脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法及其标准图谱

摘要

本发明公开了一种脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有25个共有峰。本发明质量检测方法方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得图谱特征峰多，通过标准指纹图谱共有峰的比较，可对脉络舒通丸的质量进行全面评价，有利于稳定产品质量，确保临床用药的安全性、有效性。

权利要求

1.一种脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

1)供试品溶液制备：取脉络疏通丸，加入甲醇，超声处理，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

2)供试品溶液进行HPLC色谱分析，记录色谱图；

3)标准指纹图谱制作。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤1)供试品溶液的制备：取脉络舒通丸，加入40％-70％甲醇，超声处理20min-

50min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

步骤2)HPLC分析，其色谱条件为：Kromasil C18柱，乙腈为流动相A，0.05％-0.2％磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式进行洗脱，检测波长：224nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃；

步骤3)标准指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对脉络舒通丸供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的供试品溶液，按如下步骤制备：精密称取脉络舒通丸，精密加入50％甲醇，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述流动相B为0.1％磷酸溶液。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述梯度洗脱为：

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件进行相似度评价。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，取2批或2批次以上脉络疏通丸按步骤1)制备供试品溶液，步骤2)进行HPLC色谱分析，步骤3)制作标准指纹图谱。

8.采用权利要求1-5中任一项所述方法建立的标准指纹图谱，其特征在于，所述标准指纹图谱有25个共有峰。

9.如权利要求8所述的标准指纹图谱，其特征在于，所述峰的相对保留时间tR依次分别为：0.119，0.131，0.144，0.188，0.321，0.671，0.801，1.000，1.051，1.073，1.206，1.280，

1.349，1.398，1.497，1.529，2.044，2.168，2.241，2.313，2.387，2.404，2.680，2.744，

2.790。

说明书

脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法及其标准图谱

技术领域

[0001] 本发明涉及一种复方中药脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法及其HPLC标准指纹图谱，属于中药制剂分析领域。

背景技术

[0002] 脉络舒通同系产品包括脉络舒通丸(浓缩丸))、脉络舒通颗粒、脉络舒通颗粒(无糖型等剂型，处方由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣、全蝎十二味中药精制而成，具有清热解毒，化瘀通络，祛湿消肿之功效，主要用于湿热瘀阻脉络所致的血栓性浅静脉炎，非急性期深静脉血栓形成所致的下肢肢体肿胀、疼痛、肤色暗红或伴有条索状物。

[0003] 脉络舒通同系产品处方来源于国医大师唐祖宣先生的临床验方，其在祖传验方的基础上，结合当归补血汤、芍药甘草汤、四妙勇安汤、止痉散等方衍化而来，其承袭了诸方之优点，弥补了原方之不足，相得益彰，左右兼顾。本方以黄芪、金银花为君药，益气利水、清热解毒、泻阴火、解肌毒、清秽恶、疗积毒；黄柏、苍术、薏苡仁、当归、白芍、玄参为臣药，清热祛湿、补血养血、缓急解挛、和营止痛、软坚散结、消肿解毒、使脉络通畅；水蛭、全蝎、蜈蚣为佐药，活血消瘀、攻毒散结、通络止痛；甘草为使药调和诸药。诸药配伍，共奏清热解毒、化瘀通络、利水消肿之功，药专力宏，取得较好效果。

[0004] 脉络舒通丸(浓缩丸)于2009年获得药品注册批件，脉络舒通颗粒于1998年获得新药证书(中药第三类新药)和生产批件脉络舒通颗粒(无糖型)于2012年获得药品补充申请批件，为国内独家生产，具有处方、工艺、用途等核心技术的自主知识产权。该产品上市填补了国内外中药治疗湿热瘀阻脉络药物的市场空白，是第一个批准用于血栓性浅静脉炎针对性治疗的中成药，目前仍是国内医药市场唯一批准对症治疗血栓性浅静脉炎的药物，适于血栓性浅静脉炎长期治疗，临床应用表明其疗效确切，深得医患好评，对治疗临床静脉血栓、血栓性浅静脉炎发挥了重要作用。

[0005] 即将于2019年1月1日施行的《中国药典》2015年版一部第一增补本中脉络舒通丸质量控制方法主要包括鉴别和含量测定，鉴别项采用显微鉴别法鉴别制剂中全蝎和蜈蚣，并采用薄层色谱法分别鉴别制剂中的当归、黄柏、玄参和水蛭药材，含量测定项以HPLC测定黄芪中黄芪甲苷含量、金银花中绿原酸含量。从处方组成可以发现，脉络舒通丸由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣、全蝎12味中药制成，但其质量标准仅用显微鉴别法或薄层色谱法鉴定其中几味原料药材，和以HPLC检测黄芪和金银花中的一个指标性成分的含量，以此来控制脉络舒通丸的质量不够全面、准确。

[0006] 中药指纹图谱作为一项质量控制技术，能够较为全面的控制药品的质量，具有系统性、整体性特点。目前，以指纹图谱控制脉络舒通丸的质量，国内外尚未见专利公开及文献报道。本发明公开了一种脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法，以及用该方法制作的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱。在用相似度进行评价的情况下，可用其标准指纹图谱对脉络舒通丸的质量进行全面地评价和控制，从而保证了产品质量的稳定性及临床用药的有效性与安全性。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对现有脉络舒通丸质量控制方法的不足，提供一种脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法及用该方法所得的HPLC标准指纹图谱。其特点是将脉络舒通丸制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，获得脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，从而为脉络舒通丸的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。

[0008] 本发明一种脉络舒通丸HPLC指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

[0009] 1)供试品溶液制备：取脉络疏通丸，加入甲醇，超声处理，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液；

[0010] 2)供试品溶液进行HPLC色谱分析，记录色谱图；

[0011] 3)标准指纹图谱制作。

[0012] 优选地，1)供试品溶液的制备：取脉络舒通丸，置具塞锥形瓶中，加入40％-70％甲醇，超声处理20min-50min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液；

[0013] 2)HPLC色谱条件：精密吸取供试品溶液，经HPLC分离检测，其中流动相的组成为乙腈：0.05％-0.2％磷酸溶液，采用梯度洗脱；

[0014] 3)指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对脉络舒通丸样品进行分析，得HPLC色谱图，对色谱图进行比较，得到由样品共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱。

[0015] 进一步优选地，供试品溶液具体按如下步骤制备：精密称取脉络舒通丸1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

[0016] 所述的HPLC色谱条件为：Kromasil C18柱，填料粒径5μm，柱长250mm，柱内径4.6mm；流动相：乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：

[0017]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-40 5％→20％ 95％→80％
40-60 20％→40％ 80％→60％

[0018] 检测波长：224nm；流速：1ml/min；柱温：30℃。

[0019] 按上述色谱条件对2批或2批以上脉络舒通丸样品进行分析，本发明中通过对12批脉络舒通丸样品进行分析，得到12批样品的HPLC色谱图，对12批样品的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱。

[0020] 本发明还提供了由上述方法得到的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，具体步骤是将12批脉络舒通丸样品按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱。

[0021] 所述脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱有25个共有峰，其相对保留时间tR依次分别为：0.119，0.131，0.144，0.188，0.321，0.671，0.801，1.000，1.051，1.073，1.206，1.280，1.349，1.398，1.497，1.529，2.044，2.168，2.241，2.313，2.387，2.404，2.680，2.744，
2.790。

[0022] 与现有技术相比，本发明技术方案具有预料不到的技术效果。本发明提供的脉络舒通丸HPLC指纹图谱建立方法精密度高、重新性好，通过对比所得指纹图谱中共有峰的有无，可对脉络舒通丸的质量进行全过程评价，有效地保证了成品的质量，可克服现有技术检测指标单一，不能反映内在质量的缺点。此外，本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了良好的基线分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价脉络舒通丸的质量，适用于对脉络舒通丸真伪鉴别和产品质量的控制。

附图说明

[0023] 图1为脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱(1-25为25个共有峰)；

[0024] 图2为12批脉络舒通丸的HPLC指纹图谱叠加图。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。

[0026] 实施例1脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱的建立

[0027] 1仪器与试药

[0028] 1.1仪器

[0029] Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，Agilent Open Lab色谱工作站。

[0030] 1.2试药

[0031] 脉络舒通丸由鲁南厚普制药有限公司提供，见表1；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0032] 表1脉络舒通丸测试样品批号

[0033]

[0034] 2方法与结果

[0035] 2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0036]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-40 5％→20％ 95％→80％
40-60 20％→40％ 80％→60％

[0037] 检测波长：224nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

[0038] 2.2供试品溶液的制备：精密称取脉络舒通丸1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理40min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

[0039] 2.3指纹图谱的建立

[0040] 测定12个批号脉络舒通丸HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱(参见附图1、2)，其中以8号绿原酸峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间tR分别：0.119，0.131，0.144，0.188，0.321，0.671，0.801，1.000，1.051，1.073，1.206，1.280，1.349，1.398，1.497，
1.529，2.044，2.168，2.241，2.313，2.387，2.404，2.680，2.744，2.790。其中，8号峰为绿原酸，15号峰为芍药苷，23号峰为小檗碱。

[0041] 将12个批号脉络舒通丸HPLC指纹图谱导入药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，进行色谱峰匹配，以8号绿原酸峰为参照确定25个共有峰为构成脉络舒通丸指纹图谱的特征峰，样品共有峰的相对保留时间见表2，20批脉络舒通丸共有峰的相对峰面积见表3。12批脉络舒通丸与标准指纹图谱相似度计算结果依次为：0.987，0.992，0.978，0.993，0.976，0.989，0.997，0.969，0.972，0.995，0.996，0.986。

[0042] 表2 12批脉络舒通丸共有峰的相对保留时间(tR)

[0043]

[0044] 表3 12批脉络舒通丸共有峰的相对峰面积(S)

[0045]

[0046]

[0047] 2.4方法学考察

[0048] 2.4.1精密度试验

[0049] 取07217001批样品，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以8号峰为参照峰，计算出1～25号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。

[0050] 2.4.2稳定性试验

[0051] 取07217001批样品，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，24h进样，以8号峰为参照峰，计算出1～25号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在
24小时内稳定。

[0052] 2.4.3重现性试验

[0053] 取07217001批样品，分别精密称取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以8号峰为参照峰，计算出1～25号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。

[0054] 实施例2脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱的建立

[0055] 1仪器与试药

[0056] 1.1仪器

[0057] Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，Agilent Open Lab色谱工作站。

[0058] 1.2试药

[0059] 脉络舒通丸由鲁南厚普制药有限公司提供，见表4；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0060] 表4脉络舒通丸测试样品批号

[0061]

[0062] 2方法与结果

[0063] 2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.05％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0064]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-40 5％→20％ 95％→80％
40-60 20％→40％ 80％→60％

[0065] 检测波长：224nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

[0066] 2.2供试品溶液的制备：精密称取脉络舒通丸1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入40％甲醇25ml，超声处理20min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

[0067] 2.3指纹图谱的建立

[0068] 测定12个批号脉络舒通丸HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，其中以8号绿原酸峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间tR分别：0.120，0.132，0.143，0.187，0.320，0.672，0.799，1.000，1.052，1.074，1.207，1.281，1.350，1.399，1.496，1.528，2.043，2.167，
2.240，2.312，2.386，2.403，2.680，2.743，2.791。其中，8号峰为绿原酸，15号峰为芍药苷，
23号峰为小檗碱。

[0069] 实施例3脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱的建立

[0070] 1仪器与试药

[0071] 1.1仪器

[0072] Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，Agilent Open Lab色谱工作站。

[0073] 1.2试药

[0074] 脉络舒通丸由鲁南厚普制药有限公司提供，见表5；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0075] 表5脉络舒通丸测试样品批号

[0076]

[0077] 2方法与结果

[0078] 2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0079]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-40 5％→20％ 95％→80％
40-60 20％→40％ 80％→60％

[0080] 检测波长：224nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

[0081] 2.2供试品溶液的制备：精密称取脉络舒通丸1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，超声处理50min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

[0082] 2.3指纹图谱的建立

[0083] 测定12个批号脉络舒通丸HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，其中以8号绿原酸峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间tR分别：0.118，0.129，0.144，0.187，0.320，0.669，0.803，1.000，1.054，1.076，1.205，1.281，1.350，1.399，1.496，1.528，2.045，2.169，
2.240，2.312，2.386，2.404，2.681，2.742，2.789。其中，8号峰为绿原酸，15号峰为芍药苷，
23号峰为小檗碱。

[0084] 实施例4脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱的建立

[0085] 1仪器与试药

[0086] 1.1仪器

[0087] Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，Agilent Open Lab色谱工作站。

[0088] 1.2试药

[0089] 脉络舒通丸由鲁南厚普制药有限公司提供，见表6；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0090] 表6脉络舒通丸测试样品批号

[0091]

[0092] 2方法与结果

[0093] 2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.17％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0094]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-40 5％→20％ 95％→80％
40-60 20％→40％ 80％→60％

[0095] 检测波长：224nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

[0096] 2.2供试品溶液的制备：精密称取脉络舒通丸1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入55％甲醇25ml，超声处理36min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

[0097] 2.3指纹图谱的建立

[0098] 测定12个批号脉络舒通丸HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，其中以8号绿原酸峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间tR分别：0.119，0.130，0.146，0.187，0.320，0.670，0.803，1.000，1.048，1.072，1.205，1.281，1.350，1.399，1.496，1.527，2.043，2.165，
2.240，2.311，2.385，2.402，2.679，2.742，2.789。其中，8号峰为绿原酸，15号峰为芍药苷，
23号峰为小檗碱。

[0099] 实施例5脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱的建立

[0100] 1仪器与试药

[0101] 1.1仪器

[0102] Agilent 1100高效液相色谱仪(美国)：DAD检测器，四元低压梯度泵，Agilent Open Lab色谱工作站。

[0103] 1.2试药

[0104] 脉络舒通丸由鲁南厚普制药有限公司提供，见表7；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

[0105] 表7脉络舒通丸测试样品批号

[0106]

[0107] 2方法与结果

[0108] 2.1色谱条件：色谱柱：天津特纳Kromasil C18(4.6x250mm，5um)柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.14％磷酸水溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

[0109]时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0-40 5％→20％ 95％→80％
40-60 20％→40％ 80％→60％

[0110] 检测波长：224nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl。

[0111] 2.2供试品溶液的制备：精密称取脉络舒通丸1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入62％甲醇25ml，超声处理45min，放冷，滤过，取续滤液即得供试品溶液。

[0112] 2.3指纹图谱的建立

[0113] 测定12个批号脉络舒通丸HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的脉络舒通丸HPLC标准指纹图谱，其中以8号绿原酸峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的25个共有峰的相对保留时间tR分别：0.117，0.130，0.142，0.189，0.322，0.672，0.803，1.000，1.054，1.074，1.205，1.279，1.348，1.397，1.496，1.527，2.046，2.167，
2.243，2.312，2.386，2.402，2.682，2.742，2.788。其中，8号峰为绿原酸，15号峰为芍药苷，
23号峰为小檗碱。

[0114] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。