蝉花菌丝体活性物质用于制备预防、延缓或治疗眼部病变的组合物的用途

摘要

本发明提供了一种蝉花菌丝体活性物质用于制备预防、延缓或治疗眼部病变的组合物的用途。所述蝉花菌丝体活性物质是以下列步骤制备而成：(a)取蝉花菌丝体于平板培养基上，于15-35℃的温度下培养5-14天；(b)将步骤(a)培养后的蝉花菌丝体接种至烧瓶内，于15-35℃、pH值为2-8的环境培养3-7天；(c)将步骤(b)培养后的蝉花菌丝体接种于发酵槽内，于15-35℃、pH值为2-8的环境下搅拌培养3-5天，形成含有蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体发酵液。

权利要求

1.一种蝉花菌丝体活性物质用于制备预防、延缓或治疗眼球前后房扩张、玻璃体液扩张及/或视网膜脱离的组合物的用途，其中，该蝉花菌丝体活性物质是由包括下列所述步骤的方法制备而成：(a)取蝉花菌丝体于平板培养基上，于15-35℃的温度下培养5-14天；

(b)将步骤(a)培养后的蝉花菌丝体接种至烧瓶内，于15-35℃、pH值为2-8的环境培养

3-7天；

(c)将步骤(b)培养后的蝉花菌丝体接种于发酵槽内，于15-35℃、pH值为2-8的环境下搅拌培养3-5天，形成含有该蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体发酵液。

2.如权利要求1所述的用途，其中，制备该蝉花菌丝体活性物质的步骤更包括步骤(d)：将该蝉花菌丝体发酵液冷冻干燥后磨粉，形成含有该蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体冻干粉。

3.如权利要求2所述的用途，其中，制备该蝉花菌丝体活性物质的步骤更包括步骤(e)：将该蝉花菌丝体冻干粉以溶剂萃取，形成含有该蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体萃取液。

4.如权利要求3所述的用途，其中，制备该蝉花菌丝体活性物质的步骤更包括步骤(f)：将该蝉花菌丝体萃取液干燥，以获得该蝉花菌丝体活性物质。

5.如权利要求3或4所述的用途，其中，在步骤(e)中，该溶剂选自水或醇类。

6.如权利要求1所述的用途，其中，步骤(b)的烧瓶培养为震荡培养，且转速为10-

250rpm。

7.如权利要求1所述的用途，其中，步骤(c)中该发酵槽进一步通入气体，该气体包括空气、氧气、二氧化碳、氦气或其组合，该发酵槽的槽压为0.5-1.0kg/cm2且通气速率为0.01-

1.5VVM。

8.如权利要求1所述的用途，其中，该组合物为医药组合物，该医药组合物进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。

9.如权利要求1所述的用途，其中，该组合物为食品添加剂。

10.如权利要求1所述的用途，其中，该组合物的施用方式包含口服、滴剂或栓剂。

说明书

蝉花菌丝体活性物质用于制备预防、延缓或治疗眼部病变的

组合物的用途

技术领域

[0001] 本发明关于一种蝉花菌丝体活性物质及包含其的组合物在预防、延缓或治疗类固醇诱导产生的眼部组织病变的用途。特别是指此蝉花菌丝体活性物质在用于制备预防、延缓或治疗眼球前后房扩张、玻璃体液扩张及/或视网膜脱离的组合物的用途。

背景技术

[0002] 蝉花(Cordyceps cicadae)

[0003] 蝉花型态与分布

[0004] 蝉花又名土蝉花、虫花、蝉草、胡蝉、蝉菌、蝉蛹草、金蝉花、蝉茸或蚕茸等，为子囊菌亚门(Ascomycotina)，麦角菌目(Claricipiyales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps)真菌，由感染蝉蛹或蝉科山蝉(Cicada flammate)、蟪蛄(Platypleura kaempferi)、黑蚱(Crytotympana pustulata)及竹蝉(Platylomia pieli)等幼虫身上使其死亡，后于蝉蛹前端或虫体头部形成花蕾状子座而成，故名蝉花。为一种菌虫复合体。蝉花可依不同的寄主及感染菌种分类为大蝉花或金蝉草(C.cicadae)、小蝉花(C.sobolifera)及蝉草或蝉生虫草(C.cicadicola)三种。蝉花多产于长江以南热带和亚热带地区，在中国为福建、浙江、四川、云南、台湾及江苏等地。其中，在中国台湾部分山区亦有野生蝉花子实体踪迹。

[0005] 蝉拟青霉的有性阶段，被认为是大蝉草(Cordyceps cicadae)，大蝉草俗名独角龙，子座棒状或角状，从寄主头部发出，单生或丛生，褐色。在自然界广为分布的是蝉拟青霉(蝉花)，大蝉草稀少。

[0006] 类固醇药物

[0007] 1.类固醇药物及其在眼科上的应用

[0008] 类固醇具有强力的抗发炎及免疫调节的作用。对于一些发炎性的疾病如血管炎、气喘、过敏性疾病、顽固性湿疹、过敏性休克、慢性阻塞性肺病、自体免疫疾病(如红斑性狼疮、皮肌炎、多发性肌炎、肾丝球肾炎、发炎性关节炎、硬皮症)、脑部水肿、一些发炎性的神经病变及癌症(如淋巴癌)等疾病，具有很高的医学治疗价值。常用的类固醇药物有羟甲烯龙、十一酸睪酮、氧甲氢龙、去氢甲基睪酮、美雄酮、司坦唑醇等。而含有类固醇的制剂种类繁多，可通过口服、注射、吸入及外用等方式摄入。

[0009] 眼科使用的类固醇眼药是皮质类固醇(corticosteroid)类，皮质类固醇源自人体肾上腺皮质分泌的肾上腺糖皮质素(adrenal glucocorticoids)，主要包括皮质醇(cortisol)及皮质酮(corticosterone)。正常身体血液中具有一定浓度的糖皮质素，当遇到外在压力(stress)增加的时候，其分泌就会增加(因此糖皮质素又称为压力激素)，目的在于增强身体抗压的生理反应，包括抗发炎、维持血压、升糖、钙质吸收、胃酸分泌、调节蛋白质、脂肪、醣类、电解质及水分的代谢等等。

[0010] 临床眼科使用类固醇药物的目的，主要在于皮质类固醇可广泛的抑制多种情况下身体所发生的发炎免疫反应，并减缓伴随发炎所衍生的各种症状及后遗症。适用在眼睛前部发炎、自体免疫眼疾、及角膜移植术后的患者。一般而言，眼科用的皮质类固醇抗发炎效度：betamethasone≧地塞米松(dexamethasone)>>氟羟氢化泼尼松(triamcinolone)>泼尼松龙(prednisolone)>>氢化可的松(hydrocortisone)。

[0011] 2.倍他米松(Betamethasone)

[0012] 本专利试验中所使用的类固醇药物即为倍他米松(Betamethasone)，属于糖皮质激素类药物，于1961年在美国被批准用于医疗用途。倍他米松应用于许多疾病的治疗上，包括风湿性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮，皮肤病如皮炎和牛皮癣，过敏性疾病如哮喘和血管性水肿，也可在早产时协助婴儿肺部发育，亦可治疗克罗恩病、白血病，以及与氟氢可的松合用治疗肾上腺皮质机能不足等。倍他米松可以通过口服，肌肉注射，或以外用药膏给药。其外用药膏是世界卫生组织的基本药物清单，是公共卫生系统中所需的最有效和最安全的药物，可作为通用药物使用。

[0013] 3.类固醇药物的副作用

[0014] 类固醇的副作用与药量及使用期间有直接的关系，若长期使用、或大剂量使用较容易造成副作用。长期使用可能导致肾上腺功能不全。过量使用类固醇药物会导致HPA轴(hypotalmic-pituitary-adrenocortical axis)异常，容易导致肾上腺皮质长期停止工作而萎缩，使人体对类固醇药物产生依赖性。严重的副作用包括心血管问题、肝脏损害、糖尿病、皮肤问题、情绪不稳定、肠胃问题、感染风险增加、肌肉无力、月经周期改变、男性生殖功能下降和严重的过敏反应等。

[0015] 类固醇药物在眼睛上的副作用，会抑制眼睛的细胞免疫功能，可以导致原有微生物感染加重，因此类固醇眼药水通常会与抗生素合并使用。且类固醇眼药水会抑制角膜上皮愈合，长期使用可造成高眼压及白内障等眼部病变。

[0016] 因此，要如何减低类固醇药物对人体造成的副作用，逐渐成为一个重要的课题。

发明内容

[0017] 为了解决上述的缺点和不足，本发明的目的在于提供蝉花菌丝体活性物质用于制备预防、延缓或治疗眼球前后房扩张、玻璃体液扩张及/或视网膜脱离的组合物的用途。

[0018] 为达到上述目的，本发明提供一种蝉花菌丝体活性物质用于制备预防、延缓或治疗眼球前后房扩张、玻璃体液扩张及/或视网膜脱离的组合物的用途。此蝉花菌丝体活性物质是由包括下列所述步骤的方法制备而成：

[0019] (a)取蝉花菌丝体于平板培养基上，于15-35℃的温度下培养5-14天；(b)将步骤(a)培养后的蝉花菌丝体接种至烧瓶内，于15-35℃、pH值为2-8的环境培养3-7天；(c)将步骤(b)培养后的蝉花菌丝体接种于发酵槽内，于15-35℃、pH值为2-8的环境下搅拌培养3-5天，形成含有蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体发酵液。

[0020] 一实施例中，上述制备蝉花菌丝体活性物质的步骤更包括步骤(d)：将蝉花菌丝体发酵液冷冻干燥后磨粉，形成含有蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体冻干粉。

[0021] 一实施例中，上述制备蝉花菌丝体活性物质的步骤更包括步骤(e)：将蝉花菌丝体冻干粉以溶剂萃取，形成含有蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体萃取液。

[0022] 一实施例中，上述制备蝉花菌丝体活性物质的步骤更包括步骤(f)：将蝉花菌丝体萃取液干燥，以获得蝉花菌丝体活性物质。

[0023] 一实施例中，上述步骤(e)中的溶剂选自水或醇类。

[0024] 一实施例中，步骤(b)的烧瓶培养为震荡培养，且转速为10-250rpm。

[0025] 一实施例中，步骤(c)中的发酵槽进一步通入气体，此气体包括空气、氧气、二氧化碳、氦气或其组合，发酵槽的槽压为0.5-1.0kg/cm2且通气速率为0.01-1.5VVM。

[0026] 一实施例中，上述组合物为医药组合物，且此医药组合物进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。

[0027] 一实施例中，上述组合物为食品添加剂。

[0028] 一实施例中，上述组合物的施用方式包含口服、滴剂或栓剂。

[0029] 一实施例中，上述组合物的施用方式为口服。

[0030] 为使本发明的上述及其他方面更为清楚，下文特举实施例，并配合所附图式进行说明。

附图说明

[0031] 图1为本发明实施例2中，各组大鼠的眼球前房组织染色切片检测的结果；

[0032] 图2为本发明实施例2中，各组大鼠的眼球后房组织染色切片检测的结果；

[0033] 图3为本发明实施例2中，各组大鼠的眼球视网膜组织染色切片检测的结果；

[0034] 图4为本发明实施例2中，各组大鼠的眼球水晶体组织染色切片检测的结果。

具体实施方式

[0035] 为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合以下具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

[0036] 蝉花菌丝体活性物质制备方法

[0037] 蝉花菌丝体来源

[0038] 本发明的蝉花(Cordyceps cicadae)菌丝体是由采集而得的中国台湾野生蝉花子实体，经分离而得其菌丝，并继代于平板培养基上，经中国台湾食品工业发展研究所做鉴定证实其基因序列为蝉花(Cordyceps cicadae)。但本发明所述的蝉花菌丝体活性物质不限于由此菌种所得。

[0039] 菌丝体液体培养

[0040] 将蝉花菌丝体接种于平板培养基上，于适当温度15-35℃(较佳为25℃)下培养五天至两周后，刮取菌丝接种于烧瓶内。在15-35℃(较佳为25℃)，pH值为2-8(较佳为pH值为4-7，更佳为pH值为4.5)，震荡速率10-250rpm的条件下培养3-7天，然后将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在15-35℃(较佳为25℃)，槽压0.5-1.0公斤/平方公分，pH值为2-8下，10-150rpm搅拌速度或不搅拌(air lift)情况，以0.01-1.5VVM通气速率通入空气，或空气、氧气、二氧化碳、氮气及上述气体的混合物(较佳者为空气)，培养时间为
3-5天内，即得蝉花菌丝体发酵液。此发酵液包括菌丝体与澄清液。前述培养条件仅为例示，使用者可视情况调整。

[0041] 本发明使用的烧瓶培养基、发酵槽培养基配方可如下表1所示：

[0042] 表1

[0043]成分 含量(重量％)
综合性碳氮源 0.01-5
动植物来源蛋白及其水解物 0.01-2
酵母或麦芽抽出物(粉、膏) 0.001-2
无机盐类 0.0001-0.05
糖类 0.01-10

[0044] 其中，该综合性碳氮源可为谷类(如：麦粉类)或豆类(如：黄豆粉、绿豆粉、大豆粉等)。该无机盐类可为硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铁等；其中该糖类可为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等。特别说明的是，本发明使用的培养基并不限制为上述成分或比例，使用者可视实际情况进行调整。

[0045] 发酵液干燥

[0046] 此蝉花菌丝体发酵液可进一步藉由干燥步骤以制备为冻干粉等其他剂型。干燥方法包括但不限于：喷雾干燥、热风干燥、滚筒干燥、冷冻干燥或其他方式。

[0047] 萃取-水萃取

[0048] 蝉花菌丝体发酵液经干燥法制备而得的发酵液冻干粉可加入蒸馏水回溶，以90℃-121℃温度加热20-120分钟，待冷却后经减压浓缩法或上述的任一干燥法进行干燥，即得蝉花菌丝体水萃物。

[0049] 萃取-醇萃取

[0050] 蝉花菌丝体发酵液经干燥法制备而得的发酵液冻干粉加入醇类溶剂(1％-100％甲醇或乙醇)回溶，萃取20-120分钟(包含但不限于浸泡、搅拌、震荡或超声波萃取法)，之后经减压浓缩法或上述的任一干燥法进行干燥，即得蝉花菌丝体醇萃物。

[0051] 上述蝉花菌丝体发酵液、蝉花菌丝体冻干粉、蝉花菌丝体水萃物及蝉花菌丝体醇萃物皆含有本发明的蝉花菌丝体活性物质。以下根据上述方法制备蝉花菌丝体活性物质，并进行生物实验评估其功效。

[0052] 实施例1：蝉花菌丝体活性物质制备

[0053] 菌丝体菌株：本实施例所用的蝉花(Cordyceps cicadae)菌株为现已公开寄存于财团法人食品工业发展研究所的生物资源研究中心(BCRC)，寄存编号为MU30106的蝉花菌丝体。但本发明所述的蝉花活性物质不限于由此菌种所得。

[0054] 平板培养：将菌丝体接种于平板培养基上，培养基为马铃薯糊精培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)，于25℃下培养5天。

[0055] 烧瓶培养：刮取平板上的菌丝接种于烧瓶内，用下列培养基配方，在25℃，pH值为4.5下，于震荡机上以转速120rpm震荡培养三天；

[0056] 培养基配方如表2所示：

[0057] 表2

[0058]成分 含量(重量％)
蔗糖 2.0
酵母抽出物 0.5
黄豆粉 1.0

[0059] 发酵槽培养：培养基同上，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在25℃，槽压0.5-1.0公斤/平方公分，pH值为4.5下，10-150rpm搅拌速度或不搅拌(air lift)情况，以
0.5-1.0VVM通气速率通入空气，培养3天，得蝉花菌丝体发酵液。该蝉花菌丝体发酵液经冷冻干燥可得蝉花菌丝体冻干粉。

[0060] 萃取物制备：

[0061] 1.水萃取：取蝉花菌丝体冻干粉加入20倍体积的蒸馏水溶解，以温度100℃加热三十分钟，待冷却后经冷冻干燥法进行干燥，得蝉花菌丝体水萃物。

[0062] 2.醇萃取：取蝉花菌丝体冻干粉加入20倍体积乙醇回溶，利用超声波震荡萃取一小时，萃取悬浮液离心后取上清液经减压浓缩，得蝉花菌丝体醇萃物。

[0063] 结果：20公吨发酵槽培养完毕的蝉花菌丝体发酵液经冷冻干燥后，可得约110公斤冻干粉(产率0.55％)。再经萃取步骤可得约40公斤水萃物或15公斤醇萃物。以下生物实验是以蝉花菌丝体醇萃物及水萃物进行。

[0064] 实施例2：类固醇诱导眼部病变动物模式及组织染色切片分析

[0065] 类固醇诱导病变的大鼠动物模式建立

[0066] 1.1实验动物与分组

[0067] 本实施例采用7-8周龄SD品系雄性大鼠，提供充足的饮水与饲料(5001Rodent diet,Purina Mills LLC,St.Louis,MO,USA)。动物房温度维持于22±2℃，12小时日夜交替的光照周期。

[0068] 本实施例将大鼠分为4组，分别为正常组、阴性对照组、蝉花水萃物组及蝉花醇萃物组，每组6只动物，全部以老鼠右眼进行实验。除正常组外，其余组别则于大鼠眼睛结膜下注射类固醇倍他米松(betamethasone)，为期三周，诱导眼部病变产生。观察到的眼部病变包括眼球前房、后房及玻璃体液扩张、水晶体退化及视网膜脱离等组织病变。特别注意的是，本发明所述的类固醇药物不限于betamethasone。

[0069] 1.2喂食剂量与实验步骤

[0070] 实验期间，正常组与阴性对照组不给药，蝉花水萃物组及醇萃物组分别经口每日管喂投予剂量50mg/kg bw，共喂食四周。

[0071] 试验结束时，以CO2昏迷大鼠后经腹部动脉采血，并达完全放血后牺牲，采集右眼球进行肉眼观察及组织病理观察。

[0072] 眼球各部位组织损伤程度检测

[0073] 2.1组织染色切片检测

[0074] 以CO2昏迷大鼠，后经腹部动脉放血并采集右眼球浸泡于Davidson’s Fluid(DF)组织固定液中，固定48小时后，再放入10％中性福尔马林溶液中固定一周后，进行后续的组织石蜡切片制作与病理判别。其眼球组织以石蜡包埋机(Histoembedder,Leica,German)包埋制成蜡块，再以组织切片机(Leica,RM-2145,German)切5μm厚度，并以自动染色机(Sakura model,DRS-60A)经H&E染色及阿拉伯胶封片后，再置于光学显微镜(BX51,Olympus,Tokyo,Japan)观察眼球前房、后房及玻璃体液是否扩张、水晶体退化情形及视网膜脱离程度等组织病理变化。结果列于图1-图4，其中的A组代表正常组，B组代表阴性对照组，C组代表蝉花水萃物组，D组则代表蝉花醇萃物组。

[0075] 图1为眼球前房组织的染色切片检测(放大20倍)，B组在眼球前房组织中显示适度扩张，伴有玻璃体液扩张；A、C、D组眼球前房组织均无明显病理变化。

[0076] 图2为眼球后房组织的染色切片检测(放大40倍)，B组在眼球前房组织中显示适度扩张，伴有玻璃体液扩张；A、C、D组眼球前房组织均无明显病理变化。

[0077] 图3为眼球视网膜组织的染色切片检测(放大400倍)，B组眼球视网膜组织脱离；而A、C、D组眼球视网膜组织均无明显病理变化。

[0078] 图4为眼球水晶体组织的染色切片检测(放大400倍)，B组眼球水晶体组织退化；而A、C、D组眼球水晶体组织均无明显病理变化。

[0079] 2.2眼球病理检查

[0080] 依眼球组织病变程度，可分成为1-5级：1＝最小的(<1％)；2＝轻微的(1-25％)；3＝中度(26-50％)；4＝中度/重度(51–75％)；5＝严重/高(76-100％)。依各部位组织病理检查结果建立下列病理积分表，如下表3所示，其中眼球组织包含了前房、后房、玻璃体、角膜、脉络膜、巩膜、视网膜及水晶体等。

[0081] 表3

[0082]

[0083] 1.将数值计算后以平均数±标准误差值(Mean±SD)表示(n＝6)。

[0084] 2.**p<0.01表示实验组与阴性对照组具统计差异。以单因子变异数分析(One-way ANOVA)进行组内间的比较，并以Duncan比较各组间的差异显著性。

[0085] 上述病理积分表结果显示，正常组的眼球各部位组织皆无病变。阴性对照组的眼球各部位组织皆发生病变，其中前房、后房为中度病变，积分为3；玻璃体为中度病变，积分为3，角膜为中度病变，积分为3；脉络膜和巩膜为重度病变，积分为4；视网膜为轻微病变，积分为1；水晶体为轻微病变，积分为1。蝉花水萃物组及蝉花醇萃物组眼球各部位组织皆无明显病变，与阴性对照组比较在统计上具有显著差异。

[0086] 由以上结果显示，蝉花菌丝体活性物质具有预防、延缓或治疗包括眼球前房扩张、眼球后房扩张、眼球玻璃体液扩张、视网膜脱离等眼部病变的效果，尤其是因类固醇诱导产生眼部组织病变。

[0087] 实施例2中，蝉花菌丝体活性物质是以口服方式对小鼠施用，因此该蝉花菌丝体活性物质可应用于药物、保健食品或食品添加物等相关用途。但本发明的蝉花菌丝体活性物质的施用方式不限于口服，亦可包含注射、滴剂、栓剂等形式。

[0088] 综合上述，本发明具体实施例揭露的含有蝉花菌丝体活性物质的蝉花菌丝体发酵液、蝉花菌丝体冻干粉、蝉花菌丝体水萃物及蝉花菌丝体醇萃物以及其制备的医药组合物可有效预防、延缓或治疗包括眼球前房扩张、眼球后房扩张、眼球玻璃体液扩张、视网膜脱离等眼部病变。据此，该等含蝉花菌丝体活性物质的发酵液、冻干粉、水萃物、醇萃物等，也可按照本领域的保健食品制造技术制备为预防或延缓该等眼部病变的保健食品。