一种改进的生产聚羟基脂肪酸酯的方法

摘要

本发明提供一种改进的微生物生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，所述方法包括向包含碳源以供微生物合成PHA的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物；优选添加乙酸或乙酸盐。该方法可以用于提高微生物合成PHA聚合物的产量和/或控制PHA共聚物产物中的单体比例。

权利要求

1.一种改进的微生物生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，所述方法包括向包含碳源以供微生物合成PHA的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为埃希氏杆菌属(Escherichia)、嗜盐菌属(Halophile)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)或芽孢杆菌属(Bacillus)属的细菌或者其组合；例如，所述微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、Halomonas campaniensis或Halomonas bluephagenesis或者其组合，优选Halomonas campaniensis或Halomonas bluephagenesis；特别地，所述微生物选自以下的一种或多种：Escherichia coli JM109-pBHR68；

Escherichia coli JM109SG-p68orfZ+pMCSH5；

Halomonas bluephagenesis TD01；

Halomonas bluephagenesis TD08AB；

Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2；

Halomonas bluephagenesis TDΔβ；和

Halomonas bluephagenesis TDΔα。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是通过将盐单胞菌中的etf基因敲除或使其失活之后得到的重组菌，优选地，通过将etf基因的etf-α亚基和etf-β亚基中的任一者或二者敲除而得到的重组菌。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳源为葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯或者其组合，所述碳源添加的浓度为1-100g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述PHA是均聚PHA或共聚PHA。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所添加的乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物的浓度为1-12g/L。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所添加的乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物的浓度为1-12g/L，所述微生物为Halomonas bluephagenesis TD01、Halomonas bluephagenesis TDΔα或Halomonas bluephagenesis TDΔβ，且所述PHA为聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所添加的乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物的浓度为1-8g/L，其中所述微生物为Halomonas bluephagenesis TD08AB且所述PHA为聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(P3HB3HV)，或者所述微生物为Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2且所述PHA为聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P3HB4HB)。

9.一种降低微生物生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)过程中积累的丙酮酸的方法，所述方法包括向包含碳源以供微生物合成PHA的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物。

10.一种重组菌，其通过在Halomonas属细菌的基础上通过敲除/失活etf基因而获得，所述Halomonas属细菌优选是Halomonas  bluephagenesis，更优选是保藏号为CGMCCNo.4353的Halomonas bluephagenesis TD01。

11.一种生产聚3-羟基丁酸酯的方法，所述方法包括使用权利要求10所述的重组菌在包含碳源的基础培养基中在适合培养所述重组菌以生产聚3-羟基丁酸酯的条件下进行发酵。

说明书

一种改进的生产聚羟基脂肪酸酯的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种改进的生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。更具体地，本发明涉及一种提高微生物合成PHA的产量和/或控制PHA共聚物产物中单体比例的方法，其是通过在培养基中添加一定量的乙酸来实现的。

背景技术

[0002] 目前工业上大规模生产生物聚合物通常是利用葡萄糖或者葡萄糖酸钠作为碳源，其中葡萄糖或者葡萄糖酸钠首先通过糖酵解途径生成丙酮酸，然后再从丙酮酸出发生成乙酰辅酶A，然后进入从乙酰辅酶A出发合成各种聚合物单体的合成途径。糖酵解会产生大量的NADH和ATP，从丙酮酸生成乙酰辅酶A这一过程也会产生NADH，在高密度的细胞培养下由于氧气的缺乏会导致NADH积累，进而影响产物合成，造成资源浪费。因此，现有技术中需要一种能够缓解或解决这种问题的方法。

[0003] 聚合物按照单体的组成可以分为共聚物(copolymer)和均聚物(homopolymer)，均聚物由一种单体组成，而共聚物由两种以上的单体组成。均聚物的材料性能单一并且不可调节，而共聚物的材料性能可以通过改变其中的单体比例来进行调节。共聚物由于更加优良的材料性能具有更高的附加值，其中单体的比例很大程度上决定了其材料性能。

[0004] 此外，已知有很多微生物通过代谢改造能够生产PHA共聚物，但是其中单体的比例控制比较困难。目前控制单体比例的方法主要分为两类，其中一类是通过基因工程改造微生物的代谢通路，通过特定基因表达优化以提高特定单体的比例，或者通过抑制特定基因的表达降低特定单体的比例。另外一类是通过直接控制特定的相关前体的添加量来改变聚合物中相应单体的比例，但是大多数单体的相关前体价格都很昂贵，有些前体甚至对细胞有毒性，导致这样的方法很难大规模应用到工业生产中。因此，找到一种低成本调节共聚物中单体比例的方法在工业生产中有重要意义。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术的前述问题而作出本发明。

[0006] 对于微生物合成PHA聚合物的糖酵解途径，本发明的发明人经过反复实验研究和分析，发现高细胞密度发酵下聚合物产物合成受抑制是因为NADH的积累导致丙酮酸生成乙酰辅酶A这一途径受抑制，进而导致从乙酰辅酶A出发合成各种PHA聚合物单体的合成途径受抑制，最终导致聚合物产物合成受限。鉴于此，找到一种价格低廉的方法降低或解除对丙酮酸代谢的抑制对工业生产聚合物有重要的意义。

[0007] 为降低或解除对丙酮酸代谢的抑制，发明人经过研究发现，向微生物发酵的培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物能够减轻NADH积累对丙酮酸生成乙酰辅酶A这一途径的抑制，减少丙酮酸积累，提高产物产量。并且，本发明还意外地发现，添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物甚至还能起到调节共聚物中单体比例的效果。

[0008] 基于上述发现，本发明涉及以下方面。

[0009] (一)

[0010] 本发明的一个目的是提高微生物合成聚合物比如聚羟基脂肪酸酯(PHA)方法中得到的聚合物产量。本发明的发明人发现，该目的可以通过在基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物来实现，并且本发明的生产工艺简单，成本低廉，具有广阔的应用前景。

[0011] 因此，在一个方面，本发明提供一种改进的生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，其包括向包含碳源的用于培养微生物以生产聚合物的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物，优选添加乙酸或乙酸盐。通过这样的方法，微生物生产聚合物的过程中所产生的丙酮酸代谢抑制得以减轻，碳源的利用率得到提高，最终可实现提高微生物细胞中的聚合物含量和终产量的目的。

[0012] 本发明的方法所涉及的微生物是能够合成生物聚合物的革兰氏阳性或阴性细菌。所述细菌包括但不限于，埃希氏杆菌属(Escherichia)、嗜盐菌属(Halophile)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、或芽孢杆菌属(Bacillus)等属的细菌、或者它们的组合。优选所述微生物是盐单胞菌属(Halomonas)属的细菌。更具体地，所述的微生物可以是，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、Halomonas campaniensis、或Halomonas bluephagenesis等等或者其组合，优选Halomonas campaniensis或Halomonas bluephagenesis或者其组合。

[0013] 本发明的方法所涉及的上述微生物可以野生型(即以其天然形式在合适的培养条件下能够利用适当的底物合成聚合物，比如PHA)，也可以是经过人工改造的重组型，包括但不限于通过诱变、基因工程改造等得到的菌。例如，在重组型的情况下，上述微生物可以是在自身不能够合成PHA的微生物中通过人工方式(比如导入PHA合成相关的基因)改造、进而使其能够在合适的培养条件下能够利用适当的底物合成聚合物的重组微生物，例如通过在大肠杆菌中引入聚羟基丁酸酯的合成基因phaC基因而得到的重组微生物。其还可以是在能够合成PHA的野生型微生物(如Halomonas bluephagenesis TD01)的基础上通过破坏/敲除etf基因而获得，例如通过破坏/敲除etf-α或etf-β基因而获得，更具体地，例如通过在Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基础上敲除etf-α或etf-β基因而获得的细菌。例如，本发明的方法所涉及的微生物可以是Halomonas bluephagenesis TD01，或者是在Halomonas bluephagenesis TD01的基础上通过诱变、基因工程改造等方法得到的工程菌。

[0014] 更优选地，所述微生物可以选自以下的一种或多种：

[0015] Escherichia coli JM109-pBHR68；

[0016] Escherichia coli JM109SG-p68orfZ+pMCSH5；

[0017] Halomonas bluephagenesis TD01；

[0018] Halomonas bluephagenesis TD08AB；

[0019] Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2；

[0020] Halomonas bluephagenesis TDΔβ；

[0021] Halomonas bluephagenesis TDΔα。

[0022] 本发明所涉及的微生物可以在适当的培养条件(温度、转速、溶氧、pH等等)下培养，只要该培养能够使其合成期望的PHA聚合物即可。例如，培养过程中的温度和转速可以由本领域技术人员根据微生物的特性来适当地设定，或常规的优化实验来进行选择。

[0023] 在上述方法中，用于发酵培养的培养基可通过在基础培养基的基础上添加与产物合成相关的底物(也称为碳源)和调节物质(如乙酸)而获得。例如最终的培养基可包含葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯或者其组合作为微生物培养的碳源。为了区分，本文所述的碳源不涵盖乙酸。优选地，所述培养基包含葡萄糖作为碳源。任选地，所述培养基还可以含有或者不含有葡萄糖以外的碳源。

[0024] 以上提及的葡萄糖酸盐可以是任意一种或多种葡萄糖酸盐，只要其可以用作本发明所涉及微生物的碳源用于聚合物生产即可，例如，葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙等。作为碳源的葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐或葡萄糖酸酯的浓度可以由本领域技术人员根据使用的培养条件和微生物来适当调整，并且可以在，例如，约1-100g/L、约1-90g/L、约1-80g/L、约1-70g/L、或约1-60g/L的范围内；优选地，该浓度可以在约3-60g/L、约3-50g/L或约3-40g/L的范围内；更优选约5-60g/L、约10-60g/L、约20-40g/L的范围内，包括例如约
25.5-34.5g/L。需理解，以上浓度范围并非是穷尽式列举，而是可以由本领域技术人员根据发酵体系的条件通过实验进行适当的调整，这些浓度范围均涵盖在本发明的范围内，只要其不会不利地影响本发明目的即可。

[0025] 在上述方法中，乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物可以是在微生物培养开始之前加入到基础培养基中。或者，乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物也可以是在微生物培养过程中一次、分批多次或流加到培养基中。再或者，乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物还可以是在将微生物接种到培养基的同时加入到培养基中。乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物的添加浓度可以为，例如在约1-12g/L、约1-11g/L、约1-10g/L、约1-9g/L或约1-8g/L的范围内；优选约1-8g/L，例如在约2-8g/L、约2-7g/L、约2-6g/L、约2-
5g/L、约2-4g/L、或2-3g/L的范围内；更优选2-6g/L，例如在约3-6g/L或约3-5g/L的范围内。
这些浓度可以在本发明的基础上根据培养基的组成和培养条件等因素而适当地调整，只要其不影响本发明的效果即可。

[0026] 以上提及的乙酸盐可以是任意一种或多种乙酸盐，只要本领域技术人员可以合理地预期其添加不会不利地影响本发明的目的即可，例如，乙酸盐可以是，但不限于：乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙等。同样地，上述提及的乙酸酯可以是任意一种或多种乙酸酯，只要本领域技术人员可以合理地预期其添加不会不利地影响本发明的目的即可，例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等。

[0027] 以上提及的基础培养基是指包含营养物质可以用于支持本发明微生物的生长的培养基。上述基础培养基可以是本领域常规用于微生物培养的培养基，比如矿物质培养基、LB培养基、MM培养基或牛肉膏蛋白胨等等，也可以是在这些培养基的基础上根据期望目的进行改良的培养基。也就是说，本领域技术人员可以常规选择合适的基础培养基，只要其能够允许微生物的生长即可。

[0028] 在本发明的方法中，所合成的聚合物可以是聚羟基脂肪酸酯(PHA)，但不仅限于此。具体地，该PHA可以是共聚物或均聚物，或者其组合。在均聚物的情况下，其可包括但不限于聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等等，例如，聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚-3-羟基丙酸酯(P3HP)或聚-3-羟基戊酸酯(P3HV)等。在共聚物的情况下，所述共聚物可以是二聚物、三聚物，但不限于此，例如，共聚物可以是羟基丙酸酯与羟基丁酸酯的共聚物；羟基丙酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丙酸酯、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯三者的共聚物等等。更具体地，其可以是聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P3HB4HB)、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)
(P3HB3HV)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(P3HB4HB3HV)等等。

[0029] 根据本发明的技术方案，通过向用于培养微生物的包含有碳源的基础培养基中添加适量的乙酸，使得丙酮酸的代谢抑制得到缓解或消除，微生物合成聚合物的能力提高，并且细胞干重也增加，最终得到的聚合物产量也增加。

[0030] 基于前述，本发明还提供一种用于在聚羟基脂肪酸酯的微生物合成中提高聚羟基脂肪酸酯产量的方法，其包括向包含碳源的用于培养微生物以生产聚合物的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物，优选添加乙酸或乙酸盐。关于该方法中所涉及的具体微生物、碳源、培养基、乙酸(或乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物)的限定如前文所述。

[0031] (二)

[0032] 本发明的另一个目的是调节在微生物法生产共聚物中产生的共聚物产物中的单体比例。

[0033] 因此，在第二个方面，本发明提供一种改进的生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，所述方法包括向包含碳源的用于所述微生物的生长和培养的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物，所述聚合物为共聚聚羟基脂肪酸酯。通过这样的方法，可以改变微生物代谢流的分流，改变微生物内部环境，影响乙酰辅酶A进入不同单体合成途径的代谢流，从而改变细胞积累生物聚合物中各种单体的比例。本发明的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。

[0034] 本发明的方法所涉及的微生物是能够合成生物聚合物的革兰氏阳性或阴性细菌。所述细菌包括但不限于，埃希氏杆菌属(Escherichia)、嗜盐菌属(Halophile)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、或芽孢杆菌属(Bacillus)等属的细菌、或者它们的组合。优选所述微生物是盐单胞菌属(Halomonas)属的细菌。更具体地，所述的微生物可以是，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、Halomonas campaniensis、或Halomonas bluephagenesis等等或者其组合，优选Halomonas campaniensis或Halomonas bluephagenesis或者其组合。

[0035] 本发明的方法所涉及的微生物可以野生型(即以其天然形式在合适的培养条件下能够利用适当的底物合成聚合物，比如PHA)，也可以是经过人工改造的重组型。在重组型的情况下，其可以是在自身不能够合成PHA的微生物中通过人工方式(比如导入PHA合成相关的基因)改造、进而使其能够在合适的培养条件下能够利用适当的底物合成聚合物的重组微生物，例如通过在大肠杆菌中引入聚羟基丁酸酯合成基因phaC基因得到的重组微生物。其还可以是在能够合成PHA的野生型微生物(如Halomonas bluephagenesis TD01)的基础上通过破坏/敲除etf基因而获得，例如通过破坏/敲除etf-α或etf-β基因而获得，更具体地，例如通过在Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基础上敲除etf-α或etf-β基因而获得的细菌。例如，本发明的方法所涉及的微生物可以是Halomonas bluephagenesis TD01，或者是在Halomonas bluephagenesis TD01的基础上通过诱变、基因工程改造等方法得到的工程菌。

[0036] 更优选地，所述微生物可以选自以下的一种或多种：

[0037] Escherichia coli JM109-pBHR68；

[0038] Escherichia coli JM109SG-p68orfZ+pMCSH5；

[0039] Halomonas bluephagenesis TD01；

[0040] Halomonas bluephagenesis TD08AB；

[0041] Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2；

[0042] Halomonas bluephagenesis TDΔβ；

[0043] Halomonas bluephagenesis TDΔα。

[0044] 本发明所涉及的微生物可以在适当的培养条件(温度、转速、溶氧、pH等等)下培养，只要该培养能够使其合成期望的聚合物即可。例如，培养过程中的温度和转速可以由本领域技术人员根据微生物的特性来适当地设定，或常规的优化实验来进行选择。

[0045] 在上述方法中，用于发酵培养的培养基可通过在基础培养基的基础上添加与产物合成相关的底物(也称为碳源)和调节物质(如乙酸)而获得。例如最终的培养基可葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯或者其组合作为微生物培养的碳源。优选地，所述培养基包含葡萄糖作为碳源。为了区分，本文所述的碳源不涵盖乙酸。任选地，所述培养基还可以含有或者不含有葡萄糖以外的碳源。

[0046] 以上提及的葡萄糖酸盐可以是任意一种或多种葡萄糖酸盐，只要其可以用作本发明所涉及微生物的碳源用于聚合物生产即可，例如，葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙等。作为碳源的葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐或葡萄糖酸酯的浓度可以由本领域技术人员根据使用的培养条件和微生物来适当调整，并且可以在，例如，约1-100g/L、约1-90g/L、约1-80g/L、约1-70g/L、或约1-60g/L的范围内；优选地，该浓度可以在约3-60g/L、约3-50g/L或约3-40g/L的范围内；更优选约5-60g/L、约10-60g/L、约20-40g/L的范围内，包括例如约
25.5-34.5g/L。需理解，以上浓度范围并非是穷尽式列举，而是可以由本领域技术人员根据发酵体系的条件通过实验进行适当的调整，这些浓度范围均涵盖在本发明的范围内，只要其不会不利地影响本发明目的即可。

[0047] 在上述方法中，乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物可以是在微生物培养开始之前加入到基础培养基中。或者，乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物也可以是在微生物培养过程中一次、分批多次或流加到培养基中。再或者，乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物还可以是在将微生物接种到培养基的同时加入到培养基中。乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物的添加浓度可以为，例如在约1-12g/L、约1-11g/L、约1-10g/L、约1-9g/L或约1-8g/L的范围内；优选约1-8g/L，例如在约2-8g/L、约2-7g/L、约2-6g/L、约2-
5g/L、约2-4g/L、或2-3g/L的范围内；更优选2-6g/L，例如在约3-6g/L或约3-5g/L的范围内。
这些浓度可以在本发明的基础上根据培养基的组成和培养条件等因素而适当地调整，只要其不影响本发明的效果即可。

[0048] 以上提及的乙酸盐可以是任意一种或多种乙酸盐，只要本领域技术人员可以合理地预期其添加不会不利地影响本发明的目的即可，例如，乙酸盐可以是，但不限于：乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙等。同样地，上述提及的乙酸酯可以是任意一种或多种乙酸酯，只要本领域技术人员可以合理地预期其添加不会不利地影响本发明的目的即可，例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯等。

[0049] 以上提及的基础培养基是指包含营养物质可以用于支持本发明微生物的生长的培养基。上述基础培养基可以是本领域常规用于微生物培养的培养基，比如矿物质培养基、LB培养基、MM培养基或牛肉膏蛋白胨等等，也可以是在这些培养基的基础上根据期望目的进行改良的培养基。也就是说，本领域技术人员可以常规选择合适的基础培养基，只要其能够允许微生物的生长即可。

[0050] 在本发明的方法中，所合成的聚合物是共聚物，其可以是二聚物、三聚物，但不限于此，例如，共聚物可以是羟基丙酸酯与羟基丁酸酯的共聚物；羟基丙酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丙酸酯、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯三者的共聚物等等。更具体地，其可以是聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P3HB4HB)、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(P3HB3HV)、聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(P3HB4HB3HV)等等。

[0051] 基于前述，本发明还提供一种用于在聚羟基脂肪酸酯共聚物的微生物合成中调节共聚物中单体比例的方法，其包括向包含碳源的用于培养微生物以生产聚合物的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物，优选添加乙酸或乙酸盐。关于该方法中所涉及的具体微生物、碳源、培养基、乙酸(或乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物)的限定如前文所述。

[0052] (三)

[0053] 在第三方面，本发明提供一种降低微生物生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)过程中积累的丙酮酸的方法，所述方法包括向用于培养微生物的包含碳源的基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物，其浓度如前述第一至第二方面所述。此外，所述方法中的基础培养基、碳源等也如前述第一至第二方面所述。

[0054] (四)

[0055] 在第四方面，本发明提供一种重组菌，其通过在Halomonas属细菌的基础上通过敲除/失活etf基因的etf-α和etf-β亚基中的任一种或者全部而获得，所述Halomonas属细菌优选Halomonas  bluephagenesis，更优选保藏号为CGMCCNo.4353的Halomonas bluephagenesis TD01。

[0056] 本发明还提供一种生产聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的方法，该方法包括使用前述的etf基因被敲除/失活的重组菌在包含碳源的基础培养基中在适合培养所述重组菌以生产聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的条件下进行发酵。优选地，可以向所述基础培养基中添加乙酸、乙酸盐、乙酸酯或其他的乙酸衍生物，其浓度如前述第一至第二方面所述。此外，所述方法中的基础培养基、碳源等也如前述第一至第二方面所述。

附图说明

[0057] 图1为实施例2中敲除etf-β亚基的琼脂糖凝胶结果示意图。

[0058] 图2为在实施例2中Halomonas bluephagenesis TD01和TDΔβ积累P3HB的透射电镜图结果示意图，左图为TD01在6g/L乙酸添加条件下得到的图；右图为TDΔβ在3g/L乙酸添加条件下得到的图。

具体实施方式

[0059] 本文所提及的细胞干重(CDW，g/L)是冰干菌体的质量与发酵液体积的比值。

[0060] 本文所提及的PHA是指聚羟基脂肪酸酯，其根据单体组成可以分为均聚物和共聚物。根据单体的碳原子数，本发明的PHA可以是短链PHA(即，单体为C3-C5的羟基脂肪酸)或者中长链PHA(即，单体为C6-C16的羟基脂肪酸)，但不限于此。在本发明的一些实施方式中，PHA可以是均聚物，包括但不限于聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等等，例如，聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚-3-羟基丙酸酯(P3HP)或聚-3-羟基戊酸酯(P3HV)等。在本发明的一些实施方式中，PHA可以是共聚物如二聚物、三聚物等，但不限于此，例如，共聚物可以是羟基丙酸酯与羟基丁酸酯的共聚物；羟基丙酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丙酸酯、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯三者的共聚物等等。更具体地，在本发明的一些实施方式中，PHA可以是聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)(P3HB4HB)、聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(P3HB3HV)或聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(P3HB4HB3HV)、或其组合等等。在本发明的一些实施方式中，PHA可以是P3HB(即，聚β-羟基丁酸酯或聚3-羟基丁酸酯)。在本发明的另一些实施方式中，PHA可以是P3HB3HV(即，3-羟基丁酸3-羟基戊酸共聚物)。

[0061] 本文所提及的P3HB3HV含量(wt％)为冰干菌体中P3HB3HV的质量与参与酯化的冰干菌体质量的百分比，其中P3HB3HV质量为酯化后得到的3HV质量与3HB的质量和，在实施例中，如无相反说明，则“％”表示“wt％”。

[0062] 本文所提及的P3HB含量(wt％)为P3HB的质量与参与酯化的冰干菌体质量的百分比，其中P3HB质量为酯化后得到的3HB总质量。在实施例中，如无相反说明，则“％”表示“wt％”。

[0063] 本文实施例3所提及的3HV(mol％)为3HV单体的摩尔数与P3HB3HV单体总摩尔数的百分比，其中P3HB3HV单体总摩尔数为3HV单体的摩尔数+3HB单体的摩尔数，其中3HV表示3-羟基戊酸(酯)，3HB表示3-羟基丁酸(酯)。同理，本文实施例3所提及的4HB(mol％)表示4HB单体的摩尔数与P3HB4HB单体总摩尔数的百分比。

[0064] 本文所提及的“基础培养基”是指适用于培养微生物并适合该微生物利用向培养基中添加的碳源合成聚羟基脂肪酸酯的培养基，这样的培养基比如MM培养基、LB培养基、矿物质培养基等等，但不限于此。这些培养基的配方是本领域技术人员常规知晓的，并且本领域技术人员可以常规地对其组分或组分浓度进行适当地调整。在本文中，除特殊说明外，用于培养微生物以合成目的产物的培养基或基础培养基是指液体培养基。

[0065] LB液体培养基的一般配方为：4-6g/L酵母提取物，8-12g/L蛋白胨，8-12g/L NaCl，其余为蒸馏水(pH调至7.0-7.2)；优选为：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为蒸馏水(pH调至7.0-7.2)。

[0066] MM液体培养基的一般配方为：0.1‰-2‰(NH4)2SO4或者尿素，0.1‰-1‰MgSO4，5‰-10‰Na2HPO4·12H2O，0.5‰-2‰KH2PO4，不超过0.1％的其他微量元素(Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·
6H2O，NaMoO4·2H2O微量)(pH调至约9.0)。优选为：0.1％(NH4)2SO4或者0.2％尿素，0.02％MgSO4，1.0％Na2HPO4·12H2O，0.15％KH2PO4，不超过0.1％的其他微量元素(Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·
6H2O，NaMoO4·2H2O)(pH调至约9.0)。

[0067] “碳源”是为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质。在本发明中，“碳源”是本发明的微生物用以合成PHA的底物来源，排除乙酸。因此，“碳源”在本文中可以与“底物”可互换地使用。所述碳源可以是：葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯、淀粉、蔗糖等等或者它们的组合，但不限于此。优先使用葡萄糖作为本发明的碳源。

[0068] 本文所提及的etf基因是编码电子转运黄素蛋白(electron transfer flavoprotein，ETF)的基因，该基因已知存在于例如盐单胞菌属和假单胞菌属中，其包含两个亚基etf-α和etf-β，在盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01里面的NCBI编号分别为：WP_009724031.1，WP_009724032.1。

[0069] 实施例

[0070] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0071] 除特殊说明外，所用酶试剂均购自Thermo Scientific Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制；PCR的相关试剂和酶均来源于NEB公司(USA)。

[0072] 实验材料：

[0073] LB培养基含：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为蒸馏水；调pH值至7.0-7.2；然后高压蒸汽灭菌。

[0074] LB60培养基含：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，60g/L NaCl，其余为蒸馏水；调pH值至7.0-7.2；然后高压蒸汽灭菌。

[0075] MM60培养基配置方法：配制酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)的NaCl溶液，酵母提取物浓度为1g/L，NaCl浓度为60g/L；溶解后高压灭菌；冷却后每50ml溶液加入1ml组分I(向10g(NH4)2SO4和2g MgSO4加蒸馏水定容至200ml，然后高压蒸汽灭菌)和1mL组分II(向96.5g Na2HPO4·12H2O和15g KH2PO4加蒸馏水定容至200ml，然后高压蒸汽灭菌)；最后用5M的NaOH水溶液将体系的pH值调整为约9.0。

[0076] 上述配制过程中使用的(NH4)2SO4、NaCl、MgSO4、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4购自国药集团化学试剂有限公司，目录号分别为10002992、10019308、10034998、10020392、1017628；葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司，目录号为63005518；葡萄糖酸钠购自美国SIGMA-ALDRICH公司，目录号为S2054-1KG。

[0077] 在培养过程中，根据实际需求向培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL的氨苄青霉素。乙酸和葡萄糖在培养基灭菌后添加，并调节pH至合适值。

[0078] 实施例中使用了下列菌株：

[0079] E.coli S17-1：记载于Simon R,Priefer U,Pühler A.A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposon mutagenesis in gram negative bacteria[J].Nature biotechnology,1983,1(9):784.由瑞士苏黎世理工大学Uwe Sauer教授馈赠；公众可以从清华大学获得该菌。

[0080] Halomonas bluephagenesis TD01：该菌株于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.4353，分类命名为盐单胞菌Halomonas sp.TD01(也称为Halomonas bluephagenesis TD01，见XB Chen et al.(2017),Construction of Halomonas bluephagenesis capable of high cell density growth for efficient PHA production.Appl Microbiol Biotechnol.Volume 244,Part 1,534-541页)；其记载于专利申请公开号CN102120973A；公众可以从清华大学获得该菌。

[0081] Escherichia coli JM109-pBHR68：通过将pBHR68质粒转化到Escherichia coli JM109(购自北京博迈德基因技术有限公司)中而制得，其中pBHR68为含有合成聚羟基丁酸酯相关基因的质粒，其记载在如下文献中：Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，Baumeister D，Steinbüchel A(1999)A sensitive,viable-colony staining method using Nile red  for direct screening of  bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other storage com-pounds.Arch Microbiol 171：73-
80，该质粒中含有来源于罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha的聚羟基丁酸酯合成基因phaC基因、β-酮基硫解酶phaA和NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB，公众可以从清华大学获得该菌，本领域技术人员也可以按照上述公开内容通过常规的分子生物学手段获得Escherichia coli JM109-pBHR68。

[0082] Escherichia coli JM109SG-p68orfZ+pMCSH5：该菌株记载在Li Z J,Shi Z Y,Jian J,et al.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli[J].Metabolic engineering,2010,12(4):352-359.中，其能够利用葡萄糖作为单一碳源生产P3HB4HB，其保存于清华大学且公众可以从清华大学获得该菌。

[0083] Halomonas bluephagenesis TD08AB：该菌株记载在Yin J,Wang H,Fu X Z,et al.Effects  of chromosomal  gene  copy  number  and  locations  on polyhydroxyalkanoate synthesis by Escherichia coli and Halomonas sp[J]
.Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(13):5523-5534.中，能够利用葡萄糖作为单一碳源生产P3HB3HV，其保存于清华大学且公众可以从清华大学获得该菌。

[0084] Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2：该菌株记载在Ye J,Hu D,Che X,et al.Engineering of Halomonas bluephagenesis for low cost production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from glucose[J].Metabolic Engineering,2018,47:143-152.中，该菌能够利用葡萄糖作为单一碳源生产P3HB4HB，其保存于清华大学且公众可以从清华大学获得该菌。

[0085] Halomonas bluephagenesis TDΔβ：以Halomonas bluephagenesis TD01为出发菌株经etf-β亚基敲除而获得，该菌株在本申请的实验中构建并保藏于清华大学，具体的构建过程见实施例2。本领域技术人员可以根据本申请的公开内容制备该菌，并且公众可以从清华大学获得该菌。

[0086] Halomonas bluephagenesis TDΔα：以Halomonas bluephagenesis TD01为出发菌株经etf-α亚基敲除而获得，该菌株在本申请的实验中构建并保藏于清华大学，具体的构建过程见实施例2。本领域技术人员可以根据本申请的公开内容制备该菌，并且公众可以从清华大学获得该菌。

[0087] 气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯(PHA)含量的方法：

[0088] 设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：80℃停留1.5分钟，以30℃/min的速度升温至140℃，接着以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μl，使用安捷伦公司生产的微量进样器。

[0089] 气相样品准备：取40-60mg待测样品的干细胞(取菌液于10000rpm下常温离心10分钟，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干细胞，均聚物产于细胞中)，加2ml氯仿，2ml酯化液(纯甲醇中含3％(v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标)于酯化管中，加盖密封后于100℃下加热4小时。冷却后加入1ml蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿相1μl注入气相色谱仪(HP公司Hewlett Packard 6890)中进行色谱分析。依照HP公司Hewlett Packard 6890气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。

[0090] 标准样品准备：取10-20mg的标准样品于酯化管中，加2ml氯仿，2ml酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。

[0091] 结果分析：以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在标样处有明显的出峰，则可以根据峰面积计算各单体的质量，然后根据各个单体的质量分数计算出摩尔比例；根据加入的样品量可以计算出细胞干重中含有聚合物的比重(wt％)。

[0092] 实施例1、通过在基础培养基中添加乙酸提高微生物发酵合成P3HB的产量

[0093] 一、培养基和培养条件的优化

[0094] (1)葡萄糖浓度的优化

[0095] 以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01作为P3HB生产菌株进行实验，确定生产P3HB的最适葡萄糖浓度。首先挑取单菌落到20mL的LB60(含有60g/L NaCl的LB)培养基中在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含系列不同浓度葡萄糖(见表1)的MM60培养基(pH 8.5-9.0，NaCl浓度60g/L)中，于37℃、200rpm下摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后测定样品的细胞干重(CDW；单位g/L)，然后通过气相色谱检测出细胞干重中P3HB的含量百分比(％)。每个条件设置三组平行。细胞干重和P3HB含量见表1。

[0096] 表1.盐单胞菌TD01利用不同葡萄糖浓度生产P3HB的摇瓶实验结果

[0097]

[0098] 从表1的结果可以看出，30g/L的葡萄糖是TD01积累P3HB的最佳浓度，因此，选择该浓度用于后续实验。

[0099] (2)摇瓶培养转速的优化

[0100] 摇瓶的培养转速对微生物生长的氧环境有直接影响，而外部氧环境又直接影响了微生物内部的环境，因此我们通过控制摇瓶转速，寻找微生物积累P3HB的最佳环境。以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01为P3HB生产菌，首先挑取单菌落在20mL的LB60(含有60g/L NaCl的LB)培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至
50mL的含30g/L葡萄糖的MM60培养基(pH 8.5-9.0，NaCl浓度60g/L)中，分别设置转速为
100rpm、200rpm和300rpm三个转速梯度，在37℃下摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，然后通过气相色谱检测细胞干重中P3HB的含量百分比(％)。每个条件设置三组平行。细胞干重和P3HB含量见表2。

[0101] 表2.盐单胞菌TD01在不同转速条件下生产P3HB的摇瓶实验结果

[0102]

[0103] 从表2中我们可以看到，盐单胞菌TD01生产P3HB的最佳转速为200rpm，因此选择200rpm的转速用于后续实验。

[0104] 二、在补充了碳源的培养基中添加乙酸以测试其对Halomonas bluephagenesis TD01和P3HB合成的影响

[0105] 已知乙酸是一种比葡萄糖还原性低的碳源，且已有多篇文献都报道乙酸对微生物的生长有抑制作用。而在本申请中，发明人发现通过添加乙酸并控制适当的添加量，不仅没有观察到乙酸对细胞生长和积累P3HB的抑制作用，并且还发现其可以增加P3HB的积累量，这可能是通过调节微生物内部的微环境、消除丙酮酸的代谢抑制、节省碳源而实现的。

[0106] 以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD01生产P3HB为例进行实验，首先挑取单菌落在20mL的LB60(含有60g/L NaCl的LB)培养基，在37℃下以200rpm的转速过夜培养；然后按5％接种量(v/v)接种至添加葡萄糖和乙酸的50mL MM60培养基(pH 8.5-9.0，NaCl浓度60g/L)中，其中葡萄糖浓度为30g/L，乙酸设置在0-12g/L之间，进行浓度梯度实验(见表
3)。培养温度设为37℃，设置转速设为200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，然后通过气相色谱检测细胞干重中P3HB的含量百分比(％)。每个条件设置三组平行。细胞干重和P3HB含量见表3。

[0107] 表3.添加不同浓度的乙酸对盐单胞菌TD01生产P3HB的影响

[0108]

[0109]

[0110] 从表3的数据中可以看到，补充乙酸能够增加单位重量的微生物细胞积累P3HB的能力，在一定范围内还能提高微生物的细胞干重。经计算，补充1-8g/L乙酸、特别是2-8g/L乙酸能够提高P3HB产物的总产量(g/L)，在添加2-8g/L乙酸的范围内得到的产量与不添加乙酸的对照组相比提高至少约12％。其中，在低于6g/L的乙酸添加条件下，随着乙酸浓度上升，对细胞的生长和P3HB的积累促进越大，但是当乙酸浓度上升到6g/L以上时，随着乙酸浓度上升，细胞干重和P3HB百分比含量不再进一步提高，甚至开始下降。

[0111] 我们还检测了发酵结束后发酵液中各种物质的含量，包括葡萄糖、乙酸和丙酮酸(表4)。

[0112] 表4.发酵结束后发酵液中的物质分析检测

[0113]

[0114] 根据本实施例的结果，与不添加乙酸的情况相比，添加乙酸确实能减轻发酵体系中NADH对丙酮酸代谢的抑制，减少丙酮酸残余，由此，葡萄糖的利用率得到提高。

[0115] 结合表3中的P3HB积累和细胞干重数据，我们可以发现添加1-8g/L乙酸、特别是2-8g/L的乙酸能够显著提高细胞干重和碳源利用率，有效地提高P3HB合成量；同时减少葡萄糖和丙酮酸剩余，由此缓解葡萄糖和丙酮酸的代谢抑制；并且乙酸剩余比例较低，使得整个发酵体系得到优化。

[0116] 三、添加乙酸和其他碳源进行对比

[0117] 为了验证添加乙酸对丙酮酸和葡萄糖的代谢抑制有缓解作用而不是额外添加碳源起到的效果，我们设置了额外添加丙酮酸和葡萄糖的对照实验。在本实验中，采用的菌株、培养基和培养条件与实施例1第二部分的条件相同，区别在于向基础培养基中分别额外添加乙酸、丙酮酸或葡萄糖，添加量如表5所示，它们的添加量在理论上将转化成相同量的乙酰辅酶A(表5)。

[0118] 表5.添加乙酸、丙酮酸和葡萄糖对P3HB合成的影响

[0119]

[0120] 从表5中我们可以得出结论：额外添加碳源比如葡萄糖或丙酮酸，都不能提高细胞干重或P3HB积累，甚至添加丙酮酸会降低细胞干重和P3HB含量，这证实了丙酮酸积累确实会对P3HB合成有一定抑制作用；本实验进一步证明了添加乙酸减少丙酮酸残余，进而会对微生物细胞生长和合成P3HB有促进作用。

[0121] 四、添加乙酸盐对P3HB合成的影响

[0122] 鉴于乙酸在培养基溶液中以离子形式存在，发明人预期添加乙酸盐将获得与添加乙酸基本相同的效果，并按实施例1第二部分进行相同的实验，区别在于将乙酸替换成乙酸盐(乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙等)。

[0123] 结果显示，添加乙酸和乙酸钠盐对细胞干重和P3HB合成百分比的作用确实基本相同。

[0124] 实施例2、在补充了碳源的培养基中添加乙酸以测试其对Halomonas bluephagenesis TDΔβ和P3HB合成的影响。

[0125] 一、工程菌TDΔβ的构建：

[0126] 1)、敲除质粒pKObet23同源臂的构建

[0127] 提取Halomonas bluephagenesis盐单胞菌TD01的基因组，并以其为模板用pfu酶(NEB，USA)进行PCR扩增，分别以beta-H1-F和beta-H1-R，beta-H2-F和beta-H2-R为引物来扩增etf-β(核苷酸序列示于SEQ ID NO:1；氨基酸序列示于SEQ ID NO:2)的左侧同源臂H1和右侧同源臂H2；以质粒pSEVA241为模板(该质粒在记录在文献：Silva-Rocha,Rafael,et al."The Standard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes."Nucleic Acids Research 41.D1(2012):D666-D675.中)，用引物donor-H-F和donor-H-R为引物进行扩增得到质粒模板Donor-1。

[0128] etf-β的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)：

[0129] ATGCGGCCTGAACAACAGCAAAAACAACAAAAGCCGGGTATCGACGTGGCGGTGCTGGTCTCCATAGGCCGTCACCCCACAACCGGTCGTGCGAGGCGCGCCGAGCAGGATGCACGGGGTCTGGAACTTGCTCTAGCCATGGAAGCAGAACTGCCGGGTAGCCGGATTGACGTACTGCACGCTGGTTCTCAGGATGTCGACAGCGAGGCAGCTCTGCGCAGTTACTTGGGTATGGCCACAGGCGTTGGTATGGGGCTTGAGTCTATGACCTTGCTGGAGCAGCCCGATGGCAGCGATGCCATTCTACCGCTGGTGGAACATTTAGCCGCTACCTCGCCCCAACTAGTGATCACCGGTGCCCGGGCCGAGCGCGGAGAAGGTTCTGGGCTTTTGCCCTATGCGTTGGCTGAGCATCTCGGTTGGCCGTTAGTGAATAGCTTGGCGTCGATAGAGACAGTGGAGAATGGTGTGATAACGCTGCTTCAAGCGTTGCCACGGGGCCAGCGTCGCCGTCTCAAGGTGCGCTTGCCCGCCATCATCAGCGTGGATGAAGCAGCGCCGGCGGCGCGTCAGAGCGCCTTCGGCCCGGCTCGCCGAGCCAGCTTCTCGGTGGCGCCCACTACCTCTGAAGCCGACAGTGAGTTGGCCCAGTGGCACTTGAGCCCCGCACGTAAACGGCCTAAGCGTCTGAAAATCATTAAAGCCGCCTCAGCCAGAGATCGTTTCAAAGCGGCGGCTTCCAAAGCCGAGGGCAAGGGCGGGCAAGTGCTCACCGACGTCACCCCCGAAGAGGGCGCCGAGGCGATCTACAAGCTACTCAAGGAAGAGGACGTGCTGCGCTGA

[0130] etf-β的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

[0131]MRPEQQQKQQKPGIDVAVLVSIGRHPTTGRARRAEQDARGLELALAMEAELPGSRIDVLHAGSQDVDSEAALRSYLGMATGVGMGLESMTLLEQPDGSDAILPLVEHLAATSPQLVITGARAERGEGSGLLPYALAEHLGWPLVNSLASIETVENGVITLLQALPRGQRRRLKVRLPAIISVDEAAPAARQSAFGPARRASFSVAPTTSEADSELAQWHLSPARKRPKRLKIIKAASARDRFKAAASKAEGKGGQVLTDVTPEEGAEAIYKLLKEEDVLR*

[0132] H1的引物为：

[0133] beta-H1-F：5’CGAGGCGATCTACAAGCTACT 3’(SEQ ID NO:3)

[0134] beta-H1-R：5’

[0135] AGGGTTTTCCCAGTCACGACGCCGCTATCCAGCCATTGAC 3’(SEQ ID NO:4)

[0136] H2的引物为：

[0137] beta-H2-F：5’

[0138] AGTCGGTGCTTTTTTTGAACCCTGACCTTGGCAGCGTCCATT 3’(SEQ ID NO:5)

[0139] beta-H2-R：5’

[0140] AGTAGCTTGTAGATCGCCTCGTATGGAGACCAGCACCGCC 3’(SEQ ID NO:6)

[0141] Donor-1的引物为：

[0142] donor-H-F：5’GTCGTGACTGGGAAAACCCT 3’(SEQ ID NO:7)

[0143] donor-H-R：5’GGGTTCAAAAAAAGCACCGACT 3’(SEQ ID NO:8)

[0144] PCR反应条件：

[0145] 先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

[0146] PCR反应体系(50μL体系)：

[0147]

[0148] PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

[0149] 得到504bp的PCR产物为目的基因etf-β的同源臂H1；565bp的产物为目的基因etf-β的同源臂H2；5291bp的产物为源自pSEVA241的质粒骨架Donor-1。然后用Gibson试剂盒(由美国NEB公司购得，目录号为E2611L)将扩增出来的三个产物进行连接。

[0150] Gibson连接反应条件：

[0151] 先将目标片段混合，用水补齐至10微升，然后按照Gibson试剂盒的说明书在50℃处理1小时。Gibson连接体系(10μL体系)如下所示：

[0152]

[0153] 得到连接产物，转化到大肠杆菌JM109中，得到转化子，并进行测序，挑选测序正确的保存并用LB培养基过夜培养后提质粒，该质粒命名为pSEVA241-HR。

[0154] 2)、敲除pKObet23质粒中sgRNA的插入

[0155] 以上一步中插入同源臂H1和H2后的pSEVA241-HR质粒为模板，以donor-G-F和donor-G-R为引物，用pfu酶进行PCR扩增，得到源自pSEVA241-HR的质粒骨架；然后将引物sgRNA-F和sgRNA-R进行退火连接，得到带有粘性末端的DNA双链；将以上的质粒骨架和带有粘性末端的DNA双链用BsaI进行酶切和连接，得到用于目的基因etf-β的敲除质粒pKObet23。

[0156] 以带有同源臂H1和H2的pSEVA241-HR为模板进行扩增：

[0157] donor-G-F：5’

[0158] CTAGGGTCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT 3’(SEQ ID NO:9)[0159] donor-G-R：5’

[0160] CTAGGGTCTCAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGT 3’

[0161] (SEQ ID NO:10)

[0162] 得到6300bp的PCR产物，将得到的质粒骨架用限制性内切酶BsaI酶切，并将酶切后的片段进行回收。

[0163] sgRNA-F和sgRNA-R引物的退火条件：

[0164] 先95℃预变性5分钟；每3分钟降10℃，最后15℃保持5分钟。

[0165] 引物序列为：

[0166] sgRNA-F：5’TAGTTGGGCTTTTGCCCTATGCGT 3’(SEQ ID NO:11)

[0167] sgRNA-R：5’AAACACGCATAGGGCAAAAGCCCA 3’(SEQ ID NO:12)

[0168] 退火体系(10μL)：

[0169] sgRNA-F 5μL

[0170] sgRNA-R 5μL

[0171] 引物终浓度为10pM。

[0172] 得到的酶切后质粒骨架和退火后的DNA双链用T4DNA连接酶进行连接，转化进入大肠杆菌JM109，对长出的重组菌落进行测序，测序正确的进行保藏，并提取出质粒，该质粒就是用于敲除目标基因etf-β的敲除质粒pKObet23。

[0173] 3)、盐单胞菌TD01中etf-β基因的敲除

[0174] 首先在盐单胞菌TD01中转入表达Cas9蛋白的质粒pQ08(转入过程参见：Qin,Qin,et al."CRISPR/Cas9editing genome of extremophile Halomonas spp."Metabolic Engineering(2018):219-229.)，该质粒中含有来源于化脓链球菌Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白，该菌株保存于清华大学。

[0175] 以上述含有Cas9蛋白的盐单胞菌TD01作为受体菌，以转入携带质粒pKObet23的E.coli S17-1作为供体菌进行接合转化，在含有壮观霉素抗性(100mg/ml)的LB60固体培养基的平板(在LB60液体培养基的配方中额外加入15g/L的琼脂粉，121℃高压灭菌20min，待冷却后倒平板)上筛选单克隆。以单克隆的基因组为模板，以Test-beta-F和Test-beta-R为引物，用tag酶进行菌落PCR扩增。

[0176] 引物为：

[0177] Test-beta-F：5’GGGTGTGGCAGATTGAAGCT 3’(SEQ ID NO:13)

[0178] Test-beta-R：5’GTGCCGCTAAGAACGTTGTT 3’(SEQ ID NO:14)

[0179] 菌落PCR反应条件：

[0180] 先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

[0181] PCR反应体系(50μL体系)：

[0182]

[0183] PCR扩增体系配制完成分装后，单菌落用牙签挑入。扩增条带大小为1338bp的菌落为敲除型，扩增条带大小为2069bp的菌落为野生型(参见图1)，最终得到TD01的etf-β基因敲除型，命名为Halomonas bluephagenesis TDΔβ。

[0184] 二、添加乙酸对重组菌TDΔβ合成P3HB的影响

[0185] 为了检验TDΔβ合成P3HB的能力，我们用TD01和TDΔβ进行了摇瓶实验；首先分别挑取单菌落到20mL的LB60培养基中，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL MM60培养基(pH8.5-9.0，NaCl浓度60g/L)，葡萄糖浓度设为30g/L，乙酸设置浓度梯度：0g/L，1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，12g/L。培养温度为37℃，设置转速为200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，然后通过气相色谱检测出细胞干重中P3HB的含量百分比(％)。每个条件设置三组平行。细胞干重和P3HB含量见表6。

[0186] 表6.添加乙酸对盐单胞菌TD01和TDΔβ的影响

[0187]

[0188] 从表6的数据我们可以得出以下结论：从盐单胞菌TD01敲除etf-β后得到TDΔβ，在同等条件下盐单胞菌TDΔβ可以合成比TD01显著更高含量的P3HB。并且，与在TD01培养中添加乙酸得到的结果相似，在盐单胞菌TDΔβ的培养基中添加一定浓度范围内的乙酸同样可以增加微生物的细胞干重以及细胞中积累的P3HB含量，其中，在添加3g/L乙酸后，TDΔβ的P3HB含量占细胞干重的94％，是目前为止世界上所有报道的最高含量。

[0189] 本实验的结果显示，通过删除微生物etf-β，结合添加乙酸，能够使得P3HB占细胞中的比重提高到高达94％，并且细胞体积也增大(参见图2)。

[0190] 三、构建工程菌TDΔα并测试乙酸对该重组菌合成P3HB的影响

[0191] 参照实施例2第一部分那样进行操作，敲除Halomonas bluephagenesis TD01中etf基因的etf-α亚基，构建得到工程菌Halomonas bluephagenesis TDΔα，并按实施例2第二部分那样进行实验和分析，以测定乙酸添加对P3HB合成的影响。

[0192] etf-α亚基的核苷酸序列为(SEQ ID NO：15)：

[0193]ATGAGTGAAATTATTCGCCGCGACCCACGTCGTGAGTGGATCGCCCGAAACCGTCTGCACCCCGACAACGCCGCGGTGCTGGCCGCTCTTGGTGTAAACAGGGGCGGCGGAGCGGTCAGCGAATGGGTGGGGCCCAACGGCGTGGTGCGTAAGAATCCTCGCGCTATTGGCTTTATCGGCCCCAATGGCGTTAAACGAATTGATCGTAGCGGCCTCCAGCAAGGAGGGCATTCCAGCGCGGCAACCGCCGTGGCTAGCGATAGCCGCCGTACAGTGACTATTGATCAGCCCGCTTTTCTAGTGGCCGGGGTACCTGACCTGATCGGTGGACGCCTTTCTAGCCATGATAAGGATCTGCTGGGACTAGCCAGACGCGTGGCGGATGCCGACGCCGAACAGCCAGGCGCCGTGGTGGCGATCCTGTTTGGTGAGCATAAAGGCGAGTGGGGCGGCGAGCTTAAGAAGCAAGCGCTGGGCGAAGCTGGGATTGATCGCGTCGTACATCTTGATGATGAGCTTTACGCTGGGTTTGCTCCCGAGGCACGGTTAGCGGTGTTAAGTGCCGTCGAACGGGAGATGACGCCGCGTTTCTGGCTGTTGCCGGATTCACCCCTAGGCGGAGCTGATCTGGGGCGGCGGCTTGCCTTACGCCTGGGTGAACGCGCTGCTACAGGGGTGTGGCAGATTGAAGCTGACGATGAGGCACCTCTGGGCTGGCAGTGCACTGCCCGTGGCGCCGCTGGAAGTTTGGATATCCAGCGCCCTCTGCCACGGGTTGCCCTGGCGTTGGCCGAGTGCGCCGAACCGGTGGACGAGACCCGACATGCGGCCGAACACCTGACCTTGGCAGCGTCCATTCCCACCACTCTATCGCGCATTGAAGATCTGGGTCAGGTGGCGGTGGATCCCGCTGGCGTGGCGTTGGCCGAGGCTGAGTTCATCCTCTCTGGTGGCAATGGTGTTAAACAGTGGGACGCCTTCCATCATGCCGCGAAAGTACTGGGCGCTACCGAAGGGGCCTCGCGTGTTGCGGTAGACGACGGCTTTATGGCCCGCGACCGGCAGGTAGGCGCGACCGGTACCTGGGTAACCGCCCGAGTCTATATGGCGGTGGGGATTTCAGGCGCTATCCAGCACCTGCAGGGCATTCAGCGCTGCGACAAGGTGGTGGCCATCAATCTCGATCCGGGGTGCGACATGATCgAACGCGCAGACCTGGCGGTGATAGGCGACAGCACGCAAATTCTTGCTGCGTTAGTGGCGATGGTGGAACAGCAGCGAGGAGGGCAGCGCGATGCGGCCTGA[0194] etf-α亚基的氨基酸序列为(SEQ ID NO：16)：

[0195]MSEIIRRDPRREWIARNRLHPDNAAVLAALGVNRGGGAVSEWVGPNGVVRKNPRAIGFIGPNGVKRIDRSGLQQGGHSSAATAVASDSRRTVTIDQPAFLVAGVPDLIGGRLSSHDKDLLGLARRVADADAEQPGAVVAILFGEHKGEWGGELKKQALGEAGIDRVVHLDDELYAGFAPEARLAVLSAVEREMTPRFWLLPDSPLGGADLGRRLALRLGERAATGVWQIEADDEAPLGWQCTARGAAGSLDIQRPLPRVALALAECAEPVDETRHAAEHLTLAASIPTTLSRIEDLGQVAVDPAGVALAEAEFILSGGNGVKQWDAFHHAAKVLGATEGASRVAVDDGFMARDRQVGATGTWVTARVYMAVGISGAIQHLQGIQRCDKVVAINLDPGCDMIERADLAVIGDSTQILAALVAMVEQQRGGQRDAA*

[0196] 结果发现，与原始菌株Halomonas bluephagenesis TD01相比，在相同的培养条件下，Halomonas bluephagenesis TDΔα同样显示出显著提高的P3HB含量，推测这是因为敲除etf-α亚基或者敲除etf-β亚基均导致etf基因的失活，因此对P3HB合成通路的影响基本相同。

[0197] 此外，添加一定浓度范围内的乙酸也同样能够提高该敲除菌株的细胞干重和P3HB含量，实验结果和趋势与Halomonas bluephagenesis TDΔβ基本一致。

[0198] 实施例3、通过在基础培养基中添加乙酸控制共聚物中单体的比例

[0199] 共聚物P3HB3HV和P3HB4HB的材料性能很大程度上取决于其中的单体比例，特别是对P3HB3HV而言。目前盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD生产共聚物最大的问题就是3HB单体比例高，而3HV和4HB的比例低。乙酸作为一种比葡萄糖还原性低的碳源，发明人考虑将乙酸和葡萄糖一起用来调节微生物的内部氧化还原环境，从而控制乙酰辅酶A的代谢流路径。具体来说，共聚物P3HB3HV和P3HB4HB都是二聚物，前者由3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)共聚而成，后者由3-羟基丁酸(3HB)和4-羟基丁酸(4HB)共聚而成。3HB是从乙酰辅酶A直接通过无氧发酵合成，而3HV和4HB都是通过是从乙酰辅酶A进入TCA循环产生的前体而来，因此，改变P3HB3HV和P3HB4HB中单体比例的关键就在于控制乙酰辅酶A的代谢路径。本实验证明通过在适当范围内改变乙酸的添加量，还能够调节共聚物P3HB3HV和P3HB4HB中单体的比例。

[0200] 一、通过改变添加乙酸浓度调节P3HB3HV中3HV的含量

[0201] 以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD08AB作为P3HB3HV合成菌株，该菌株记载在如下文献中：Yin J,Wang H,Fu X Z,et al.Effects of chromosomal gene copy number and locations on polyhydroxyalkanoate synthesis by Escherichia coli and Halomonas sp[J].Applied microbiology and biotechnology,2015,99(13):5523-5534.中，该菌能够利用葡萄糖作为单一碳源生产P3HB3HV。

[0202] 首先挑取单菌落在20mL的LB60(含有60g/L NaCl的LB)培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL MM60培养基(pH 8.5-9.0，NaCl浓度60g/L)，葡萄糖浓度设为30g/L，乙酸设置8个浓度梯度：0g/L，1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L。培养温度为37℃，设置转速为200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，然后通过气相色谱检测出细胞干重中聚合物的含量百分比(％)。每个条件设置三组平行。细胞干重、P3HB3HV含量以及3HV比例见表7。

[0203] 表7.Halomonas bluephagenesis TD08AB在不同乙酸浓度下合成P3HB3HV

[0204]

[0205]

[0206] 从表7的数据我们可以得出如下结论：通过添加1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L乙酸能够改变共聚物P3HB3HV的单体比例，特别是在添加1g/L和2g/L乙酸后，3HV单体比例与不添加乙酸时的结果相比提高了近一倍，这对材料性能的提升有非常显著的促进作用。此外，结果还显示，添加1-8g/L的乙酸能使细胞干重增加，使得最终获得的P3HB3HV产量相比无添加时也有显著提高(数据未示出)。

[0207] 二、通过改变添加乙酸浓度控制P3HB4HB中4HB的含量

[0208] 以盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2作为P3HB4HB合成菌，该菌株记载在如下文献中：Ye J,Hu D,Che X,et al.Engineering  of  Halomonas bluephagenesis for low cost production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-
hydroxybutyrate)from glucose[J].Metabolic engineering,2018,47:143-152.中，该菌能够利用葡萄糖作为单一碳源生产P3HB4HB，该菌株保存在清华大学，公众可由清华大学获得。

[0209] 首先挑取单菌落在20mL的LB60(含有60g/L NaCl的LB)培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL MM60培养基(pH 8.5-9.0，NaCl浓度60g/L)，葡萄糖浓度固定为30g/L，乙酸设置9个浓度梯度：0g/L，1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L，6g/L，7g/L，8g/L。培养温度为37℃，设置转速为200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，然后通过气相色谱检测出细胞干重中聚合物的含量百分比(％)。每个条件设置三组平行。细胞干重、P3HB4HB含量以及4HB比例见表8。

[0210] 表8.Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2在不同乙酸浓度下合成P3HB4HB[0211]

[0212]

[0213] 实验结果显示，添加乙酸同样可以提高共聚物P3HB4HB的细胞含量和产量，相比不添加乙酸的对照组(细胞干重：8.79±0.07g/L；P3HB4HB含量：66.89±0.37％)，在添加1g/L-8g/L乙酸的范围内，细胞干重和P3HB4HB含量均有提高，其中以添加6g/L乙酸时条件下的产量提高效果最为显著，其细胞干重测得为9.11±0.28g/L，P3HB4HB含量测得为69.91±1.93％。此外，从表8的数据我们还可以得出如下结论：通过添加乙酸能够改变共聚物P3HB4HB的单体比例，特别是在添加4g/L乙酸后，3HV单体比例提高了超过50％，这对材料性能的提升将有非常显著的促进作用。

[0214] 以上两组实验证明，本发明通过在基础培养基中添加适量乙酸，确实能够调节微生物细胞的内部环境，控制乙酰辅酶A进入3HV和4HB的代谢流，从而改变微生物合成的聚合物中各个单体的比例。在具体的实施方式中，本发明通过调节添加乙酸的浓度，可以显著提高3HV单体在P3HB3HV聚合物中的比例(从4％提高到8％)；还可以显著提高4HB单体在P3HB4HB聚合物中的比例(从7.8％提高到12％)。