花青素合成相关蛋白及其在调控植物花青素含量中的应用

摘要

本发明公开了花青素合成相关蛋白及其在调控植物花青素含量中的应用。本发明公开的花青素合成相关蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的花青素合成相关蛋白可以调控植物花青素含量，可以用来培育花青素含量增加或降低植物，也可以用来调控植物植株颜色。

权利要求

1.花青素合成相关蛋白或调控所述花青素合成相关蛋白活性或含量的物质的下述任一应用：D1)调控植物花青素含量；

D2)制备调控植物花青素含量产品；

D3)培育花青素含量增加植物；

D4)制备培育花青素含量增加植物产品；

D5)培育花青素含量降低植物；

D6)制备培育花青素含量降低植物产品；

D7)调控植物植株颜色；

D8)制备调控植物植株颜色产品；

D9)培育植株颜色改变植物；

D10)制备调控植物植株颜色产品；

所述花青素合成相关蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述花青素合成相关蛋白相关的生物材料的下述任一应用：D1)调控植物花青素含量；

D2)制备调控植物花青素含量产品；

D3)培育花青素含量增加植物；

D4)制备培育花青素含量增加植物产品；

D5)培育花青素含量降低植物；

D6)制备培育花青素含量降低植物产品；

D7)调控植物植株颜色；

D8)制备调控植物植株颜色产品；

D9)培育植株颜色改变植物；

D10)制备调控植物植株颜色产品；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：B1)编码权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低权利要求1中所述花青素合成相关蛋白表达量的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列3的第3179-6011位所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

B2)所述表达盒为如下b11)或b12)或b13)：b21)序列表中序列3所示的DNA分子；

b22)与b21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

b23)在严格条件下与b21)或b22)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

4.下述任一方法：

X1)培育花青素含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述花青素合成相关蛋白，或提高受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的活性，得到花青素含量增加的目的植物；

X2)培育花青素含量降低植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的含量，或降低受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的活性，得到花青素含量降低的目的植物；

X3)培育植株颜色改变植物的方法，包括改变受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白含量，或改变受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的活性，得到植株颜色改变的目的植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：X1)所述方法通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

X2)所述方法通过抑制所述受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的编码基因的表达实现；

X3)所述方法通过向所述受体植物中导入权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的编码基因并使所述编码基因得到表达，或抑制所述受体植物中权利要求1中所述花青素合成相关蛋白的编码基因的表达实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。

7.具有如下D1)或D2)的功能的产品，含有权利要求1中所述花青素合成相关蛋白或权利要求2或3中所述生物材料：D1)调控植物花青素含量；

D2)调控植物植株颜色。

8.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的产品，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)蒺藜苜蓿。

9.根据权利要求1-3中任一所述的应用，或权利要求4-6中任一所述的方法，或权利要求7所述的产品，或权利要求8所述的应用、方法或产品，其特征在于：所述植株颜色为叶片颜色。

10.权利要求1中所述花青素合成相关蛋白或权利要求2或3中所述生物材料。

说明书

花青素合成相关蛋白及其在调控植物花青素含量中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中，花青素合成相关蛋白及其在调控植物花青素含量中的应用。

背景技术

[0002] 花青素是广泛存在于植物中的水溶性黄酮类化合物，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一，在植物生理上发挥重要作用；同时花青素也是天然的植物抗氧化剂，能够保护植物和人体免受自由基等有害物质的损伤，对人类的健康具有诸多益处。

[0003] 蒺藜苜蓿是新兴的豆科模式植物，与大豆和紫花苜蓿等重要豆科作物和牧草具有良好的共线性。随着蒺藜苜蓿功能基因组学的深入开展，一些花青素合成途径相关基因以及MYB和WD40等家族转录因子在蒺藜苜蓿中被克隆，研究发现上述基因在蒺藜苜蓿的花青素生物合成和代谢调控中发挥重要的作用，但由于豆科植物特殊的生理结构特性，上述基因的表达模式和生物学功能与双子叶模式植物拟南芥中的研究报道存在差异，表明不同物种间花青素的合成和代谢调控途径存在遗传多样性。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种花青素合成相关蛋白及其编码基因与应用。

[0005] 本发明首先提供了花青素合成相关蛋白(名称为RH1蛋白质)或调控所述花青素合成相关蛋白活性或含量的物质的下述任一应用：

[0006] D1)调控植物花青素含量；

[0007] D2)制备调控植物花青素含量产品；

[0008] D3)培育花青素含量增加植物；

[0009] D4)制备培育花青素含量增加植物产品；

[0010] D5)培育花青素含量降低植物；

[0011] D6)制备培育花青素含量降低植物产品；

[0012] D7)调控植物植株颜色；

[0013] D8)制备调控植物植株颜色产品；

[0014] D9)培育植株颜色改变植物；

[0015] D10)制备调控植物植株颜色产品；

[0016] 所述花青素合成相关蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

[0017] A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

[0018] A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

[0019] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

[0020] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

[0021] 表：标签的序列

[0022]

[0023]

[0024] 上述A2)中的RH1蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

[0025] 上述A2)中的RH1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

[0026] 上述A2)中的RH1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的RH1蛋白质。

[0027] 本发明还提供了与所述花青素合成相关蛋白相关的生物材料的下述任一应用：

[0028] D1)调控植物花青素含量；

[0029] D2)制备调控植物花青素含量产品；

[0030] D3)培育花青素含量增加植物；

[0031] D4)制备培育花青素含量增加植物产品；

[0032] D5)培育花青素含量降低植物；

[0033] D6)制备培育花青素含量降低植物产品；

[0034] D7)调控植物植株颜色；

[0035] D8)制备调控植物植株颜色产品；

[0036] D9)培育植株颜色改变植物；

[0037] D10)制备调控植物植株颜色产品；

[0038] 所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

[0039] B1)编码所述花青素合成相关蛋白的核酸分子；

[0040] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

[0041] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

[0042] B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

[0043] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0044] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

[0045] B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

[0046] B8)降低所述花青素合成相关蛋白表达量的核酸分子；

[0047] B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

[0048] 上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

[0049] b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

[0050] b12)序列表中序列3的第3179-6011位所示的DNA分子；

[0051] b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述花青素合成相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0052] b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述花青素合成相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

[0053] B2)所述表达盒可为如下b11)或b12)或b13)：

[0054] b21)序列表中序列3所示的DNA分子；

[0055] b22)与b21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

[0056] b23)在严格条件下与b21)或b22)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

[0057] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

[0058] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码RH1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的RH1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码RH1蛋白质且具有RH1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

[0059] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

[0060] 上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，
0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0061] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

[0062] 上述应用中，B2)所述的含有编码RH1蛋白质的核酸分子的表达盒(RH1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RH1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动RH1基因转录的启动子，还可包括终止RH1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-
7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，
057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利
200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:
141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

[0063] 可用现有的表达载体构建含有所述RH1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0064] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pBI121载体或pCAMBIA2300载体。

[0065] B3)所述重组载体具体可为pCAMBIA2300-RH1pro::RH1。所述pCAMBIA2300-RH1pro::RH1为将pCAMBIA2300载体的EcoRI和PstI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA片段得到的重组载体。

[0066] B8)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低RH1含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的靶序列可为序列表中序列2的第400-419位或序列2的第175-193位。

[0067] 上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌AGL1。

[0068] 上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

[0069] 本发明还提供了下述任一方法：

[0070] X1)培育花青素含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达所述花青素合成相关蛋白，或提高受体植物中所述花青素合成相关蛋白的含量，或提高受体植物中所述花青素合成相关蛋白的活性，得到花青素含量增加的目的植物；

[0071] X2)培育花青素含量降低植物的方法，包括降低受体植物中所述花青素合成相关蛋白的含量，或降低受体植物中所述花青素合成相关蛋白的活性，得到花青素含量降低的目的植物；

[0072] X3)培育植株颜色改变植物的方法，包括改变受体植物中所述花青素合成相关蛋白含量，或改变受体植物中所述花青素合成相关蛋白的活性，得到植株颜色改变的目的植物。

[0073] 上述方法中，X1)所述方法可通过向所述受体植物中导入所述花青素合成相关蛋白的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

[0074] X2)所述方法可通过抑制所述受体植物中所述花青素合成相关蛋白的编码基因的表达实现；

[0075] X3)所述方法可通过向所述受体植物中导入所述花青素合成相关蛋白的编码基因并使所述编码基因得到表达，或抑制所述受体植物中所述花青素合成相关蛋白的编码基因的表达实现。

[0076] 上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

[0077] 上述方法中，其中所述RH1的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

[0078] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述RH1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

[0079] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

[0080] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

[0081] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

[0082] 5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

[0083] 所述RH1的编码基因可利用含有所述RH1的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA2300-RH1pro::RH1。

[0084] 所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

[0085] 所述目的植物理解为不仅包含RH1蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

[0086] 本发明还提供了具有如下D1)或D2)的功能的产品，所述产品含有所述花青素合成相关蛋白或所述生物材料：

[0087] D1)调控植物花青素含量；

[0088] D2)调控植物植株颜色。

[0089] 所述产品可以所述花青素合成相关蛋白或所述生物材料作为其活性成分，还可将所述花青素合成相关蛋白或所述生物材料与其他具有相同功能的物质一起作为其活性成分。

[0090] 本发明中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

[0091] M1)双子叶植物或单子叶植物；

[0092] M2)豆科植物；

[0093] M3)蒺藜苜蓿。

[0094] 本发明中，所述植株颜色可为叶片颜色。

[0095] 所述花青素合成相关蛋白或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

[0096] 本发明的发明人从蒺藜苜蓿中克隆出RH1基因，成功构建植物CRISPR敲除载体，采用农杆菌介导的叶盘法转化植物中将RH1基因敲除后，植物的花青素含量下降叶片的红斑消失。而将RH1基因导入野生型植物中后，花青素含量增加。表明，本发明的RH1基因与的花青素含量相关，可用于调控的花青素含量。

附图说明

[0097] 图1为蒺藜苜蓿R108野生型叶片和蒺藜苜蓿rh1红心突变体叶片表型图。

[0098] 图2为R108叶片和rh1叶片中花青素含量测定结果以及其中RH1基因表达情况。

[0099] 图3为rh1突变体经过基因组编辑得到的植株叶片表型和R108及rh1突变体基因组编辑植株的分子检测。MtRH1-1/rh1为CRISPR-1的转基因植株，MtRH2-3/rh1和MtRH2-2/rh1均为CRISPR-2的转基因植株。

[0100] 图4为转RH1基因植株的表型和RH1基因的表达水平。pRH1:RH1/R108-1和pRH1:RH1/R108-2分别为两株阳性转RH1基因植株，ox-1为pRH1:RH1/R108-1，ox-2为pRH1:RH1/R108-2。

具体实施方式

[0101] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

[0102] 蒺藜苜蓿R108(野生型)：由The Nobel Foundation提供。

[0103] rh1突变体：在The Nobel Foundation通过筛选蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库，分离获得一个花青素合成异常的突变体red heart1(rh1)，在Tnt1database(https://medicago-mutant.noble.org/mutant/index.php)中该突变体编号为NF7599，主要表现为花青素在叶片上特异性积累，呈现大红心的表型。

[0104] pFGC5941-Cas9载体记载在(Meng et al.,2017，Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9system in the model legume Medicago truncatula，Plant Cell Rep(2017)36:371–374)一文中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

[0105] YEP固体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物10g、氯化钠5g、琼脂粉10g，蒸馏水定容至1L。

[0106] YEP液体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物10g、氯化钠5g，蒸馏水定容至1L。

[0107] 愈伤诱导液体培养基(PH 5.8)：大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液20mL、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg，定容至1L。愈伤诱导固体培养基(PH 5.8)：大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液20mL、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg、Phytagel 3.2g，定容至1L。

[0108] 分化培养基(PH 5.8)：大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液20mL、肌醇100mg、蔗糖20g、头孢200mg、特美汀250mg、Phytagel 3.2g，定容至1L。

[0109] 生根培养基(PH 5.8)：Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins 2.215g/L(公司：Phyto Technology Laboratories，货号：16B0519138A)，琼脂粉7g/L。

[0110] 铁盐母液：乙二胺四乙酸二钠37.3mg、七水合硫酸亚铁27.8mg，定容至1L。

[0111] 大量元素母液：七水合硫酸镁1.85g、硝酸钾28.3g、硫酸铵4.63g、二水合氯化钙1.66g、磷酸二氢钾4g，蒸馏水定容至1L。

[0112] 微量元素母液：一水合硫酸锰1g、硼酸500mg、七水合硫酸锌100mg、碘化钾100mg、二水合钼酸纳10mg、五水合硫酸铜20mg、六水合氯化钴10mg，蒸馏水定容至1L。

[0113] 有机元素母液：烟酸500mg、盐酸硫胺素500mg、盐酸吡哆醇500mg，蒸馏水定容至1L。

[0114] 实施例1、RH1及其编码基因RH1基因的发现

[0115] 一、突变体获得及表型分析

[0116] 在The Nobel Foundation通过筛选蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库，分离获得一个花青素合成异常的突变体，该突变体在Tnt1database中的编号为NF7599，主要表现为花青素在叶片上特异性积累，呈现红心的表型，将该突变体命名为red heart1(rh1)。将该突变体与野生型蒺藜苜蓿R108杂交得到F1表现为红心变浅的中间型，F2群体分离出野生型、红心变浅中间型以及红心表型三种表型，且符合1:2:1的分离比(p＝0.754>0.05)。表明对于野生型R108，rh1突变体的红心性状由半显性单基因控制。

[0117] rh1突变体和蒺藜苜蓿R108(野生型)的叶片表型观察结果见图1。图1中，左图为野生型蒺藜苜蓿R108叶片，小叶基部有小红圈；中图为R108与rh1突变体杂交F1叶片，小红圈扩大成虚红心；右图为rh1突变体叶片，小红圈扩大成实红心。

[0118] 花青素相对含量测定：待测材料为蒺藜苜蓿R108(野生型)和rh1突变体的叶片。分析待测植株叶片中的花青素含量，步骤如下：

[0119] (1)取材：选取生长状态一致的蒺藜苜蓿R108(野生型)和rh1突变体植株，取刚展开的成熟复叶，分别称量约100mg并记录实际称量结果(FW)，将所取叶片液氮冷冻20min，研磨，置于1mL的1％(v/v)盐酸甲醇溶液(990μL甲醇与10μL盐酸组成的溶液)，振荡混匀，4℃黑暗静置1天，得到提取液。

[0120] (2)离心：将步骤(1)得到的提取液于13,000rpm离心15min，取上清液。

[0121] (3)将步骤(2)得到的上清液分别于紫外可见分光光度计上测定A530和A657。

[0122] (4)计算花青素(花青苷，Canthocyanin)相对含量＝[A530-(1/4×A657)]/FW。

[0123] 蒺藜苜蓿R108和rh1突变体的叶片相对花青素含量测定结果见图2中左图，rh1突变体的叶片中花青素相对含量极显著高于蒺藜苜蓿R108。

[0124] 二、图位克隆候选基因

[0125] 根据申请人开发的Medicago truncatula InDel分子标记，以A17(已测序获得基因组信息品种)与rh1杂交的F2进行图位克隆，定位至染色体7上，结合RNA-seq数据，找到候选基因RH1基因。检测rh1突变体和蒺藜苜蓿R108中该基因的表达量，发现与叶片花青素相对含量的趋势相一致,rh1突变体中RH1基因表达显著升高，为野生型蒺藜苜蓿R108的7倍，见图2中右图。

[0126] 推测该基因为引起rh1突变体中花青素含量和控制叶片红心表型的候选基因，记为花青素合成相关基因，简称RH1基因。检测RH1基因表达量所用引物为q40-F与q40-R，序列如下：

[0127] q40-F:5'-cctctgctGTACAACCAAGTCT-3'；

[0128] q40-R:5'-ACTGCTCCCCATGTCCCATA-3'。

[0129] 所用内参及内参的引物序列为：

[0130] qActin-F:5'-TCAATGTGCCTGCCATGTATGT-3'；

[0131] qActin-R:5'-ACTCACACCGTCACCAGAATCC-3'。

[0132] 三、RH1及其编码基因RH1的获得

[0133] 1、提取蒺藜苜蓿R108刚展开的成熟复叶的总RNA，并反转录为cDNA。

[0134] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物cacc40-CDS-F和引物40-CDS-R组成的引物对进行扩增，得到PCR扩增产物。

[0135] 40-CDS-F:5’-caccATGGCGAATACAAGCGGCGT-3’；(cacc为接头序列)[0136] 40-CDS-R:5’-TTAAAGATCTCGAAGAAATTCAA-3’。

[0137] 3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序，得到目标基因的编码区序列，其序列为序列表中序列2，编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列2所示的蛋白质命名为RH1，RH1由242个氨基酸残基组成。将RH1的编码基因命名为RH1基因。

[0138] 实施例2、RH1基因的功能验证

[0139] 一、CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

[0140] 以pMtU6-Cas(Meng et al.,2017，Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9system in the model legume Medicago truncatula，Plant Cell Rep(2017)36:371–374)为模板，利用引物对MtU6-F1与MtU6-R1进行PCR扩增，得到MtU6启动子；分别利用引物对1(由40-sgRNA-F1引物与R2引物组成)和引物对2(由40-sgRNA-F2引物与R2引物组成)进行PCR扩增，得到两段分别编码靶向目的片段的sgRNA和scaffold的DNA片段，即sgRNA1-scaffold片段和sgRNA2-scaffold片段。以MtU6启动子和sgRNA1-scaffold片段的混合物作为模板，利用引物对(由MtU6-F1与R2组成)进行PCR扩增，得到pMtU6::sgRNA1-scaffold片段；以MtU6启动子和sgRNA2-scaffold片段的混合物作为模板，利用引物对(由MtU6-F1与R2组成)进行PCR扩增，得到pMtU6::sgRNA2-scaffold片段，将这两个DNA片段重组至经XbaⅠ酶切pFGC5941-cas9载体得到的线性化的pFGC5941-cas9载体骨架上，得到重组载体。

[0141] 重组载体通过测序验证，将得到的序列正确的两个重组载体分别命名为CRISPR-1，CRISPR-2。CRISPR-1能表达Cas9以及靶向RH1基因的sgRNA1，sgRNA1的靶标序列为GATGATAAAGTTATAGGCCG(序列表中序列2的第400-419位)，CRISPR-2能表达Cas9以及靶向RH1基因的sgRNA2，sgRNA2的靶标序列为AATTCTCCCGGTTGATGTA(序列表中序列2的第175-
193位)。所用引物为如下：

[0142] MtU6-F1:5'-gcttaggccttctagaATCCAACATTTCACTTGAGTTAACT-3'；

[0143] MtU6-R1:5'-AAACCCTGCTGTTCGTCTAG-3'；

[0144] 40-sgRNA-F1：

[0145] 5’-CTAGACGAACAGCAGGGTTTGATGATAAAGTTATAGGCCGgttttagagctagaaatag-3’；

[0146] 40-sgRNA-F2：

[0147] 5’-CTAGACGAACAGCAGGGTTTgAATTCTCCCGGTTGATGTAgttttagagctagaaatag-3’；

[0148] R2：5’-GGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGC-3’。

[0149] 二、CRISPR/Cas9基因组编辑植株的获得

[0150] 1、将步骤一制备的重组载体CRISPR-1和CRISPR-2分别转化农杆菌AGL1，分别得到重组菌AGL1/CRISPR-1和AGL1/CRISPR-2。

[0151] 2、将步骤1得到的重组菌AGL1/CRISPR-1和AGL1/CRISPR-2分别接种于含有50mg/mL的利福平抗生素和50mg/mL的卡那抗生素的YEP固体培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑取单菌落至含有50mg/L的利福平抗生素和50mg/L的卡那抗生素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜。

[0152] 3、完成步骤2后，取500μL菌液接种于5mL含有25mg/L的利福平抗生素和50mg/L的卡那抗生素的YEP液体培养基中，再加入5μL 100mg/mL的乙酰丁香酮，28℃、200rpm振荡培养至OD600nm＝0.8，3800rpm离心菌液15min收集菌体。

[0153] 4、采用含有100mg/L的乙酰丁香酮的愈伤诱导液体培养基重悬步骤3得到的菌体，调菌液OD600nm＝0.2，得到侵染液。

[0154] 5、取生长4周左右rh1突变体第一片复叶，用75％乙醇水溶液漂洗约10s，再用5％次氯酸钠消毒5min，在超净台用无菌水至少洗5次，切割叶片后放到步骤4得到的侵染液中，侵染15min。

[0155] 6、完成步骤5后，将侵染后的叶片转移到愈伤诱导固体培养基上，每1L培养基中加入草胺磷2mg进行抗生素筛选，培养四周至出现白色胚性愈伤组织(两周更换一次培养基)。

[0156] 7、完成步骤6后，将白色胚性愈伤组织转移到分化培养基上，每1L培养基中加入草胺磷2mg进行抗生素筛选，培养四周至分化出绿色胚状体(两周更换一次培养基)。

[0157] 8、完成步骤7后，将绿色胚状体转移到生根培养基上，两周更换一次培养基，生根长叶后移至蛭石中，直至成苗，分别得到CRISPR-1和CRISPR-2的转基因植株。

[0158] 三、CRISPR/Cas9基因组编辑植株的表型和基因型确定

[0159] 待测植株：蒺藜苜蓿rh1突变体、CRISPR-1的转基因植株、CRISPR-2的转基因植株以及野生型蒺藜苜蓿R108。

[0160] 1、观察待测植株展开复叶表型。结果如图3所示。结果表明，rh1突变体经过基因组编辑植株的叶片由rh1突变体的大红心消失，小叶基部无红圈，或，红心变小。

[0161] 2、花青素相对含量检测：按照实施例1中步骤一中花青素相对含量测定方法检测各待测植株的花青素相对含量。结果显示，蒺藜苜蓿rh1突变体的花青素相对含量均显著高于CRISPR-1的转基因植株、CRISPR-2的转基因植株以及野生型蒺藜苜蓿R108。

[0162] 3、提取大红心消失或变小的转基因植株的基因组DNA，采用40-cas-JD-F和40-cas-JD-R引物对进行PCR扩增，对得到的PCR产物测序。40-cas-JD-F和40-cas-JD-R引物序列：

[0163] 40-cas-JD-F:5’-GCCTTTATGCGTCACCTATCT-3’；

[0164] 40-cas-JD-R:5’-CTCCCCATGTCCCATAAACTG-3’。

[0165] 通过与RH1基因的基因组序列比对，结果如图3所示，发现不同的株系确实存在不同的基因组序列缺失，结果表明，CRISPR/Cas9基因组编辑植株RH1基因检测呈阳性。

[0166] 通过检测RH1基因在rh1突变体、野生型蒺藜苜蓿R108、CRISPR-1的转基因植株、CRISPR-2的转基因植株中的表达量发现，RH1基因在rh1突变体中的表达量显著高于野生型蒺藜苜蓿R108。检测RH1基因表达量所用引物及所用内参基因同实施例1。

[0167] 通过观察表型，发现rh1突变体经过基因组编辑得到的纯合子植株的叶片由rh1突变体的大红心消失，小叶基部无红圈，rh1突变体经过基因组编辑得到的杂合子植株红心变小；纯合子植株花青素相对含量显著低于杂合子植株、蒺藜苜蓿rh1突变体，杂合子植株花青素相对含量显著低于蒺藜苜蓿rh1突变体。上述实验表明，RH1基因可以提高蒺藜苜蓿的花青素含量。

[0168] 实施例3、转RH1基因的蒺藜苜蓿花青素含量升高

[0169] 本实施例通过向野生型蒺藜苜蓿R108中导入RH1基因以进一步说明RH1基因可以提高蒺藜苜蓿的花青素含量，具体方法如下：

[0170] 一、重组载体的构建

[0171] 以突变体rh1的基因组DNA为模板，以引物对40-PRO-EcoRI-F和40-3'UTR-PstI-R进行PCR扩增，得到序列表的序列3所示的DNA片段；将pCAMBIA2300的EcoRI和PstI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA片段，将得到的重组载体命名为pCAMBIA2300-RH1pro::RH1。pCAMBIA2300-RH1pro::RH1能表达序列表中序列1所示的蛋白质。所用引物序列为：

[0172] 40-PRO-EcoRI-F:5'-ccatgattacgaattcACTCGTATGTGGGGATTTTGA-3'；

[0173] 40-3'UTR-PstI-R:5'-ttgtatatcactgcagTCTTTCTTTTCCACTGCATTGC-3'。

[0174] 其中，序列3的第1-3178位为RH1基因上游启动RH1基因表达的序列，第3179-6011位为RH1基因的基因组序列，第6012-7654位为RH1基因下游终止RH1基因表达的序列。RH1基因的基因组序列中外显子序列分别为序列3的第3179-3296位、第5254-5383位和第5534-6011位。

[0175] 二、转基因植株的构建

[0176] 按照实施例2中步骤二的方法，将CRISPR-1和CRISPR-2替换为pCAMBIA2300-RH1pro::RH1，并将rh1突变体替换为野生型蒺藜苜蓿R108，其他步骤均不变，制备转RH1基因植株。将转RH1基因植株在利用愈伤诱导固体培养基和分化培养基，每1L培养基中加入卡那霉素50mg进行筛选，得到阳性转RH1基因植株。

[0177] 三、转基因植株的鉴定

[0178] 将步骤二得到的阳性转RH1基因植株在RNA水平上进行鉴定，利用野生型蒺藜苜蓿R108作为对照，方法如下：

[0179] 按照实施例2中检测RH1基因表达量的方法检测阳性转RH1基因植株中RH1基因的表达量，结果显示，阳性转RH1基因植株中RH1基因的表达量相对于野生型蒺藜苜蓿R108显著增加，其中两株阳性转RH1基因植株中RH1基因的表达量分别为野生型蒺藜苜蓿R108的835和1172倍。

[0180] 四、转基因植株表型的鉴定

[0181] 1、阳性转RH1基因植株全株由绿变紫，叶片基部比边缘色深。

[0182] 2、花青素相对含量检测：按照实施例1中步骤一中花青素相对含量测定方法以及RH1基因表达水平检测方法分别检测步骤三中阳性转RH1基因植株的花青素相对含量以及RH1基因表达水平，利用野生型蒺藜苜蓿R108和rh1突变体作为对照。

[0183] 结果显示，rh1突变体的花青素相对含量显著高于野生型蒺藜苜蓿R108，阳性转RH1基因植株的花青素相对含量均分别显著高于野生型蒺藜苜蓿R108以及rh1突变体。RH1基因表达水平在这几种植株中具有相同的变化趋势。表明，RH1基因可以提高蒺藜苜蓿的花青素含量。