一种加快伤口愈合的组合物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种加快伤口愈合的组合物及其制备方法，属于伤口愈合技术领域。本发明提供了加快伤口愈合的组合物，其成分包括EGCG、乙酸钠、抗坏血酸、明胶和壳聚糖。所述加快伤口愈合组合物的制备方法包括：用乙酸钠缓冲液配制明胶缓冲溶液与壳聚糖缓冲溶液，膜过滤；将EGCG和抗坏血酸溶解于壳聚糖缓冲溶液中，再逐滴加入到明胶缓冲溶液中，搅拌、离心处理，取离心后的固体部分、冷冻干燥，得到所述的加快伤口愈合的组合物。本发明促进伤口愈合的组合物较EGCG水溶液可以显著促进糖尿病小鼠伤口的愈合，有很大的提高，具有极大的潜在伤口愈合的应用价值。

权利要求

1.一种加快伤口愈合的组合物，其特征在于：所述加快伤口愈合组合物的组分包括EGCG，乙酸钠、抗坏血酸、明胶和壳聚糖；

所述加快伤口愈合组合物的制备方法包括如下步骤：①制备浓度为0.1 0.3mol/L的乙酸钠溶液，并调整其pH为5.0 5.4，得到乙酸钠缓冲~ ~液；

②用所述乙酸钠缓冲液配制0.1 0.3％明胶缓冲溶液与0.1 0.3％壳聚糖缓冲溶液，并~ ~用0.22 0.45μm有机系滤膜除去两种溶液中不溶杂质；

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③按照EGCG含量3 4.5mg/mL，抗坏血酸含量0.02 0.03mg/mL的终浓度，将EGCG和抗坏~ ~血酸溶解于壳聚糖缓冲溶液中，得到混合溶液，完全溶解后将所述混合溶液逐滴加入到所述0.1 0.3％明胶缓冲溶液中，两者混合均匀后搅拌处理，完全混合后得到悬浮液；

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④将所述悬浮液在4±2℃的条件下，以13000±2000 r/min的条件离心20 60分钟，取~离心后的固体部分；

⑤将离心后的固体部分冷冻干燥，得到所述加快伤口愈合的组合物。

2.一种加快伤口愈合组合物的制备方法，其特征在于：所述加快伤口愈合组合物的制备方法包括如下步骤：①制备浓度为0.1 0.3mol/L的乙酸钠溶液，并调整其pH为5.0 5.4，得到乙酸钠缓冲~ ~液；

②用所述乙酸钠缓冲液配制0.1 0.3％明胶缓冲溶液与0.1 0.3％壳聚糖缓冲溶液，并~ ~用0.22 0.45μm有机系滤膜除去两种溶液中不溶杂质；

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③按照EGCG含量3 4.5mg/mL，抗坏血酸含量0.02 0.03mg/mL的终浓度，将EGCG和抗坏~ ~血酸溶解于壳聚糖缓冲溶液中，得到混合溶液，完全溶解后将所述混合溶液逐滴加入到所述0.1 0.3％明胶缓冲溶液中，两者混合均匀后搅拌处理，完全混合后得到悬浮液；

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④将所述悬浮液在4±2℃的条件下，以13000±2000 r/min的条件离心20 60分钟，取~离心后的固体部分；

⑤将离心后的固体部分冷冻干燥，得到所述加快伤口愈合的组合物。

3.根据权利要求2所述的加快伤口愈合组合物的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥的条件为在-70 -10℃的条件下常压冷冻干燥或真空冷冻干燥。

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4.根据权利要求2所述的加快伤口愈合组合物的制备方法，其特征在于：所述步骤③中搅拌处理具体是在转速为300±50r/min的条件下搅拌20 50min。

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5.根据权利要求2所述的加快伤口愈合组合物的制备方法，其特征在于：所述混合溶液逐滴加入到所述0.1 0.3％明胶缓冲溶液中，具体混合条件为：按照体积比，所述混合溶液：~

所述明胶缓冲溶液=1:1。

6.根据权利要求2所述的加快伤口愈合组合物的制备方法，其特征在于：所述混合溶液逐滴加入的速度为0.5 1mL/min。

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7.根据权利要求2所述的加快伤口愈合组合物的制备方法，其特征在于：所述将EGCG和抗坏血酸溶解于壳聚糖缓冲溶液中具体采用超声辅助溶解。

说明书

一种加快伤口愈合的组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于伤口愈合的组合物技术领域，涉及一种加快伤口愈合的组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 伤口愈合是一个复杂的生物学过程，有多种细胞和组织成分参与，包括成纤维细胞增殖、胶原分泌、新血管生成、表皮细胞增殖和伤口的再上皮化等。与非糖尿病人相比，糖尿病患者伤口部位的炎性反应细胞浸润相对较晚、浸润时间长且功能异常，使得伤口局部处于慢性炎症反应状态，难以向伤口愈合的后期过渡。糖尿病足是糖尿病的严重慢性并发症之一。糖尿病足的伤口难以愈合，这可能导致糖尿病患者截肢甚至死亡。因此，理想的伤口愈合组合物可以加速伤口愈合，减轻糖尿病患者的痛苦并降低治疗费用。

[0003] EGCG（Epigallocatechin gallate）即表没食子儿茶素没食子酸酯，是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用。但是EGCG本身容易受外界环境影响，在强酸、强碱、光照和高热条件下不稳定，这些因素限制了EGCG的应用。

[0004] 目前，虽然EGCG已被证明具有加速糖尿病伤口愈合的作用，但是EGCG的水溶液加速糖尿病伤口愈合的效率不高，其效率还有待提高。

发明内容

[0005] 为了解决EGCG促伤口愈合效率不高，本发明提供一种加快伤口愈合的组合物，所述组合物的组分包括EGCG，乙酸钠、抗坏血酸、明胶和壳聚糖。

[0006] 本发明加快伤口愈合组合物的制备方法包括如下步骤：

[0007] ①制备浓度为0.1 0.3mol/L的乙酸钠溶液，并调整其pH为5.0 5.4，得到乙酸钠缓~ ~冲液。

[0008] ②用所述乙酸钠缓冲液配制0.1 0.3％明胶缓冲溶液与0.1 0.3％壳聚糖缓冲溶~ ~液，并用0.22 0.45μm的有机系滤膜除去两种溶液中不溶杂质。
~

[0009] ③按照EGCG含量3 4.5mg/mL，抗坏血酸含量0.02 0.03mg/mL的终浓度，将EGCG和~ ~抗坏血酸溶解于壳聚糖缓冲溶液中，得到混合溶液，完全溶解后将所述混合溶液按照体积比1:1的比例逐滴加入到所述0.1 0.3％明胶缓冲溶液中，两者混合均匀后搅拌处理，完全~
混合后得到悬浮液。

[0010] ④将所述悬浮液用低温高速离心机在4±2℃的条件下，以13000±2000 r/min的条件离心20 60分钟，取离心后的固体部分。~

[0011] ⑤将离心后的固体部分冷冻干燥，得到本发明所述的加快伤口愈合的组合物。

[0012] 其中，所述冷冻干燥的条件为在-70 -10℃的条件下常压冷冻干燥或真空冷冻干~燥。

[0013] 其中，所述步骤③中搅拌处理具体是在转速为300±50r/min的条件下搅拌20~50min。

[0014] 其中，所述混合溶液按照1:1逐滴加入到所述0.1 0.3％明胶缓冲溶液中。~

[0015] 其中，所述混合溶液逐滴加入的速度为0.5 1mL/min。~

[0016] 其中，所述将EGCG和抗坏血酸溶解于壳聚糖缓冲溶液中具体采用超声辅助溶解。

[0017] 有益效果:

[0018] 我们通过离子交联制备了带正电的EV纳米粒，并在EV NPS中封装EGCG，得到本发明的促进伤口愈合的组合物，其中，EGCG的封装率为68.39±2.60％，而不加抗坏血酸，采用同样的方法，其EGCG的封装率只有不到30%，其促进伤口愈合的效果和纯品EGCG或者EGCG水溶液差不多。

[0019] 本发明制备的促进伤口愈合的组合物具有均匀的粒径，均匀的分布且没有明显的聚集。其中含有极少量的抗坏血酸，正是由于抗坏血酸的添加，显著提高了本发明促进伤口愈合的组合物中EGCG的封装率，也就提高了促进伤口愈合的效果。动物实验表明，本实施例制备的加快伤口愈合的组合物封装EGCG的封装率很高时，可以显著加快糖尿病小鼠伤口的愈合速度，封装率越低，其加速效果越差。而单独的抗坏血酸对糖尿病伤口愈合没有作用。

[0020] 分析本发明加快伤口愈合的机理，其可能是通过增加胶原蛋白的积累，促进血管生成和减少糖尿病小鼠伤口的炎性细胞浸润。本发明促进伤口愈合的组合物对糖尿病小鼠伤口愈合的作用显著优于空载组和EGCG组。本发明促进伤口愈合的组合物可以显著促进糖尿病小鼠伤口的愈合，具有极大的潜在伤口愈合的应用价值。该组合物具有缓释作用，使得EGCG发挥作用的时间变长，而EGCG溶液容易受外界环境的影响变化。

[0021] 附图说明：

[0022] 图1不同组小鼠在不同日期伤口愈合的图像。

[0023] 图2不同组不同时间小鼠的伤口愈合率柱状图。

[0024] 图3第五天和第十天各组皮肤伤口的HE染色的代表性图像。

[0025] 图4第五天和第十天各组Masson皮肤三色染色的代表性图像。

[0026] 图5第五天和第十天各组的免疫组织化学染色图像。

具体实施方式

[0027] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，实施例中EGCG购买自江苏徳和生物科技有限公司，纯度98%以上，其他试剂均为分析纯。

[0028] 实施例1

[0029] 本实施例提供了一种加快伤口愈合的组合物，其主要成分包括乙酸钠、抗坏血酸、明胶和壳聚糖，其制备方法如下：

[0030] 1、用无水乙酸钠溶解于超纯水中，制备成0.2mol/L的乙酸钠溶液，并用盐酸或氢氧化钠将乙酸钠溶液的pH调整为5.4，得到乙酸钠缓冲液。

[0031] 2、分别将明胶与壳聚糖溶解于酸钠缓冲液中，配制成0.1％明胶缓冲溶液与0.1％壳聚糖缓冲溶液，并用0.45μm有机系滤膜除去两种溶液中不溶杂质。

[0032] 3、分别称取30mg的EGCG和0.2mg抗坏血酸，超声溶解于10mL的0.1％壳聚糖缓冲溶液中，待完全溶解后缓慢滴入10mL的0.1％明胶缓冲溶液中，滴加速度在0.5 1mL/min之间。~
两者混合均匀后继续磁力搅拌30min,转速为300r/min，完全混合后得到悬浮液。其中，超声功率在20 40kHz范围内。
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[0033] 4、将所述悬浮液用低温高速离心机在4±2℃的条件下，以13000 r/min的条件离心30分钟，取离心后的固体部分。

[0034] 5、将离心后的固体部分在-18℃的条件下冷冻干燥，得到本发明所述的加快伤口愈合的组合物。

[0035] 发明人对上述组合物做了动物实验，具体方法如下。

[0036] 1)糖尿病模型的建立

[0037] 雄性ICR小鼠30只，体重28-30克，八周龄，由浙江维通利华有限责任公司提供。安置在SPF级动物房，环境温度25±2℃，相对湿度为70-80%，12小时光照，12小时黑暗条件适应性饲养一周。于实验前一天晚上禁食不禁水12小时。测体重及空腹血糖，单次腹腔注射STZ溶液（120 mg/kg）。空白对照组按体重注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。确定糖尿病模型前晚上禁食不禁水12小时。血糖值超过11.1mmol/L的小鼠视为造糖尿病模型成功。将造模成功的小鼠随机分组稳定两天后进行皮肤伤口的造模。

[0038] 2)建立皮肤伤口模型

[0039] 将小鼠分为五组，分别是：空白对照组（Control）、模型组（Model）、空载组（No-load NPS）、EGCG组（EGCG）、本实施例组合物组（EV NPS）。

[0040] 空白对照组：采用的小鼠为非糖尿病正常小鼠，用0.9%生理盐水擦拭伤口。

[0041] 模型组：采用的小鼠为患有糖尿病的小鼠，用0.9%生理盐水擦拭伤口。

[0042] 空载组：采用的小鼠为患有糖尿病的小鼠，用等量的不添加EGCG的本实施例方法制备的明胶、壳聚糖混悬液擦拭伤口。

[0043] EGCG组：采用的小鼠为患有糖尿病的小鼠，用等量的10mg/ml EGCG溶液擦拭伤口。

[0044] 本实施例组合物组：采用的小鼠为患有糖尿病的小鼠，用等量的，本实施例制备的EGCG当量与EGCG组相同的加快伤口愈合的组合物的溶液擦拭伤口。

[0045] 所有的小鼠经10%水合氯醛（0.004ml/g）腹腔注射麻醉后，将背毛用脱毛膏除去，用打孔器制造两个圆形对称的6mm伤口，将小鼠单笼饲养。用数码相机拍照并记录初始创口面积，记为0D。每天给药一次，共计十天。在2D，4D，6D，8D，10D拍照，计算愈合率及记录愈合情况。在5D和10D各解剖三只，将背部伤口皮肤剪下，放置在4%的福尔马林中，固定24小时以上，用石蜡包埋并切片。

[0046] 图2中，数据表示为平均值±SEM（n = 6）。＃与对照组有显着差异（P <0.05）。 *与模型组有显着差异（P <0.05）。 ☆No-load NPS组有显着差异（P <0.05）。●与EGCG组有显着差异（P <0.05）。

[0047] 连续10天监测伤口，如图1和图2所示。结果显示，与其他组相比，本实施例组合物组的伤口面积明显减少。伤口愈合的百分比如图1所示。从2D到8D，本实施例组合物组的伤口愈合率显着高于模型组，空载组和EGCG组（所有P <0.001）。从2D到8D，模型组的伤口愈合率与对照组相比有显着差异（P <0.05或P <0.001）。这表明糖尿病确实可以延迟伤口的愈合。我们知道，EGCG可以加速糖尿病伤口的愈合，我们的研究证实了这一点。但本实施例组合物组对伤口愈合的作用显著高于EGCG组。简而言之，本实施例组合物组的伤口愈合效果非常好。

[0048] 图3中，（A）在第5天皮肤伤口的HE染色的代表性图像。（B）在第10天皮肤伤口的HE染色的代表性图像。放大倍数分别为40倍和100倍。

[0049] 对照组（非糖尿病组）的伤口在5D时显示出部分愈合。从组织学的角度，观察到肉芽组织的填充。在新组织形成阶段，成纤维细胞迁移到伤口，并转化为成肌纤维细胞，导致收缩和胶原蛋白沉积，形成肉芽组织。另外，伤口边缘的角质细胞高度增殖，覆盖伤口形成新的表皮，这就是伤口重新上皮形成。与对照组相比，模型组创面的肉芽组织少，仅浸润少量的上皮细胞和大量的炎性细胞。在无负荷NPS组中，伤口中形成了一些新的血管和表皮，并且伤口中的炎症细胞和成纤维细胞较少。在EGCG组中，伤口中存在少量炎性细胞，真皮开始向伤口中心生长。本实施例组合物组的新生血管更丰富，肉芽组织更厚，炎性细胞更少，伤口易于愈合。第十天，对照组伤口基本愈合。新血管丰富，成纤维细胞排列整齐，但仍有炎性细胞浸润。模型组仍有大量炎性细胞浸润，肉芽组织和表皮未完全形成。与空载组相比，新血管很少。同时，空载组的伤口已愈合。但是炎性细胞的数量很大，成纤维细胞排列整齐，表皮已经愈合。在EGCG组中，表皮较薄，形成了一些新血管。存在炎性细胞的浸润，并且部分形成了毛囊和其他皮肤附着物。本实施例组合物组的上皮细胞完全再生，并且上皮细胞较厚。形成了更多的新血管，毛囊和其他皮肤附件。简而言之，本实施例组合物组的伤口愈合效果优于其他组。

[0050] 图4中，（A）：第5天Masson皮肤三色染色的代表性图像。（B）：第10天Masson伤口皮肤的三色染色的代表性图像。放大倍数分别为40倍和100倍。（C）：量化Masson三色染色切片中胶原蛋白沉积的平均面积百分比。＃与对照组有显着差异（P <0.05）。*与模型组有显着差异（P <0.05）。☆与空载组明显不同（P <0.05）。 ●与EGCG组有显着差异（P <0.05）。

[0051] 图4为用Masson染色观察胶原的沉积情况。在伤口愈合过程中，成纤维细胞通过沉积和降解胶原蛋白分子使胶原蛋白纤维有序排列，从而重建拼贴的真皮结构。研究表明，糖尿病伤口的愈合受许多生理因素的影响，例如胶原蛋白沉积减少，新肉芽组织数量减少，成纤维细胞迁移和增殖减少。第5天，对照组，无负荷NPS组和EGCG组胶原沉积量明显高于模型组（P <0.001）。本实施例组合物组的胶原蛋白沉积量更多，明显高于模型组，无负荷NPS组和EGCG组（P <0.001或P <0.05）。 EGCG组倾向于有序排列，但两者之间无显着性差异（P> 0.05）。本实施例组合物组的伤口愈合良好，胶原纤维以深蓝色排列，并且空载组和EGCG组的胶原沉积差异显着（均P <0.001）。简而言之，实施例制备的加快伤口愈合的组合物可增加伤口中的胶原蛋白沉积。

[0052] 图5中，（A）：5D和10D的免疫组织化学染色图像，皮肤伤口中的巨噬细胞（F4 / 80）为棕色，细胞核用苏木精染色。放大倍数是200倍。（B）：F4 / 80免疫染色面积的平均面积％的定量。＃与对照组有显着差异（P <0.05）。*与模型组有显着差异（P <0.05）。☆与No-load NPS组有显著差异（P <0.05）。●与EGCG组有显着差异（P <0.05）。

[0053] 由图5可以看出，炎性细胞随时间逐渐减少。在5D和10D时，模型组的炎性细胞数量明显高于对照组（P <0.05或P <0.01）。空载组的炎症细胞明显低于模型组（P <0.001）。然而，在10天时，EGCG组的炎症细胞明显多于无负荷NPS组（P <0.05）。在第5天和第10天，本实施例组合物组的炎性细胞浸润明显低于模型组，空载组和EGCG组（P <0.001，P <0.01）。结果表明，实施例制备的加快伤口愈合的组合物可以显着减少糖尿病小鼠伤口中的炎性细胞数量。

[0054] 实施例2

[0055] 本实施例提供了一种加快伤口愈合的组合物，其主要成分包括乙酸钠、抗坏血酸、明胶和壳聚糖，其制备方法如下：

[0056] 1、用无水乙酸钠溶解于超纯水中，制备成0.3mol/L的乙酸钠溶液，并用盐酸或氢氧化钠将乙酸钠溶液的pH调整为5.0，得到乙酸钠缓冲液。

[0057] 2、分别将明胶与壳聚糖溶解于酸钠缓冲液中，配制成0.3％明胶缓冲溶液与0.3％壳聚糖缓冲溶液，并用0.22μm有机系滤膜除去两种溶液中不溶杂质。

[0058] 3、分别称取30mg的EGCG和0.2mg抗坏血酸，超声溶解于10mL的0.3％壳聚糖缓冲溶液中，待完全溶解后缓慢滴入10mL的0.3％明胶缓冲溶液中，滴加速度在0.5 1mL/min之间。~
两者混合均匀后继续磁力搅拌50min,转速为350r/min，完全混合后得到悬浮液。其中，超声功率在20 40kHz范围内。
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[0059] 4、将所述悬浮液用低温高速离心机在4±2℃的条件下，以15000 r/min的条件离心20分钟，取离心后的固体部分。

[0060] 5、将离心后的固体部分在-10℃的条件下冷冻干燥，得到本发明所述的加快伤口愈合的组合物。

[0061] 实施例3

[0062] 本实施例提供了一种加快伤口愈合的组合物，其主要成分包括乙酸钠、抗坏血酸、明胶和壳聚糖，其制备方法如下：

[0063] 1、用无水乙酸钠溶解于超纯水中，制备成0.1mol/L的乙酸钠溶液，并用盐酸或氢氧化钠将乙酸钠溶液的pH调整为5.2，得到乙酸钠缓冲液。

[0064] 2、分别将明胶与壳聚糖溶解于酸钠缓冲液中，配制成0.2％明胶缓冲溶液与0.2壳聚糖缓冲溶液，并用0.45μm有机系滤膜除去两种溶液中不溶杂质。

[0065] 3、分别称取45mg的EGCG和0.3mg抗坏血酸，超声溶解于10mL的0.2％壳聚糖缓冲溶液中，待完全溶解后缓慢滴入10mL的0.2％明胶缓冲溶液中，滴加速度在0.5 1mL/min之间。~
两者混合均匀后继续磁力搅拌20min,转速为250r/min，完全混合后得到悬浮液。其中，超声功率在20 40kHz范围内。
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[0066] 4、将所述悬浮液用低温高速离心机在4±2℃的条件下，以11000 r/min的条件离心60分钟，取离心后的固体部分。

[0067] 5、将离心后的固体部分在-70℃的条件下冷冻干燥，得到本发明所述的加快伤口愈合的组合物。