH值在7.0-7.1之间，其成分如下表4所示。

[0064] 表4

[0065]成分 单位 含量测定值
钠离子 mg/L 114
钙离子 mg/L 24
钾离子 mg/L 5.9
镁离子 mg/L 0.33
锌离子 mg/L 未检出(<0.005)
锶离子 mg/L 0.36
铜离子 mg/L 未检出(<0.0001)
锂离子 mg/L 0.63
锰离子 mg/L 0.0252
铁离子 mg/L 未检出(<0.005)
偏硅酸 mg/L 20
铝离子 mg/L 未检出(<0.001)
硒离子 mg/L 未检出(<0.001)
碳酸根 mg/L 未检出(<0.5)
氯离子 mg/L 未检出(<0.1)
硫酸根 mg/L 46
氟离子 mg/L 1.2

[0066]  取上述温泉水10mL加入超纯水进行稀释，获得终浓度为0.5％的日多温泉水活性物，百分比为温泉水的体积占温泉水和超纯水的总体积的百分比。

[0067] 按照效果实施例1-2的方法进行皮肤模型的制备和皮肤模型真表皮等各层结构关键蛋白表征，结果表明该浓度下的温泉水的效果与实施例1的温泉水效果相当，能够提高HA的含量，CD44、HAS2和AQP3的表达量，从而提高皮肤保湿能力。

[0068] 效果实施例1

[0069] 皮肤模型的制备：

[0070] 从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞 (NHEK)(提取方法参考文献：伍津津，朱堂友.皮肤组织工程[M].北京：人民军医出版社，2009：72－103)。将人原代成纤维细胞复苏，复苏过程为：将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，离心机1000rpm/min 离心10min。将复苏所得细胞使用DMEM培养基在37℃的二氧化碳培养箱中培养一周后，进行消化(将细胞从培养箱中取出，吸弃原培养基，加磷酸缓冲盐溶液(PBS)15mL润洗细胞一次，加8mL 0.05％胰蛋白酶后，于37℃的二氧化碳培养箱中孵育
8min，取出，超净台中加10mL含FBS的DMEM 培养基，移液枪取出细胞于50mL离心管中，离心机中1000rpm，离心10min 后弃上清，细胞待用)后与胶原混合进行真皮阶段培养，于37℃的二氧化碳培养箱中培养3～4天，然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞，消化接种 (5×
4
10 个细胞)到真皮阶段的皮肤模型表面，依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段，添加温泉水的时间是升气液相之前的最后一次换液，培养至 18天得到可用于检测的3D皮肤模型(制备皮肤模型的具体步骤详见ANNIE F.BLACK,Ph.D.CHARBEL BOUEZ,al.Optimization and Characterization of an Engineered Human Skin Equivalent.TISSUE ENGINEERING Volume 11, Number 5/6,2005.Mary Ann Liebert,Inc.)。

[0071] 在人原代角质细胞接种到真皮阶段的皮肤模型表面培养至形成3D皮肤模型的第3天至第18天的过程中，根据所使用培养基的不同进行分组，形成空白对照(NT)组、加入不同浓度日多温泉水的阳性对照组。

[0072] 效果实施例2

[0073] 皮肤模型真表皮等各层结构关键蛋白表征：

[0074] 对效果实施例1制备的3D皮肤模型一分为二，其中一半放在10％的福尔马林中固定，另一半放在OCT中。放在10％福尔马林的皮肤模型固定24 后，用梯度乙醇进行脱水，然后浸蜡，最后用石蜡包埋，用石蜡切片机处理蜡块获得石蜡切片；放在冷冻OCT中的皮肤模型放在液氮上快速冷却凝固，用冷冻切片机获得冷冻OCT切片。对重建皮肤中的与保湿相关的物质如HA、 HAS2、AQP3和CD44进行免疫组化/荧光染色。

[0075] 免疫组化时，取出厚度为5μm的石蜡切片(分别来源于不含或含有温泉水的培养基培养的皮肤模型)进行免疫组织化学检测。在检测HA含量和 CD44表达量时，将石蜡切片浸入0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH值6.0)中，在100℃下浸渍30分钟后，再在30分钟内冷却至室温。免疫组化时，HA结合蛋白第一抗体(货号385910，Millipore)或CD44第一抗体(货号5639， Thermo fisher)孵育在室温下进行1小时，然后根据制造商的说明书用Dako strept ABC复合物/HRP试剂盒染色。在室温下，用苏木精温育5分钟对细胞核进行染色，然后在光学显微镜(Zeiss Axio Scope A1)25×放大倍数下拍照观察，获得图1和图2。

[0076] 免疫荧光染色时，将厚度5μm的冷冻OCT切片取出，用冷丙酮固定 10min。PBS处理5min后，加入含5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液，室温静置1h。分别加入HAS2的第一抗体(ab140671，Abcam)，AQP3的第一抗体(sc-518001，Santa Cruz Biotechnology)于4℃过夜，次日分别加入对应的HAS2第二抗体(K4001，Dako)、AQP3第二抗体(K4001，Dako)和荧光染料Alexa Fluor568及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室温避光孵育 1h，最后加入封片剂封片，在荧光显微镜(Zeiss AX1025)在25×放大倍数下观察、拍照，获得图3和图5。

[0077] 实验结果用Microsoft Excel统计软件进行分析处理。两两比较采用t检验，P<0.05表示有统计学差异，以“*”标记。图像分析使用Image-Pro Plus 7.0 进行处理分析。

[0078] 图1是效果实施例2通过免疫组化测定的HA结合蛋白的含量对比图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1中终浓度为0.5％的日多温泉水。如图1所示，深颜色的部分表示HA结合蛋白的量，间接表示HA含量，加入终浓度为0.5％的温泉水与空白对照组相比显著地提高了皮肤HA含量， HA是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一，其生理功能是使水分进入细胞间隙，并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶，将细胞粘在一起，发挥正常的细胞代谢作用，保持细胞水分，可在不同环境中自动调节，始终维持皮肤水分在25-30％，保持皮肤的湿润、清爽，使皮肤更富有弹性，起到抗皱防皱作用，所以0.5％日多温泉水作用后显著提高了皮肤模型中HA的含量，可以有效提高皮肤保湿能力。

[0079] 图2为效果实施例2通过免疫组化测定的CD44蛋白表达量的对比图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水， c是实施例2终浓度为1％的日多温泉水。如图2所示，椭圆形状部分表示 CD44的表达量，加入终浓度0.5％和1％的温泉水与空白对照组相比显著地提高了皮肤CD44蛋白表达量。CD44肽链的N端可结合HA，故CD44也被视为透明质酸的受体，HA发挥生物学功效与其在细胞上的受体数量 (CD44)密切相关，所以0.5％和1％日多温泉水作用后显著提高了皮肤模型中CD44蛋白表达量，具有皮肤保水的潜在功效。

[0080] 图3为效果实施例2通过免疫荧光染色测定的HAS2蛋白表达量的对比图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，c是实施例2终浓度为1％的日多温泉水。如图3所示，浅白色部分表示HAS2的表达量，加入终浓度0.5％和1％的温泉水与空白对照组相比显著地提高了皮肤HAS2蛋白表达量。

[0081] 图4为效果实施例2对HAS2的免疫荧光半定量分析图，其中，“NT”为空白对照组，“0.5％温泉水”为实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，“1％温泉水”为实施例2终浓度为1％的日多温泉水。如图4所示，通过免疫荧光半定量分析，发现添加0.5％和1％日多温泉水后，HAS2的表达量分别变为1.41倍和1.83倍，较未添加温泉水的空白对照组表达量分别提高了41％和83％。HAS2存在于细胞质膜上，是一类能够特异性作用于HA合成过程中的酶，HAS2通过添加葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖延长HA。HAS2的表达量越高，合成的HA就越多，皮肤的保湿能力就越强。所以0.5％和1％日多温泉水作用后显著提高了皮肤模型中HAS2的表达量，具有潜在的皮肤保水的功效。

[0082] 图5为效果实施例2通过免疫荧光染色测定的AQP3蛋白表达量的比较图，其中，a是空白(NT)对照组，b是实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，c是实施例2终浓度为1％的日多温泉水。如图5所示，浅白色部分亮度表示AQP3的表达量，加入终浓度0.5％和1％的温泉水与空白对照组相比显著地提高了皮肤AQP3的表达量。

[0083] 图6为效果实施例2对AQP3的免疫荧光半定量分析图其中，“NT”为空白对照组，“0.5％温泉水”为实施例1终浓度为0.5％的日多温泉水，“1％温泉水”为实施例2终浓度为1％的日多温泉水。如图6所示，通过免疫荧光半定量分析，发现添加0.5％和1％日多温泉水后，AQP3的表达量分别变为1.26倍和1.53倍，较未添加温泉水的空白对照组表达量分别提高了26％和53％。AQP3主要负责水分子或小分子物质如甘油在细胞膜内外的运输，对于皮肤保湿至关重要。所以，可以通过测定AQP3的表达量来反映温泉水是否具有保湿功效。所以
0.5％和1％日多温泉水作用后显著提高了皮肤模型中AQP3的表达量，表明日多温泉水具有潜在的保湿功效。