一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物

摘要

本发明公开了一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物，包括，地骨皮烘干至水分含量为不超过0.6％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系，超声提取后，提取液抽滤，静置分层后，取上相，即得地骨皮多酚提取物。本发明采用双水相体系萃取提取法与同条件传统提取法相比可以有效提高地骨皮多酚得率，成相剂易于回收利用，降低了有机溶剂消耗，地骨皮多酚提取物通过大孔树脂吸附、浓缩过C18柱，取第0.7～2.5个柱体积洗脱液旋干获得的浓缩物，其质量浓度为30μg/L时，对ABTS〃的清除率达41.2～44.3％。

权利要求

1.一种地骨皮中多酚的提取方法，其特征在于：包括，原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.6%以下，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系，超声提取后，提取液抽滤，静置分层后，取上相，即得地骨皮多酚提取物；

大孔树脂吸附：将地骨皮多酚提取物减压旋蒸浓缩，加水复溶，过D101树脂，1 2个柱体~

积的水洗后用15 30%乙醇洗脱，得洗脱液；

~

浓缩过C18柱：将过D101树脂洗脱液减压旋蒸浓缩，加80%甲醇复溶，依次以1.2个柱体积的0.1%的TFA：乙腈体积比85：15混合溶液和1.3个柱体积乙腈为流动相，过C18柱，取第

0.7 2.5柱体积的洗脱液，旋干，即得地骨皮多酚浓缩物；

~

其中，地骨皮多酚浓缩物在质量浓度为30μg/L时，对ABTS·的清除率达41.2 44.3%；

~

其中，所述乙醇溶液，其质量分数为32 44%；所述地骨皮粉末与乙醇溶液质量比为1：20~

35；所述硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.13g/g；

~

所述形成混合溶液体系，其中，溶液pH为5.72；

超声温度为55℃，超声功率为220W，超声时间为50min。

2.如权利要求1所述地骨皮中多酚的提取方法，其特征在于：所述大孔树脂吸附，其中，减压旋蒸浓缩压力为‑0.1MPa ，温度为30 55℃；所述加水复溶，水与对应生料的质量比1:1~

3。

~

3.如权利要求1所述地骨皮中多酚的提取方法，其特征在于：所述浓缩过C18柱，其中，减压旋蒸浓缩压力为‑0.1MPa ，温度为30 55℃；所述加80%甲醇复溶，浓缩物与溶液质量比~

1:2 4。

~

4.一种如权利要求1 3中任一地骨皮中多酚的提取方法制得的地骨皮多酚提取物，其~

特征在于：所述地骨皮多酚提取物，其中，地骨皮多酚不低于14.55mg/g。

说明书

一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物

技术领域

[0001] 本发明属于地骨皮活性物质提取技术领域，具体涉及到一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物。

背景技术

[0002] 地骨皮为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)干燥根皮，可凉血除蒸，清肺降火。用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，肺热咳嗽，内热消渴等，也
是当前法律允许使用的保健品原料之一。国内外的研究表明其富含的生物碱和多酚类物
质，具有良好的清除自由基能力。

[0003] 目前，常见的地骨皮提取技术包括回流提取法、表面活性剂辅助超声波法、微波法和超临界流体法等，但这些方法存在能耗大、易污染环境或设备要求高等问题。

[0004] 因此，本领域亟需一种提取地骨皮中多酚的方法，在避免传统工艺能耗大、易污染环境同时，且工艺简单，能适合工业化生产。

发明内容

[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部
分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

[0006] 鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

[0007] 因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种地骨皮中多酚的提取方法。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种地骨皮中多酚的提取方法，包括，

[0009] 原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.6％以下，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0010] 地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系，超声提取后，提取液抽滤，静置分层后，取上相，即得地骨皮多酚提取物。

[0011] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述乙醇溶液，其质量分数为32～44％。

[0012] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述地骨皮粉末与乙醇溶液质量比为1：20～35。

[0013] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.11～0.19g/g。

[0014] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述超声提取，其中，超声温度为25～65℃，超声功率为220W，超声时间为20～60min。

[0015] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述形成混合溶液体系，其中，溶液pH为3.77～5.72。

[0016] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述地骨皮中多酚的提取方法，还包括，

[0017] 大孔树脂吸附：将地骨皮多酚提取物减压旋蒸浓缩，加水复溶，过D101树脂，以1～2个柱体积的水洗后用15～30％乙醇洗脱，得洗脱液；

[0018] 浓缩过C18柱：将过D101树脂洗脱液减压旋蒸浓缩，加80％甲醇复溶，依次以1.2个柱体积的0.1％的TFA：乙腈体积比85：15混合溶液和1.3个柱体积乙腈为流动相，过C18柱，
取第0.7～2.5柱体积的洗脱液，旋干，即得地骨皮多酚浓缩物，其中，地骨皮多酚浓缩物在
质量浓度为30μg/L时对ABTS〃的清除率达41.2～44.3％。

[0019] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述大孔树脂吸附，其中，减压旋蒸浓缩压力为‑0.1MPa，温度为30～55℃；所述加水复溶，水与对应生料
的质量比1:1～3。

[0020] 作为本发明所述地骨皮中多酚的提取方法的一种优选方案，其中：所述浓缩过C18柱，其中，减压旋蒸浓缩压力为‑0.1MPa，温度为30～55℃；所述加80％甲醇复溶，浓缩物与
溶液质量比1:2～4。

[0021] 本发明另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种地骨皮中多酚提取物。

[0022] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种地骨皮中多酚的提取方法制得的地骨皮多酚提取物，所述地骨皮多酚提取物，其中，地骨皮多酚得率不低于
14.55mg/g。

[0023] 本发明有益效果：

[0024] (1)本发明提出一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物，采用双水相体系萃取提取法与同条件传统提取法相比可以有效提高地骨皮多酚得率，成相剂易于回
收利用，降低了有机溶剂消耗，符合绿色化学的发展理念；

[0025] (2)本发明优选提取工艺中料液比1：20，硫酸铵与乙醇溶液质量比为0.13，55℃下超声50min，上相多酚得率为17.88mg/g，同条件下非双水相体系得率为12.88mg/g。发明人
改变通过添加乙酸改变pH不利于地骨皮多酚的提取，可能由于pH太低，不利于将多酚以离
子形式溶解到溶剂中，且不同多酚的理化性质差异较大，为兼顾平衡、简化提取工艺、避免
有害废液的产生，因此本发明优选乙酸添加量为0，此时双水相pH为5.72，可获得较好的提
取效果。

[0026] (3)本发明将地骨皮多酚提取物通过大孔树脂吸附、浓缩过C18柱，取第0.7～2.5个柱体积洗脱液旋干获得的浓缩物，其质量浓度在30μg/L时，对ABTS〃的清除率达41.2～
44.3％。

附图说明

[0027] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本
领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它
的附图。其中：

[0028] 图1为本发明实施例9中双水相制得的地骨皮多酚提取物的(浓度0.4g/mL)HPLC图。

[0029] 图2为本发明实施例9中非双水相制得的地骨皮多酚提取物的(浓度0.4g/mL)HPLC图。

[0030] 图3为本发明实施例10中双水相制得的地骨皮多酚提取物P2A的HPLC图。

[0031] 图4为本发明实施例10中双水相制得的地骨皮多酚提取物P2B的HPLC图。

[0032] 图5为本发明实施例10中双水相制得的地骨皮多酚提取物P2C的HPLC图。

具体实施方式

[0033] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

[0034] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的
情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

[0035] 其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指
同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

[0036] 本发明中地骨皮，购自无锡市民大药房，产自甘肃；人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)，北京北纳创联生物技术研究院；硫酸铵，AR，国药集团；无水乙醇，AR，国药集团；抗坏血酸，
AR，国药集团；过硫酸钾，AR，国药集团；七水合硫酸亚铁，AR，国药集团；三氯化铁，AR，国药
集团；乙酸，AR，国药集团；2；2‑二苯基‑1‑苦基肼(DPPH)，AR，美国sigma公司；2，2'‑联氮‑
双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸(ABTS)，AR，上海阿拉丁；三吡啶基三嗪(TPTZ)，AR，上海阿拉
丁；荧光素钠(FL)，AR，麦克林；2,2‑偶氮二(2‑甲基丙基咪)二盐酸盐，(AAPH)，AR，上海阿拉
丁；奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)，GC，上海阿拉丁；DMEM培养液，BR，美国Hyclone公司；青
霉素‑链霉素双抗，BR，美国Hyclone公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)，BR，美国Hyclone公司；胰
蛋白酶溶液BR，美国Hyclone公司；CCK‑8试剂盒，碧云天生物技术研究所。

[0037] Infinite M200 PRO紫外酶标仪，瑞士Dycan公司；Olympus Ckx41倒置生物显微镜，日本奥林巴斯株式会社；SB‑5200DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技公司；SW‑CJ‑2FD
超净工作台，无锡凯派克斯科技公司；Centrifuge 5804R离心机，Eppendorf公司；3111培养
箱，美国赛默飞世尔科技公司；RE‑52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

[0038] 实施例1

[0039] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.2％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0040] (2)地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系(pH为5.72)，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层后，取上相，
即得地骨皮多酚提取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇溶液质量比
为1：20，硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.11g/g。

[0041] (3)测得地骨皮多酚得率为15.13mg/g。

[0042] 实施例2

[0043] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.2％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0044] (2)地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系(pH为5.72)，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层后，取上相，
即得地骨皮多酚提取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇溶液质量比
为1：20，硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.13g/g。

[0045] (3)测得地骨皮多酚的得率为17.88mg/g。

[0046] 实施例3

[0047] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.2％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0048] (2)地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系(pH为5.72)，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层后，取上相，
即得地骨皮多酚提取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇溶液质量比
为1：20，硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.15g/g。

[0049] (3)测得地骨皮多酚的得率为15.72mg/g。

[0050] 实施例4

[0051] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.2％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0052] (2)地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系(pH为5.72)，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层后，取上相，
即得地骨皮多酚提取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇溶液质量比
为1：20，硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.17g/g。

[0053] (3)测得地骨皮多酚的得率为15.07mg/g。

[0054] 实施例5

[0055] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.2％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0056] (2)地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系(pH为5.72)，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层后，取上相，
即得地骨皮多酚提取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇溶液质量比
为1：20，硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.19g/g。

[0057] (3)测得地骨皮多酚的得率为14.55mg/g。

[0058] 实施例1～实施例5条件和地骨皮多酚提取物中多酚含量，见表1。

[0059] 表1

[0060]

[0061] 从表1可以看出，硫酸铵添加量为0.11g/g～0.13g/g时，多酚得率随着硫酸铵添加量增加而增加，在添加量超过0.13g/g后，得率随着硫酸铵的添加量增加而降低，可能由于
随着硫酸铵的添加量增加，虽然上相中多酚浓度上升，但相比不断降低，最终影响了多酚总
提取量，因此，本发明优选硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.13，此条件下测得地骨皮多酚
的得率为17.88mg/g。

[0062] 实施例6

[0063] (1)在实施例2的条件下，探究不同的超声时间20min、30min、40min、50min、60min对地骨皮多酚提取效果的影响(其他条件均不变)，试验条件与结果见表2。

[0064] 表2

[0065]

[0066]

[0067] 从表2可以看出，在20min～50min时，随着超声时间的延长，地骨皮多酚得率不断增加，在超过50min后，延长提取时间反而导致多酚得率降低，原因可能为地骨皮中
kukoamine B，绿原酸和阿魏酸等物质在过长的超声时间中结构被破坏。因此，本发明优选
超声时间为50min。

[0068] (2)在实施例2的条件下，探究不同的超声温度25℃、35℃、45℃、55℃、65℃对地骨皮多酚提取效果的影响(其他条件均不变)，试验条件与结果见表3。

[0069] 表3

[0070]

[0071] 从表3可以看出，当温度为55℃时，地骨皮多酚得率达到最大，可能由于温度较低时，随着温度升高，分子热运动加快，有助于提取物的渗透、溶解、扩散，发明人在试验过程
中可观察到随着温度升高，上相颜色不断加深。在较高的温度下多酚得率降低，可能是一些
萜类和脂肪酸类溶出，改变上下两相分配，导致提取率降低。

[0072] 实施例7

[0073] 在实施例2的条件下，加一定浓度乙酸对双水相系统中多酚的提取率的影响，具体如下：

[0074] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.2％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0075] (2)地骨皮中多酚的提取：将硫酸铵、含有一定浓度的乙酸的乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层
后，取上相，即得地骨皮多酚提取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇
溶液质量比为1：20，硫酸铵质量与乙醇溶液质量比为0.13g/g。

[0076] (3)福林酚法测多酚得率，见表4。

[0077] 表4

[0078] 乙酸浓度mol/L 系统PH 多酚得率mg/g0 5.72 17.88
0.001 5.32 15.06
0.01 4.62 17.20
0.1 4.2 16.41
0.3 3.77 15.29

[0079] 从表4可以看出，改变通过添加乙酸改变pH不利于地骨皮多酚的提取。可能由于pH太低，不利于将多酚以离子形式溶解到溶剂中，且不同多酚的理化性质差异较大，为兼顾平
衡、简化提取工艺、避免有害废液的产生，因此本发明优选乙酸添加量为0，此时双水相pH为
5.72，可获得较好的提取效果。

[0080] 实施例8

[0081] (1)原料预处理：地骨皮烘干至水分含量为0.6％，粉碎后过60目筛，得地骨皮粉末，密封避光保存；

[0082] (2)地骨皮中多酚的提取：将乙醇溶液和地骨皮粉末混合，形成混合溶液体系，55℃、220W超声功率条件下提取50min，提取液抽滤，静置分层后，取上相，即得地骨皮多酚提
取物；其中，乙醇溶液其质量分数为41％，地骨皮粉末与乙醇溶液质量比为1：20。

[0083] (3)测得地骨皮多酚的得率12.88mg/g。

[0084] 通过比较实施例2和实施例8的地骨皮多酚提取物中多酚含量可知，双水相提取方式多酚得率更高，提取效果更好。

[0085] 实施例9

[0086] (1)HPLC条件

[0087] 1525高压液相色谱美国沃特世公司色谱柱：SynergiTM 4μm Hydro‑RP80A，流动相A:0.1％TFA水溶液B:乙腈A:B＝85:15流速0.5ml/min，320nm监测进样量：10μL。

[0088] (2)本发明实施2中双水相制得的地骨皮多酚提取物的(浓度0.4g/ml)HPLC图见图1、数据见表5。

[0089] 表5

[0090]

[0091]

[0092] (2)本发明实施8中非双水相制得的地骨皮多酚提取物的(浓度0.4g/ml)HPLC图，见图2、数据见表6。

[0093] 表6

[0094]  Retention Time Area ％Area Height
1 4.354 2556502 6.66 171450
2 5.483 8266789 21.53 758605
3 7.284 5327331 13.87 289579
4 9.472 6746836 17.57 683396
5 13.154 2032339 5.29 105717
6 14.882 4338528 11.30 156952
7 16.084 9135691 23.79 356415

[0095] 发明人发现，双水相上相与同条件下非双水相提取结果有明显差异，与非双水相条件相比，双水相条件下7.28min出峰面积明显小于非双水相条件下的峰面积，但11.15和
18.42min出峰面积大于非双水相条件下的出峰面积。除此之外，二者其它保留时间的峰高
与峰面积也有差距。同时，发明人发现，双水相提取前pH为5.72，呈弱酸性，有利于多酚的溶
解并提高其稳定性。

[0096] 实施例10

[0097] 大孔树脂吸附：将地骨皮多酚提取物减压旋蒸浓缩，加水复溶，过D101树脂，1～2个柱体积的水洗后用15％乙醇洗脱，得洗脱液；

[0098] 浓缩过C18柱：将过D101树脂洗脱液减压旋蒸浓缩，加水复溶，以1.2柱体积的0.1％的TFA：乙腈体积比85：15混合溶液和1.3柱体积的乙腈为流动相，过C18柱，取第0.7～
2.5柱体积的洗脱液，旋干，即得地骨皮多酚浓缩物。

[0099] (1)样品制备

[0100] 仪器：Biotage快速纯化制备液相色谱，C18柱为仪器自带，浓度为上样量为500mg，浓度为350g/L。

[0101] 大孔树脂吸附：将实施例2制得的地骨皮多酚提取物减压旋蒸浓缩(减压旋蒸浓缩压力为‑0.1MPa，温度为30～55℃)，加水复溶(水与对应生料的质量比1:2～4)，过D101树
脂，1～2个柱体积的水洗后用15％乙醇洗脱，得洗脱液；

[0102] 浓缩过C18柱：将过D101树脂洗脱液减压旋蒸浓缩(减压旋蒸浓缩压力为‑0.1MPa，温度为30～55℃)，所述加80％甲醇复溶(浓缩物与溶液质量比1:2～4)，以0.1％的TFA：乙
腈体积比85：15混合溶液和乙腈为流动相，过C18柱，取第0.7～2.5柱体积的洗脱液，旋干，
即得地骨皮多酚浓缩物。

[0103] 具体的，依次以1.2个柱体积的0.1％TFA‑乙腈＝85‑15和1.3柱体积的乙腈为流动相，280nm和320nm监测，过C18柱。在0～0.7个柱体积范围内洗脱液的吸光度不断上升；第
0.7～1.2柱体积范围内洗脱液吸光度不断降低至仪器最低范围；1.2～2.5柱体积以乙腈为
洗脱剂，洗脱液吸光度先升高后降低至仪器检测最低范围。将0～0.7个柱体积的洗脱液合
并旋干获得P2A，0.7～1.2个柱体积的洗脱液合并旋干获得P2B，1.2～2.5个柱体积的洗脱
液合并旋干获得P2C。

[0104] 预实验显示，硅胶作为填料时，以二氯甲烷/甲醇和纯甲醇为洗脱剂皆不能解吸附多酚类物质。硅胶填料起吸附作用的基团是硅醇基上的羟基，但地骨皮多酚的极性大，洗脱
剂难以解离，造成了目标产物的死吸附。同时，作为有机溶剂，二氯甲烷易挥发，毒性也较
高，不利于安全管理。

[0105] Biotage径向柱压缩系统流速广，处理样品量大，自带有C18柱，可自动检测洗脱液吸光度。采用C18柱分离样品，流动相中的溶质在填料孔道中移动的过程，它们会因为较弱
的疏水作用和范德华力而被C18碳链吸引和保留，但由于提取物结构复杂，同时为兼顾效
率，并没有获得单一物质。

[0106] (2)抗氧化性测定

[0107] DPPH〃清除率测定方法：96孔板中分别加入0.1mL样品溶液和0.2mM DPPH乙醇溶液，样品溶剂代替样品为对照组，空白组为同比例样品溶剂与乙醇，酶标仪震摇30s,室温下
避光反应30min，517nm处测量吸光度。

[0108] Inhibition％＝[1‑(As‑Ab)/Ac]×100

[0109] 式中As为样品组吸光度；Ab空白组吸光度；Ac为对照组吸光度

[0110] ABTS〃清除率测定方法：7mM ABTS〃浓溶液:7mM ABTS溶液(含2.45mM过硫酸钾)，常温避光放置16h后，以水稀释至734nM处吸光度为0.7±0.02。在96孔板中依次加入10μL样品
与190μlABTS溶液，15min后734nm测量吸光度。

[0111] 抑制率％＝(1‑A s/0.7)*100，式中As为样品组吸光度。

[0112] FRAP抗氧化活性：TPTZ工作液：pH＝3.6的醋酸缓冲液、10mmol/L的TPTZ溶液和20mmol/L FeCl3溶液以10:1:1的比例混合，工作液现配现用。

[0113] FeSO4溶液标准曲线：96孔板中依次加入和10μL FeSO4溶液(100～1000mmol/L)和190μL TPTZ工作液，避光37℃反应10min，593nm检测吸光度。以FeSO4浓度为为横坐标，吸光
2
值为纵坐标(y)，制作标准曲线(y＝0.0006x+0.1471R＝0.9991)。样品溶液代替FeSO4，根据
样品吸光度值，对照标准曲线得相应FeSO4的浓度(mmol/L)，定义为FRAP值。

[0114] 分别测定P2A、P2B、P2C和维生素C的抗氧化性能，结果见表7。

[0115] 表7

[0116]

[0117] 注：“/”表示30μg/L P2A的FRAP值过低，不在检测范围内

[0118] 从表7可以看出，30μg/L浓度下P2B、P2C对ABTS自由基的清除效果强于同浓度VC。

[0119] (3)在HPLC条件下P2A、P2B和P2C之间差异

[0120] 1525高压液相色谱美国沃特世公司色谱柱：Synergi TM 4μm Hydro‑RP80A流动相A:0.1％TFA水溶液B:乙腈A:B＝85:15流速0.5mL/min

[0121] 280nm 320nm监测进样量：10μL

[0122] 注：P2A,P2B,P2C为同一质量浓度下，测定HPLC图，见图3～5。

[0123] 见图3～5可知，P2A，P2B与P2C在同一生料浓度下HPLC结果有明显差距，P2A中富集了7.4min左右出峰的物质；P2B中富集了9.6min和11.2min出峰的物质，但后者的峰在320nm
下不明显，280nm下可观察到，推测这种物质稳定性较差，可能在保存提纯过程中氧化分解
了；P2C中富集了16.25和18.87min出峰的物质，推测9min之后出峰的物质可能更具抗氧化
活性。P2A,P2B,P2C都是多酚类物质，双水相与非双水相相比，总多酚提取率高，且抗氧化效
果不好的P2A(7.4min左右出峰的物质)含量占比少，抗氧化效果好的P2B和P2C部分含量高。

[0124] 实施例11

[0125] 大孔树脂吸附分离技术，不仅能够提高中药药效成分的纯度,而且可以去除杂质、减少使用剂量,对提高药物疗效有着重要作用。双水相上下两相，浓缩过D101大孔树脂，回
收硫酸铵，上相上样后依次用15％乙醇，30％乙醇，60％乙醇，乙醇洗脱，洗脱液浓缩，三氯
化铁显色反应显示多酚主要集中在15％乙醇洗脱液中。

[0126] (1)树脂筛选：D101，AB8，NKA2，NKA9光复树脂；X5沧州宝恩化工厂；S8南开大学化工厂；聚酰胺国药沪试；

[0127] (2)静态吸附

[0128] 树脂乙醇浸泡过夜，水洗至无乙醇味，0.5g树脂加入25mL 1.65mg/mL地骨皮多酚水溶液，震荡吸附8h，同体积80％乙醇解吸附，结果见表8。

[0129] 表8

[0130] 树脂名称 平衡吸附mg/g 吸附率％ 解析率％D101 4.68 56.88 81.63
AB8 4.47 54.35 82.27
X5 4.17 50.70 91.83
NKA9 5.14 62.43 82.75
S8 2.29 30.31 95.00
聚酰胺 1.10 13.31 41.75
NKA2(PH＝12碱性乙醇解吸附) 7.42 90.11 20.44
NKA2(PH＝2酸性乙醇解吸附) 7.42 90.11 64.04
NKA2(乙酸乙酯解吸附) 7.42 90.11 1.54
NKA2(乙醇解吸附) 7.42 90.11 18.22

[0131] 可以看到几种极性不同树脂对地骨皮总酚吸附效果一般，这可能是地骨皮多酚理化性质差异性较大造成的。平衡吸附4.5mg/g以上，解析率80％以上的为D101与NKA9，考虑
到NKA9树脂价格接近D101的两倍，综合选择D101树脂。

[0132] 发明人尝试过聚乙二醇/盐提取地骨皮多酚，但发现聚乙二醇粘度较大，不易操作，且难回收，在对应的同一生料浓度下抗氧化活性没有明显提高。

[0133] 本发明提出一种提取地骨皮中多酚的方法及其地骨皮多酚提取物，采用双水相体系萃取提取法与同条件传统提取法相比可以有效提高地骨皮多酚得率，成相剂易于回收利
用，降低了有机溶剂消耗，符合绿色化学的发展理念；同时，本发明优选提取工艺中料液比
1：20，硫酸铵与乙醇溶液质量比为0.13，55℃下超声50min，上相多酚得率为17.88mg/g，同
条件下非双水相体系得率为12.88mg/g。发明人改变通过添加乙酸改变pH不利于地骨皮多
酚的提取。可能由于pH太低，不利于将多酚以离子形式溶解到溶剂中，且不同多酚的理化性
质差异较大，为兼顾平衡、简化提取工艺、避免有害废液的产生，因此本发明优选乙酸添加
量为0，此时双水相pH为5.72，可获得较好的提取效果。

[0134] 同时，发明人进一步研究发现，通过大孔树脂吸附、浓缩过C18柱，取第0.7～2.5柱体积洗脱液，旋干，即得地骨皮多酚浓缩物，其中，地骨皮多酚浓缩物在质量浓度为30μg/L
时，对ABTS〃的清除率达41.2～44.3％。

[0135] 应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术
方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发
明的权利要求范围当中。