提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物产量的方法

摘要

本发明涉及提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物产量的方法。本发明中，确定了以其基因组中A1和/或A2-R两段基因簇作为重组克隆的靶标，在菌株中重组表达该两段基因簇，使得米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量呈现极为显著的提高。本发明还提供了遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌及其应用。

权利要求

1.一种提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中，引入：

(1)A1基因簇，和/或

(2)A2-R基因簇或其变体，所述变体中milF基因被下调。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的米尔贝霉素A3/A4的衍生物为5-酮-米尔贝霉素A3/A4。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A1基因簇包括milA1基因；或所述的A2-R基因簇包括milA2、milC、milE、milA4、sbi_00730、milF、sbi_00732、milA3、milR基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A1基因簇为：(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列互补的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列的同源性≥85％的多核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A2-R基因簇为：(a)SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列互补的多核苷酸；或(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列的同源性≥85％的多核苷酸。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分别获取(1)和(2)的两种基因簇以及分别引入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中；较佳地，将(1)和(2)同时转入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中，或分别获取(1)和(2)的两种基因簇、拼接后转入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中；更佳地，分别获取(1)和(2)的两种基因簇、分别转入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中，之后通过接合转移的方式，获得同时携带(1)和(2)的两种基因簇的生产菌。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌包括：链霉菌(Streptomyces)；较佳地为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的(1)和/或(2)整合到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌的ΦC31 attB或ΦBT1 attB位点。

9.一种遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，其特征在于，该菌株中，引入了：(1)A1基因簇，和/或

(2)A2-R基因簇或其变体，所述变体中milF基因被下调。

10.如权利要求9所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，其特征在于，所述的A1基因簇包括milA1基因；或所述的A2-R基因簇包括milA2、milC、milE、milA4、sbi_00730、milF、sbi_00732、milA3、milR基因。

11.如权利要求9所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，其特征在于，所述的A1基因簇为：(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列互补的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列的同源性≥85％多核苷酸。

12.如权利要求9所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，其特征在于，所述的A2-R基因簇为：(a)SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列互补的多核苷酸；或(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列的同源性≥85％的多核苷酸。

13.如权利要求9所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，其特征在于，所述的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌包括：链霉菌(Streptomyces)；较佳地为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

14.权利要求9～13任一所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌的用途，用于生产米尔贝霉素A3/A4或其衍生物。

15.一种用于生产米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求9～13任一所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌。

说明书

提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物产量的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工领域，更具体地，本发明涉及一种提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物产量的方法。

背景技术

[0002] 米尔贝霉素A3/A4是阿维菌素的结构类似物，同属于十六元环大环内酯的聚酮类化合物，分子式为C31H44O7/C32H46O7，其化学结构式如下：

[0003]

[0004] 由于米尔贝霉素A3/A4活性高效、毒副作用低、安全可靠、易降解、以及它们在驱线虫和除杀体内外寄生虫均有优良的效果，因而被广泛应用于抗寄生虫药，其应用价值和研究前景越来越受到世界的关注。

[0005] 5-酮-米尔贝霉素(5-oxomilbemycin)A3/A4是化学法合成米尔贝肟(5-oximilbemycin)A3/A4的前体化合物，其分子式为C31H42O7/C32H44O7，化学结构式如下式左侧化合物：

[0006]

[0007] 米尔贝肟(化学结构式如上式右侧化合物)是5-酮-米尔贝霉素A3/A4与羟胺发生肟化反应后的衍生物(化学反应式如上式)，其分子式为C31H43NO7/C32H45NO7。米尔贝肟主要用于防治宠物猫犬的体内外寄生虫，其杀虫活性高、毒性低。

[0008] 目前，米尔贝霉素主要是通过微生物发酵，然后再从发酵液中分离提取得到，但是其效价比较低，因此该抗生素的市场价格偏高，不利于其大规模应用。虽然传统的诱变筛选方法可以在一定程度上提高其效价，但是其机理并不清楚，不能为下一步的菌种改造提供理性化的思路。米尔贝肟的合成主要依靠两步化学合成法：

[0009]

[0010] 该两步化学合成法包括：先用CrO3将米尔贝霉素A3/A4氧化为5-酮-米尔贝霉素A3/A4，然后再与盐酸羟胺反应生成米尔贝肟。该合成过程不仅转化效率低，而且对环境不友好，存在重金属(Cr)污染。因此，5-酮-米尔贝霉素A3/A4作为化学中间体，提高其效价意义重大。

[0011] 综上，本领域需要进一步开发和改进提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物如5-酮-米尔贝霉素A3/A4的产量的方法，以期改变其产量低下、价格高昂的现状。

发明内容

[0012] 本发明的目的在于提供提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物产量的方法。

[0013] 在本发明的第一方面，提供一种提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量的方法，所述方法包括：在米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中，引入：(1)A1基因簇，和/或(2)A2-R基因簇或其变体，所述变体中milF基因被下调。

[0014] 在一个优选例中，所述的米尔贝霉素A3/A4的衍生物为5-酮-米尔贝霉素A3/A4。

[0015] 在另一优选例中，所述的A1基因簇包括milA1基因；或所述的A2-R基因簇包括milA2、milC、milE、milA4、sbi_00730、milF、sbi_00732、milA3、milR基因。

[0016] 在另一优选例中，所述的A1基因簇为：(a)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列互补的多核苷酸；(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列的同源性≥85％(较佳地≥90；更佳地≥95％；如≥98％，≥99％)的多核苷酸(较佳地，其来自于链霉菌)。

[0017] 在另一优选例中，所述的A2-R基因簇为：(a)SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列互补的多核苷酸；或(c)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列的同源性≥85％(较佳地≥90；更佳地≥95％；如≥98％，≥99％)的多核苷酸(较佳地，其来自于链霉菌)。

[0018] 在另一优选例中，分别获取(1)和(2)的两种基因簇以及-分别引入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中；较佳地，将(1)和(2)同时转入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中，或分别获取(1)和(2)的两种基因簇、拼接后转入到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中。

[0019] 在另一优选例中，所述的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌包括：链霉菌(Streptomyces)；较佳地为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

[0020] 在另一优选例中，所述的(1)和/或(2)整合到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌的ΦC31 attB或ΦBT1 attB位点。

[0021] 在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，该菌株中引入了：(1)A1基因簇，和/或(2)A2-R基因簇或其变体，所述变体中milF基因被下调。

[0022] 在一个优选例中，所述的A1基因簇包括milA1基因；或，所述的A2-R基因簇包括milA2、milC、milE、milA4、sbi_00730、milF、sbi_00732、milA3、milR基因。

[0023] 在本发明的另一方面，提供所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌的用途，用于生产米尔贝霉素A3/A4或其衍生物。

[0024] 在本发明的另一方面，提供一种用于生产米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的试剂盒，所述试剂盒中包括前面任一所述的遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌。

[0025] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0026] 图1、本发明的用于进行米尔贝霉素(A)和5-酮-米尔贝霉素(B)生物合成的基因簇的示意图。

[0027] 图2、含基因簇质粒整合原理图，以pCAP-milA1质粒的整合为例。

[0028] 图3、质粒pCAP-milA1的图谱。

[0029] 图4、质粒pCAP-milA2-R的图谱。

[0030] 图5、质粒pCAP-milA2-ΔF-R的图谱。

[0031] 图6、质粒pBTK-milA1的图谱。

[0032] 图7、质粒BAC-mb的图谱。

[0033] 图8、质粒BAC-05的图谱。

具体实施方式

[0034] 针对现有技术中米尔贝霉素A3/A4生产菌株产量较低的缺陷，本发明人经过对米尔贝霉素生产菌株的基因组的深入分析，确定了以其基因组中A1和/或A2-R两段基因簇作为重组克隆的靶标，在菌株中重组表达该两段基因簇，使得米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量呈现极为显著的提高。

[0035] 如本文所用，术语“引入”或“转化”是指将外源多核苷酸转移进宿主细胞(本发明中为链霉菌)。可选地，外源多核苷酸可以整合进入宿主基因组。

[0036] 如本文所用，“外源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物体(本发明中为链霉菌)基因组中的基因或蛋白。通常，“外源的”基因或蛋白通过基因工程重组技术被引入到生物体中。

[0037] 如本文所用，所述的“米尔贝霉素A3/A4的衍生物”是指母核结构与米尔贝霉素A3/A4相同的、且也能由本发明构建的重组生产菌生产的化合物，例如5-酮-米尔贝霉素A3/A4。

[0038] 如本文所用，所述的“milF基因被下调”包括了“milF基因被抑制”、“milF基因被敲除”、“milF基因被干扰”的情形。

[0039] 基因簇

[0040] 本发明中，将A1和A2-R两段基因簇作为重组克隆的靶标，在菌株中重组表达该两段基因簇，使得米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量呈现极为显著的提高。在研究之初，本发明人发现将多种米尔贝霉素A3/A4生产相关基因相对较多，同时克隆入生产菌株是非常困难的，极大地增加了菌株的负担，难以被菌株接受。为了克服这一问题，本发明人经过反复研究和试验，将相关基因划分为A1和A2-R两段，分别克隆，之后再通过接合转移的方法加以合并，构建获得理想的菌株。这一恰到好处的基因划分方式使得高产菌株的构建得以成功。

[0041] 本发明中，所述的A1基因簇可以具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或其简并序列。

[0042] 所述的A2-R基因簇可以具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或其简并序列。本发明中的基因簇优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

[0043] 所述的A2-R基因簇可以是SEQ ID NO:2基础上经改造的核苷酸序列或其简并的序列，所述的改造可以发生在该基因簇的milF基因，将该基因下调后，可以使得本发明的生产菌的产物为5-酮-米尔贝霉素A3/A4。作为本发明的优选方式，经过该种改造的基因簇称为A2-ΔF-R；较佳地，其具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列或其简并序列。

[0044] 所述的基因簇中，也可以包含一个或多个基因的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。但是，所述的变异体不会从实质上改变其编码的多肽的功能，仍然能够实现本发明的技术效果。

[0045] 所述的基因簇的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自微生物。此外，其中的一个或多个基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程技术来扩增相关基因，或通过人工合成的手段来制备相关基因，再连接形成基因簇。

[0046] 所述的基因簇或其中的基因或片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0047] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

[0048] 在了解了本发明的新发现后，本领域技术人员还可对所述的基因簇或其中的基因或片段进行各种已知的改造，例如可以进行密码子优化或定点突变，以进一步提高表达效率。

[0049] 在获得了A1和/或A2-R和/或A2-ΔF-R基因簇之后，将其连入合适的表达构建物(如表达载体)中，再引入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，获得宿主细胞的代谢产物米尔贝霉素A3/A4或其衍生物。

[0050] 所述的表达构建物可包括A1和/或A2-R和/或A2-ΔF-R基因簇，还包含与所述基因的序列操作性相连的其它功能性序列，以便于进入到宿主细胞以及实现基因的定点整合。所述的功能性序列中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的表达以及代谢产物生产，有利于工业化应用。针对原核细胞或真核细胞，本领域已知适合的表达载体是哪些，因此人们能够选择到合适的表达载体作为克隆编码基因的骨架载体，在链霉菌中常用的合适表达载体为pSET152、pIB139、pRT802和BAC-F15等。

[0051] 米尔贝霉素生产菌

[0052] 本发明还包括遗传工程化的米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌，其中引入了：A1基因簇，和/或A2-R基因簇，和/或A2-ΔF-R基因簇。

[0053] 本发明所述改造的出发菌株为链霉菌(Streptomyces)；较佳地为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

[0054] 所述的链霉菌或吸水链霉菌可以是天然菌株，也可以是在天然菌株基础上进行突变或改造后的菌株。在本发明的优选实施例中，采用了米尔贝霉素A3/A4产生菌Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739和5-酮-米尔贝霉素A3/A4产生菌Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF。

[0055] 在本发明的优选实施方式中，提供了多个与米尔贝霉素(5-酮-米尔贝霉素)A3/A4产量相关的质粒，并开发了多株高效生产米尔贝霉素A3/A4的微生物菌株和多株高效生产5-酮-米尔贝霉素A3/A4的微生物菌株。

[0056] 在本发明的具体的优选实施例中，本发明利用分子生物学的方法构建了多个质粒pCAP-milA1、pCAP-milA2-R、pBTK-milA1、pCAP-milA2-ΔF-R、BAC-mb和BAC-05，并分别将这几个质粒导入Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739和Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF菌株中。

[0057] 在本发明的具体的优选实施例中，利用pCAP01a质粒通过TAR的方法来构建pCAP-milA1、pCAP-milA2-R和pCAP-milA2-ΔF-R质粒，进而将pCAP-milA1中的ΦC31int/attP、aac(3)IV替换为ΦBT1int/attP、aph(3)II元件得到质粒pBTK-milA1。同时利用BAC-F15质粒分别将A1和A2-R以及A1和A2-ΔF-R拼接起来，得到含有完整的基因簇的质粒BAC-mb和含有完整的5-酮-米尔贝霉素生物合成基因簇的质粒BAC-05。

[0058] 在本发明的特别优选的实施例中，通过接合转移的方法将pCAP-milA1和pCAP-milA2-R分别导入Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739的ΦC31 attB位点，得到工程菌株SIPI-054-001和SIPI-054-002；将pBTK-milA1导入SIPI-054-002的ΦBT1 attB位点后得到工程菌株SIPI-054-003；将BAC-mb导入Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739中得到工程菌株SIPI-054-004。同样，将pCAP-milA1和pCAP-milA2-ΔF-R分别导入Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF的ΦC31 attB位点，得到工程菌株SIPI-KF101和SIPI-KF102，将pBTK-milA1导入SIPI-KF102的ΦBT1 attB位点后得到工程菌株SIPI-KF103；将BAC-05导入Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF中得到工程菌株SIPI-KF201。将基因簇整合至Streptomyces hygroscopicus菌株基因组DNA中的示意图如图2所示。

[0059] 米尔贝霉素生产方法

[0060] 本发明人致力于提高米尔贝霉素生产菌株的生产效率，作了广泛地研究。在前期工作中，发现与生产米尔贝霉素A3/A4相关的基因较多、基因簇很大，不利于克隆及重组表达，无法实现有效的提高。进一步地，经过反复调整和优化，确定了以其基因组中A1和/或A2-R两段基因簇作为重组克隆的靶标，在菌株中分别重组表达该两段基因簇，或者先分别克隆后再行在同一菌株中共表达，有效地实现了米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量提高，且这种提高是非常显著的。

[0061] 因此，本发明提供了一种提高米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的产量的方法，所述方法包括：在米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌中，引入：(1)A1基因簇，和/或(2)A2-R基因簇或其变体，所述变体中milF基因被下调。

[0062] 作为本发明的优选实施方式，所述的(1)和/或(2)整合到米尔贝霉素A3/A4或其衍生物的生产菌的ΦC31 attB或ΦBT1 attB位点。

[0063] 在本发明的具体实施例中，通过在Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739中分别表达米尔贝霉素合成基因簇A1或A2-R，使米尔贝霉素A3/A4的总产量分别提高约42.1％和48.3％；将A1和A2-R同时表达可使其总产量比出发菌株NRRL5739提高约98.4％；将质粒BAC-mb在NRRL 5739中表达后，其总产量比出发菌株提高约102.3％。同样在5-酮-米尔贝霉素A3/A4产生菌株Streptomyceshygroscopicus SIPI-KF中分别表达A1和A2-ΔF-R，可使5-酮-米尔贝霉素A3/A4的总产量分别提高约69.0％和78.5％；同时表达A1和A2-ΔF-R可使5-酮-米尔贝霉素A3/A4的总产量提高约104.9％；将携带完整的5-酮-米尔贝霉素生物合成基因簇的质粒BAC-05在SIPI-KF中表达后，其5-酮-米尔贝霉素A3/A4总产量提高约98.2％。上述结果显示，本发明的方法可明显提高其目标产物的产量。

[0064] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0065] 菌株、质粒、试剂和仪器

[0066] 吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739：购于NRRL。

[0067] 5-酮-米尔贝霉素A3/A4产生菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF为对Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739的milF基因进行敲除后得到，其构建方法参考Appl Microbiol Biotechnol(2014)98:9703-9712。

[0068] 用于TAR的S.cerevisiae VL6-48来自于：ATCC MYA-366。

[0069] 用于接合转移的Escherichia coli S17-1：商业化的大肠杆菌细胞(购于Gibco-BRL公司)。

[0070] EPI300感受态细胞：购自Epicentre公司。

[0071] 本发明中用于TAR的pCAP01a构建：在pCAP01质粒上修改后得到，具体构建步骤如下：以pSET152质粒为模板，用152-fw/rv引物PCR扩增出含有ΦC31int/attP、acc(3)IV元件的DNA片段C31-acc(4605bp)；然后以pKCCas9(tipAp)质粒为模板，利用gRNA-up-fw/gRNA-rv和gRNA-dn-fw/gRNA-rv两对引物分别PCR扩增出gRNA-up和gRNA-dn的DNA模板，再利用体外转录试剂盒将两者分别转录为对应的RNA，然后利用Cas9体外酶切试剂盒对pCAP01质粒进行切割，并醇沉回收；最后利用重组试剂盒将C31-acc片段与经Cas9切过的pCAP01质粒进行连接，即可得到质粒pCA01a。

[0072] 其中pSET152质粒的构建参考文献：BIERMAN M,LOGAN R,O'BRIEN K,et al.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp[J].Gene,1992,116(1):43-9.

[0073] pCAP01质粒的构建参考文献：YAMANAKA K,REYNOLDS K A,KERSTEN R D,et al.Direct cloning and refactoring of a silent lipopeptide biosynthetic gene cluster yields the antibiotic taromycin A[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(5):1957-62.

[0074] 所用引物序列为：

[0075] 152-fw：GACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATCCGCGCCTTGAACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGT(SEQ ID NO:4)；

[0076] 152-rv：AGATCAGGCTTCCCGGGTGTCTCGCTACGCCGCTACAGGCTTCCCGGGTGTCTCGCTA(SEQ ID NO:5)；

[0077] gRNA-up-fw：GACTGACACTGATAATACGACTCACTATAGGGCATCCGCGCCTTGAGCCGTTTTAGAGCTAGAAATA(SEQ ID NO:6)；

[0078] gRNA-dn-fw：GACTGACACTGATAATACGACTCACTATAGGACGGCACGGAAGACGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATA(SEQ ID NO:7)；

[0079] 用于拼接的BAC-F15质粒：参考文献：LI L等，Metabolic engineering,2015,29:12-25)。

[0080] 用于做PCR模板的pRT802参考文献：Gregory MA等，J Bacteriol 2003；185:5320-5323。

[0081] 用于做PCR模板的pKCCas9(tipAp)质粒参考文献：HUANG H等，Acta biochimica et biophysica Sinica,2015,47(4):231-43。

[0082] DNA胶回收纯化试剂盒购自Axygen公司，质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司，所有限制性内切酶都购自Thermo Fisher Scientific公司，体外转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，Cas9体外酶切试剂盒购自TOLOBIO公司，重组连接试剂盒购自Vazyme公司，色谱纯的乙腈购自Amethyst Chemicals公司，其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装。

[0083] 恒温发酵摇床购自上海世平实验设备有限公司，1200型高效液相色谱仪购自Agilent Technologies公司。

[0084] 培养基

[0085] 1.液体LB培养基(1L)

[0086] 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；121℃灭菌20分钟。

[0087] 2.固体LB培养基(1L)

[0088] 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉20g；121℃灭菌20分钟。

[0089] 3.固体M-Isp4培养基配方(1L)

[0090] 黄豆饼粉5g，甘露醇5g，淀粉5g，蛋白胨2g，酵母粉1g，NaCl 1g，(NH4)2SO4 2g,K2HPO3 1g,CaCO3 2g,琼脂粉20g，无机盐微量元素溶液1mL，pH调至7.0；121℃灭菌20分钟。

[0091] 4.液体2×YT培养基配方(1L)

[0092] 蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g；121℃灭菌20分钟。

[0093] 5.MB固体培养基配方(1L)

[0094] 蔗糖4g，酵母浸粉2g，脱脂奶粉1g，琼脂粉20g，pH调至7.2；121℃灭菌20分钟。

[0095] 6.种子培养基配方(1L)

[0096] 蔗糖20g，酵母浸粉5g，脱脂奶粉1g，K2HPO4 1g，pH调至7.2；121℃灭菌20分钟。

[0097] 7.发酵培养基配方(1L)

[0098] 蔗糖120g，脱脂奶粉10g，棉籽饼粉10g，K2HPO4 1g，FeSO4·7H2O 0.1g，CaCO3 3g，pH调至7.2；121℃灭菌20分钟。

[0099] 8.酵母选择培养基(1L)

[0100] Yeast Nitrogen Base without amino acids 1.7g，Yeast synthetic drop-out medium supplements 1.9g，山梨醇182g，D-葡萄糖20g，硫酸铵5g，琼脂粉2g，115℃灭菌15min。

[0101] 9.YPD培养基(1L)

[0102] D-葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，硫酸腺嘌呤0.8g，115℃灭菌15min。

[0103] 引物

[0104] 本发明中使用的引物如表1。

[0105] 表1

[0106]

[0107]

[0108]

[0109] 实施例1、pCAP-milA1、pCAP-milA2-R和pCAP-milA2-ΔF-R三个质粒的构建[0110] 本发明人经过对米尔贝霉素生产菌株的基因组的深入分析和比较，确定了以其基因组中A1和A2-R两个基因簇作为重组克隆的靶标，所述基因簇示意图如图1。其中，图1A用于生产米尔贝霉素；图1B中缺失了milF基因，用于生产5-酮-米尔贝霉素。

[0111] 本实施例中，用CRISPR-TAR的方法对米尔贝霉素(5-酮-米尔贝霉素)A3/A4的生物合成基因簇进行克隆，从而构建三个包含基因簇序列的质粒pCAP-milA1、pCAP-milA2-R和pCAP-milA2-ΔF-R。

[0112] 首先需要在pCAP01a质粒基础上构建用于克隆A1基因簇(SEQ ID NO:1)的捕获质粒pCAP-milA1-UD和用于克隆A2-R(SEQ ID NO:2)和A2-ΔF-R(将SEQ ID NO:2中第36144-36752位的609bp进行了缺失)两段基因簇的捕获质粒pCAP-milA2-R-UD。以Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739的基因组为模板，利用A1-up-fw/rv、A1-down-fw/rv、A2-R-up-fw/rv和A2-R-down-fw/rv四对引物分别PCR扩增出A1-up(1804bp)、A1-down(1826bp)、A2-R-up(1196bp)和A2-R-down(1665bp)四条同源臂，再分别用overlap PCR将A1-up和A1-down连接起来、将A2-R-up和A2-R-down连接起来。最后将两个overlap PCR产物分别与KpnI/SpeI酶切过的pCAP01a质粒通过重组连接起来，即可得到pCAP-milA1-UD和pCAP-milA2-R-UD。最后利用NdeI分别对这两个捕获质粒进行酶切，通过胶回收后即可得到线性化的捕获质粒，待用。

[0113] 参考文献Nucleic Acids Res,2015,43(8):e55中报道的CRISPR-TAR方法，并利用上述线性化的pCAP-milA1-UD和pCAP-milA2-R-UD分别克隆Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739中的A1和A2-R两段基因簇，得到质粒pCAP-milA1(图3)和pCAP-milA2-R(图4)。

[0114] 同时，用线性化的pCAP-milA2-R-UD克隆Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF中的A2-ΔF-R基因簇，得到质粒pCAP-milA2-ΔF-R(图5)。

[0115] 实施例2、pBTK-milA1质粒的构建

[0116] 将pCAP-milA1中的ΦC31 int/attP、aac(3)IV替换为ΦBT1 int/attP、aph(3)II元件即可得到质粒pBTK-milA1(图6)。

[0117] 具体操作步骤如下：以pRT802质粒为模板，用BT-fw/rv引物PCR扩增出含有ΦBT1 int/attP、aph(3)II元件的DNA片段BT(3603bp)；然后以pKCCas9(tipAp)质粒为模板，分别利用gRNA1-fw/gRNA-rv和gRNA2-fw/gRNA-rv两对引物分别PCR扩增出gRNA1和gRNA2的DNA模板，再利用体外转录试剂盒将两者分别转录为对应的RNA，然后利用Cas9体外酶切试剂盒对pCAP-milA1质粒进行切割，并醇沉回收；最后利用重组试剂盒将BT片段与经Cas9切过的pCAP-milA1质粒进行连接，即可得到质粒pBTK-milA1。

[0118] 实施例3、Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-001工程菌株的构建[0119] 将pCAP-milA1质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和安普霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到A1基因簇过表达菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-001。质粒进入细胞后，在基因组中发生整合的示意图如图2。

[0120] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-001菌株的米尔贝霉素A3/A4生产能力，将其接种于25ml种子培养基中，28℃，240rpm，培养1-2天，按4％接种量接种到25ml发酵培养基中，28℃，240rpm，培养14天。取发酵样品于EP管中，同时加入三倍体积的无水乙醇，超声萃取30min，12000rpm离心5min，取上清液用HPLC来测定米尔贝霉素A3/A4的含量。HPLC条件如下：色谱柱为Hypersil-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈/水(体积比73:27)，流速1.2mL/min，柱温30℃，紫外检测波长240nm，进样量10μl。

[0121] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-001菌株的米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739提高了约42.1％。

[0122] 实施例4、Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-002工程菌株的构建[0123] 将pCAP-milA2-R质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和安普霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到A2-R基因簇过表达菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-002。

[0124] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-002菌株的米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0125] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-002菌株的米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739提高了约48.3％。

[0126] 实施例5、Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-003工程菌株的构建[0127] 将pBTK-milA1质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-002菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和卡那霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到A1和A2-R两段基因簇同时过表达的菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-003。

[0128] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-003菌株的米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和实施例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0129] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-003菌株的米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739提高了约98.4％。

[0130] 实施例6、Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF101工程菌株的构建[0131] 将pCAP-milA1质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和安普霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到A1基因簇过表达菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF101。

[0132] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF101菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和实施例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0133] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF101菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF提高了约69.0％。

[0134] 实施例7、Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF102工程菌株的构建[0135] 将pCAP-milA2-ΔF-R质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和安普霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到A2-ΔF-R基因簇过表达菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF102。

[0136] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF102菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和实施例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0137] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF102菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF提高了约78.5％。

[0138] 实施例8、Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF103工程菌株的构建[0139] 将pBTK-milA1质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF102菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和卡那霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到A1和A2-ΔF-R两段基因簇同时过表达的菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF103。

[0140] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF103菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和实施例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0141] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF103菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF提高了约104.9％。

[0142] 实施例9、BAC-mb和BAC-05质粒的构建

[0143] 为了将A2-R和A1这两段基因簇合并至一个质粒载体上，本发明人利用BAC-F15质粒将两者进行拼接。具体操作步骤如下：以pCAP01a为模板，利用yeast-fw/rv引物PCR扩增出色氨酸筛选标记和CEN酵母元件，利用重组试剂盒将其与EcoRI酶切过的BAC-F15质粒进行连接，得到可在酵母中进行复制的质粒BAC-01；以pCAP-milA1为模板，利用BAC-A1-up-fw/rv和BAC-A1-dn-fw/rv两对引物PCR分别扩增出A1基因簇的两条同源臂，再通过overlap PCR连接起来，然后利用重组试剂盒将其与BamHI酶切过的BAC-01质粒进行连接，得到含有A1基因簇同源臂的质粒BAC-02；以Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF基因组DNA为模板，利用BAC-A2-R-up-fw/rv和BAC-A2-R-dn-fw/rv两对引物PCR分别扩增出A2-R基因簇的两条同源臂，通过overlap PCR连接起来，然后利用重组试剂盒将其与EcoRI/PmeI酶切过的BAC-02质粒进行连接，得到同时含有A1和A2-R基因簇两对同源臂的质粒BAC-03；利用BamHI酶切BAC-03质粒使其线性化，同时用SpeI/XbaI酶切pCAP-milA1后通过胶回收的方法回收约13kb的A1基因簇，将两者通过TAR实验进行连接，得到含有A1基因簇的质粒BAC-04；用PmeI酶切BAC-04质粒使其线性化，用CRISPR-Cas9切割pCAP-milA2-R后醇沉回收A2-R基因簇，将两者通过TAR实验进行连接，最后得到质粒BAC-mb(图7)。

[0144] 同时，为了将A2-ΔF-R和A1这两段基因簇合并至一个质粒载体上，利用PmeI酶切BAC-04质粒使其线性化，用CRISPR-Cas9切割pCAP-milA2-ΔF-R后醇沉回收A2-ΔF-R基因簇，将两者通过TAR实验进行连接，最后得到质粒BAC-05(图8)。所用的引物见表1。

[0145] 实施例10、Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-004工程菌株的构建[0146] 将BAC-mb质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和安普霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-004。

[0147] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-004菌株的米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和实施例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0148] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-054-004菌株的米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus NRRL 5739提高了约102.3％。

[0149] 实施例11、Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF201工程菌株的构建[0150] 将BAC-05质粒转化到S17-1中，然后通过接合转移的方式将其转入Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF菌株中。将接合子接种于含有萘啶酮酸和安普霉素的MB平板上，于28℃传代培养，得到过表达的菌株Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF201。

[0151] 为了确认Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF201菌株的5-酮-米尔贝霉素A3/A4生产能力，利用和实施例3中相同的发酵和HPLC检测方法来进行检测。

[0152] 结果显示：Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF201菌株的米尔贝霉素A3/A4产量比Streptomyces hygroscopicus SIPI-KF提高了约98.2％。

[0153] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。