一种γ-谷氨酰转肽酶近红外荧光探针、制备方法及其应用

摘要

一种γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针、制备方法及其应用，发明属于荧光检测技术领域，先将meso位氯取代氟硼二吡咯荧光染料溶于溶剂中，再在室温下与谷胱甘肽的水溶液搅拌反应12小时，然后旋蒸除去溶剂，再经分离提纯，取得在5min内即可对GGT完全响应的γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针，可以应用于快速检测生物样品中γ‑谷氨酰转肽酶的含量和检测生物样本中肿瘤细胞γ‑谷氨酰转肽酶。

权利要求

1.一种γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针，其化学结构式如下；

其中，

R1为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种；

R2为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种；

R3为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种；

R4为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种。

2.如权利要求1所述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：先将meso位氯取代氟硼二吡咯荧光染料溶于溶剂中，再在室温下与谷胱甘肽的水溶液搅拌反应

12小时，然后旋蒸除去溶剂，再经分离提纯，取得γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针。

3.根据权利要求2所述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述溶剂为乙腈和水的混合溶液，所述乙腈和水的混合体积比为2∶3。

4.如权利要求1所述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针用于制备检测生物样品中γ‑谷氨酰转肽酶的含量试剂的应用。

5.如权利要求1所述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针用于制备检测生物样本中肿瘤细胞γ‑谷氨酰转肽酶试剂的应用。

说明书

一种γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于荧光检测技术领域，具体地，本发明涉及一种荧光探针及它们的制备方法和在γ‑谷氨酰转肽酶检测中的应用。

背景技术

[0002] γ‑谷氨酰转肽酶(GGT)在生物体内的谷胱甘肽(GSH)的代谢过程中扮演着重要的作用，其在生物体内的分布主要在细胞膜上，是诊断肝胆疾病的重要指标之一，被广泛用途
于肝病及其它脏器疾病的诊断。组织局部微环境的γ‑谷氨酰转肽酶表达异常升高常常与
一些恶性肿瘤相关，在肝癌、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌等肿瘤组织都都有检测到γ‑谷氨酰
转肽酶的高表达。因此，对生物样品中γ‑谷氨酰转肽酶进行定量检测具有重要的意义。

[0003] 免疫化学的方法是目前准确度和灵敏度最高的GGT检测方法，但是其操作繁琐，成本高，耗时较长；比色法是目前IFCC推荐使用的方法，其商业化用途最为广泛，其问题在于
无法用于对相对复杂的生物环境如活体组织中或者细胞GGT含量的测定。目前商品化的荧
光检测试剂盒主要是基于香豆素、萘酰亚胺等荧光分子的产品，这类荧光分子在相对复杂
的生物样品中容易受到背景荧光信号和组织散射的干扰，难以实现对生物样品中GGT含量
的准确检测。Luo等人报道了多种不同结构的GGT检测分子，这类分子通常是“Turn on”型荧
光探针，其对GGT的响应呈现单个波段荧光强度升高的特点。这导致这类分子用于组织中
GGT含量的检测时，其检测信号容易受到探针浓度的影响，使检测的准确性降低。

[0004] 现有技术中的试剂盒大多采用比色法和荧光增强法对GGT进行检测，这两种方法在生物样品中应用时，难以消除探针浓度、激发光功率等外界环境因素对检测信号的影响，
难以对所述生物样品中的GGT含量进行准确的检测。相比于以单波长强度变化对待测物进
行检测的方法，比率荧光检测方法在荧光检测中通常是以一个波段的光信号作为内参，另
一个波段的光信号作为检测信号，以两个波段的荧光强度的比率值作为输出信号，从而可
以在一定程度上消除外界环境的变化对输出信号数值的干扰。因此，在相对复杂的生物体
系中，利用比率检测方法对待测物进行检测，具有更高的准确性，且以双波长荧光比率变化
作为检测信号将有利于构建对复杂生物体系中的GGT进行定量检测的方法。目前，用于比率
检测GGT的荧光探针鲜有报道，并且这些荧光探针响应速度慢、荧光比率变化倍数低、工作
波长短、检测信号溶液收到背景荧光信号的干扰。现有技术中存在对GGT检测具有反应快
速、灵敏度高和近红外波段响应的GGT荧光探针的迫切需求。

发明内容

[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针。

[0006] 本发明化学结构式如下；

[0007]

[0008] 其中，

[0009] R1为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种；

[0010] R2为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种；

[0011] R3为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种；

[0012] R4为H、卤素、碳原子数为1‑18的烃基或醚中的任意一种。

[0013] 本发明作为荧光探针具有反应快速且具有高灵敏度和近红外波段荧光发射的优势，不仅可以在一定程度上消除外界环境对检测信号的干扰，在检测准确度上有很大的提
升，而且其比率信号变化倍数能达到500倍，这使得荧光探针的灵敏度得到显著地提高。更
重要的是，本发明荧光探针对GGT的响应速度非常快，在5min内即可完全响应，这使得本发
明产品可以应用于快速检测复杂样品中的GGT含量。

[0014] 本发明的第二个目的是提供上述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针的制备方法。

[0015] 特点是：先将meso位氯取代氟硼二吡咯荧光染料溶于溶剂中，再在室温下与谷胱甘肽的水溶液搅拌反应12小时，然后旋蒸除去溶剂，再经分离提纯，取得γ‑谷氨酰转肽酶
近红外荧光探针。

[0016] 进一步地，上述溶剂为乙腈和水的混合溶液，所述乙腈和水的混合体积比为2∶3。

[0017] 由于这种探针的制备是基于meso位氯取代氟硼二吡咯和谷胱甘肽上的巯基之间发生的亲核取代反应，而巯基的亲核性远远高于氯离子，因而该反应在溶液中进行速度非
常快，通常30分钟内即可反应完全。并且利用这种制备方法制备探针所需原料价格低廉，合
成方法和产物后处理都非常简单，非常有利于进行大批量生产的拓展。

[0018] 本发明的第三个目的是提出上述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针的应用。

[0019] 一种应用是：上述γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针用于检测生物样品中γ‑谷氨酰转肽酶的含量。

[0020] 具体方法是：

[0021] 1)将γ‑谷氨酰转肽酶检测探针和钠盐溶解于超纯水中，即得γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒；所述钠盐为碳酸钠或叠氮化钠或碳酸氢钠；

[0022] 2)制作标准曲线：

[0023] 分别制备至少两种已知的浓度不同的γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液；

[0024] 分别取2mL所述已知的浓度不同的γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液分别与0.01M磷酸盐混合，即得浓度不同的γ‑谷氨酰转肽酶的缓冲溶液；

[0025] 分别取20μL所述γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒分别滴加于浓度不同的γ‑谷氨酰转肽酶的缓冲溶液中，于37℃下反应；

[0026] 在激发光激发下，测定已知的浓度不同的γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液在不同发射波长处的荧光强度的比率值，以γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液中γ‑谷氨酰转肽酶的浓度
为横坐标，以比率值为纵坐标，绘制标准曲线；

[0027] 3)测定生物样品中γ‑谷氨酰转肽酶的含量：

[0028] 取2mL待测生物样本与0.01M磷酸盐混合，即得待测生物样本的缓冲溶液；

[0029] 取20μL所述γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒滴加于所述待测生物样本的缓冲溶液中，于37℃下反应；

[0030] 在激发光激发下，测定测定生物样品在不同发射波长处的荧光强度的比率值；

[0031] 根据上述标准曲线，查出生物样品中γ‑谷氨酰转肽酶的含量值。

[0032] 本发明可检测的γ‑谷氨酰转肽酶浓度范围值为0.01～1000mU/mL。

[0033] 与目前商业化使用的GGT探针只依赖一个波段的光信号对待测样本中的待测物进行检测不同，在本发明方法通过同时收集两个不同波段的光信号，以其中的一个波段作为
参比，进而可以消除待测样本的不同对测试信号造成的干扰，减小检测结果的误差。

[0034] 另一种应用是：将γ‑谷氨酰转肽酶近红外荧光探针用于检测生物样本中肿瘤细胞γ‑谷氨酰转肽酶。

[0035] 具体步骤如下：

[0036] 1)在37℃和5％CO2条件下，用含有10％(v/v)胎牛血清FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞，所述细胞为人肝癌细胞HepG2或人肺癌细胞A549；

[0037] 将γ‑谷氨酰转肽酶检测探针和钠盐溶解于超纯水中，即得γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒；所述钠盐为碳酸钠或叠氮化钠或碳酸氢钠；

[0038] 2)在培养后取得的细胞中加入1mL DMEM和10μL所述γ‑谷氨酰转肽酶检测探针，孵育0.5h；然后进行共聚焦荧光成像，在激发光激发下，收集不同荧光波段的荧光强度，比
率信号为不同波段荧光信号强度的比率值，所述比率值高低与生物样本中γ‑谷氨酰转肽
酶的含量高低呈线性关系。

[0039] 与目前商业化使用的GGT探针只依赖一个波段的光信号对细胞中的GGT含量进行检测不同，在本发明则通过同时收集两个不同波段的光信号，以其中的一个波段作为参比，
进而可以细胞的背景荧光信号对成像信号造成的干扰，降低成像结果的偏差。

[0040] 本发明有益效果：

[0041] 1、本发明作为荧光探针具有高灵敏度，在溶液中检测限可达到5mU/L，且含有本发明荧光探针的产品双通道比率荧光信号的收集，可以在一定程度上降低由于探针浓度、激
发光强度波动等问题对成像信号造成的干扰，通过荧光比率检测的方法对生物样品中γ‑
谷氨酰转肽酶的含量进行检测，它不仅可以在一定程度上消除外界环境对检测信号的干
扰，在检测准确度上有很大的提升，其比率信号变化倍数能达到500倍，这使得荧光探针的
灵敏度得到显著提高。

[0042] 2、本发明荧光探针对γ‑谷氨酰转肽酶的响应速度非常快，在5min内即可完全响应，这使得本发明产品可以应用于样本中γ‑谷氨酰转肽酶的快速检测。

[0043] 3、本发明荧光探针是蓝色的固体，在溶液中呈深绿色，与γ‑谷氨酰转肽酶反应后，肉眼即可观察到溶液变为明显的紫色。

[0044] 4、本发明荧光探针的工作波段位于近红外波段，收到生物样品中自身背景荧光信号的干扰较小。

[0045] 5、本发明荧光探针具有良好的选择性，应用时显色反应仅在γ‑谷氨酰转肽酶存在的条件下发生，其它常见的无机盐、氨基酸、水解酶等均无法使探针溶液发射颜色和荧光
光谱的变化。

[0046] 6、本发明荧光探针对γ‑谷氨酰转肽酶的响应呈线性关系，可以用于该酶的定量测定，可用于临床生物样品的分析。

附图说明

[0047] 图1为含有化合物BD‑3的本发明试剂盒对γ‑谷氨酰转肽酶响应随时间变化的紫外‑可见吸收光谱。

[0048] 图2为含有化合物BD‑3的本发明试剂盒对γ‑谷氨酰转肽酶响应随时间变化的荧光光谱。

[0049] 图3为本发明试剂盒的比率值对γ‑谷氨酰转肽酶浓度的工作曲线图。

[0050] 图4为肝癌细胞(HepG2)在共聚焦成像中的明场成像图。

[0051] 图5为肺癌细胞(A549)在共聚焦成像中的明场成像图。

[0052] 图6为肝癌细胞(HepG2)在共聚焦成像中发光信号波长为650‑700nm范围的荧光成像图。

[0053] 图7为肺癌细胞(A549)在共聚焦成像中发光信号波长为650‑700nm范围的荧光成像图。

[0054] 图8为肝癌细胞(HepG2)在共聚焦成像中发光信号波长为730‑780nm范围的荧光成像图。

[0055] 图9为肺癌细胞(A549)在共聚焦成像中发光信号波长为730‑780nm范围的荧光成像图。

[0056] 图10为肝癌细胞(HepG2)在共聚焦成像中比率信号通道的荧光成像图。其中比率值为收集的650‑700nm的荧光信号与730‑780nm的荧光信号的比率值。

[0057] 图11为肺癌细胞(A549)在共聚焦成像中比率信号通道的荧光成像图。其中比率值为收集的650‑700nm的荧光信号与730‑780nm的荧光信号的比率值。

具体实施方式

[0058] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

[0059] 一、制备γ‑谷氨酰转肽酶响应型荧光探针。

[0060] 1、制备γ‑谷氨酰转肽酶响应型荧光探针BD‑1。

[0061] 化学反应式如下：

[0062]

[0063] 具体制备方法：

[0064] 取meso位氯取代氟硼二吡咯衍生物1(BD‑1X)1mmol溶于5mL乙腈‑水混合溶液(乙腈和水的混合体积比为2∶3)中，室温下加入含10mmol谷胱甘肽的水溶液2mL，并于室温下搅
拌反应12小时。

[0065] 反应结束后，旋蒸除去溶剂，所测粗产物通过高效液相色谱(甲醇/水＝2/1)分离提纯得到化合物BD‑1(0.28mmol，产率28％)。

[0066] 取得的化合物BD‑1核磁表征如下：1H NMR(400MHz,D2O,δ)7.77(d,J＝9.2Hz,2H),7.27(d,J＝8.2Hz,2H)6.87(dd,J＝9.2Hz,J＝2Hz,2H),6.46(d,J＝2Hz,2H),5.32(d,J＝
4.2Hz,2H),4.31(dd,J＝8Hz,J＝4.8Hz,1H),3.6‑3.2(m,12H),2.3‑2.05(m,3H),1.9‑1.8
(m,12H)。

[0067] 2、制备γ‑谷氨酰转肽酶响应型荧光探针BD‑2。

[0068] 化学反应式如下：

[0069]

[0070] 具体制备方法：

[0071] 取meso位氯取代氟硼二吡咯衍生物2(BD‑2X)1mmol溶于5毫升乙腈‑水混合溶液(乙腈和水的混合体积比为2∶3)中，室温下加入含10mmol谷胱甘肽的水溶液2mL，室温下搅
拌反应12小时。

[0072] 反应结束后，旋蒸除去溶剂，所测粗产物通过高效液相色谱(甲醇/水＝3/1)分离提纯得到化合物BD‑2(0.42mmol，产率42％)。

[0073] 取得的化合物BD‑2核磁表征如下：1H NMR(400MHz,DMSO‑d6,δ)8.68(m,1H),8.43(d,J＝8.4Hz,1H),8.03(8.03,J＝7.6Hz,1H),7.81(dt,J1＝1.2Hz,J2＝7.6Hz,1H),7.74
(dt,J1＝1.2Hz,J2＝7.6Hz,1H),7.34(d,J＝7.6Hz,1H),7.22(d,J＝2Hz,1H),6.93(dd,J1
＝2Hz,J2＝8.4Hz,1H)),6.83(d,J＝8.4Hz,1H),6.78(m,1H),4.50(m,1H),3.73(m,2H),
2.6‑3.0(m,6H),2.35(m,2H),1.92(m,2H)。

[0074] 3、制备γ‑谷氨酰转肽酶响应型荧光探针BD‑3。

[0075] 化学反应式如下：

[0076]

[0077] 具体制备方法：

[0078] 取meso位氯取代氟硼二吡咯衍生物3(BD‑3X)1mmol溶于5毫升乙腈‑水混合溶液(乙腈和水的混合体积比为2∶3)中，室温下加入含10mmol谷胱甘肽的水溶液2mL，室温下搅
拌反应12小时。

[0079] 反应结束后，旋蒸除去溶剂，所测粗产物通过高效液相色谱(甲醇/水＝1/1)分离提纯得到化合物BD‑3(0.28mmol，产率28％)。

[0080] 取得的化合物BD‑3核磁表征如下：1H NMR(400MHz,DMSO‑d6,δ)8.95(t,J＝5.0Hz,1H),8.8(d,J＝8.2Hz,1H),8.6(d,J＝7.6Hz,1H),7.6(d,J＝7.6Hz,1H),4.85(m,1H),3.75
(m,1H),3.7(m,2H),3.4(m,1H),3.15(m,1H),2.2–2.4(m,2H),1.7–2.0(m,2H)。

[0081] 二、制备γ‑谷氨酰转肽酶检测探针溶液(即试剂盒)。

[0082] 1、称取7.97mg(0.01mmol)化合物BD‑3和10.6mg(0.1mmol)碳酸钠粉末，溶于100mL超纯水中，即得γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒1(又称母液1)，探针浓度：100μM。

[0083] 2、称取7.1mg(0.01mmol)化合物BD‑2和0.01mg叠氮化钠溶于100mL超纯水中，即得γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒2(又称母液2)，探针浓度：50μM。

[0084] 3、称取2.3mg(5mmol)化合物BD‑1和10mg碳酸氢钠溶于100mL超纯水中，即得γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒3(又称母液3)，探针浓度：20μM。

[0085] 三、采用试剂盒检测水溶液中γ‑谷氨酰转肽酶的含量。

[0086] 1、荧光探针光谱响应性质研究：

[0087] 将20μL的γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒1(母液1)滴加到由2mL、50mU/mL的γ‑谷氨酰转肽酶溶液和0.01M磷酸盐组成的缓冲溶液中，于37℃下反应，测量紫外‑可见吸收光谱
和荧光发射光谱随反应时间的变化。荧光发射光谱测定时以635nm为激发光；激发和发射狭
缝宽度均为10nm；电压400V。吸收光谱由岛津公司UV‑2600型紫外可见吸收光谱仪测得；荧
光光谱由爱丁堡公司FS5‑SS型荧光光谱仪测得。

[0088] 含有化合物BD‑3的试剂盒1对γ‑谷氨酰转肽酶溶液(50mU/mL)响应随时间变化的紫外‑可见吸收光谱变化情况如图1所示：加入γ‑谷氨酰转肽酶后BD‑3溶液在680nm处的吸
收峰逐渐下降，在550nm处的吸收峰逐渐上升。证明BD‑3溶液中加入γ‑谷氨酰转肽酶后，溶
液中含有的BD‑3的含量逐渐减少，并且伴随着新的最大吸收波长位于550nm处的化合物。这
表明BD‑3可以作为γ‑谷氨酰转肽酶催化的水解反应的底物，且其对酶的响应速度非常快，
仅需要5分钟即可反应完全。

[0089] 含有化合物BD‑3的试剂盒1对γ‑谷氨酰转肽酶溶液(50mU/mL)响应随时间变化的荧光光谱情况如图2所示：加入γ‑谷氨酰转肽酶后BD‑3溶液在670nm处出现了一个新的荧
光发射峰，并且随着加入酶的时间的增加逐渐上升。加入酶至BD‑3溶液中5min后，670nm处
的发射峰的强度不再增加，这与紫外吸收光谱测试得出的酶和BD‑3反应所需的时间吻合。
由于在反应过程中，探针位于750nm处的发光峰的强度没有发生明显的变化，因此可以作为
比率检测的内参，用于实现比率检测。

[0090] 2、制作标准曲线：

[0091] 分别配制浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、80和100mU/mL的γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液。

[0092] 按照上述方法，采用含有化合物BD‑3的试剂盒1分别测定浓度为0、5、10、15、20、25、30、40、50、80和100mU/mL的γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液的发射光谱，在不同发光波段
(650～700nm和730～780nm)的荧光强度的比率值，记为R(650～700nm波段的荧光强度比
730～780nm波段的荧光强度)。

[0093] 以γ‑谷氨酰转肽酶标准反应液的浓度C为横坐标，比率值R为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示：比率值和溶液中GGT的浓度呈线性关系，这表明利用该探针，本发明可以实
现对溶液中GGT含量的定量检测。此外，由于该探针对GGT响应具有较高的灵敏度，其线性曲
线的斜率达到了0.164，通过计算该探针在溶液中对GGT进行检测的检测限可以达到5mU/L。

[0094] 3、检测待测样品中γ‑谷氨酰转肽酶的含量：

[0095] 将20μL的γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒1(母液1)滴加到由2mL、待测样品和0.01M磷酸盐组成的缓冲溶液中，于37℃下反应，测量紫外‑可见吸收光谱和荧光发射光谱随反应
时间的变化。荧光发射光谱测定时以635nm为激发光；激发和发射狭缝宽度均为10nm；电压
400V。吸收光谱由岛津公司UV‑2600型紫外可见吸收光谱仪测得；荧光光谱由爱丁堡公司
FS5‑SS型荧光光谱仪测得。

[0096] 检测得到待测样品不同发射波段(650～700nm和730～780nm)的荧光强度比率值，记为R'，将所述R'带入上述所得的绘制标准曲线中，即可得到待测样品中γ‑谷氨酰转肽酶
的含量。

[0097] 四、检测临床血清样本中γ‑谷氨酰转肽酶的含量：

[0098] 将以上采用试剂盒检测水溶液中γ‑谷氨酰转肽酶的含量方法中的各γ‑谷氨酰转肽酶溶液替换为临床血清样本，按照以上制作标准曲线的方法检测临床血清样本不同发
射波段(650～700nm和730～780nm)的荧光强度比率值。

[0099] 将本试剂盒1测出的GGT含量与用目前商业化的单波长荧光检测GGT的试剂盒(购自Sigma‑Aldrich公司，货号：MAK090)及ELISA检测GGT试剂盒(购自上海酶研生物科技有限
公司，货号：EK‑H10297)检出的GGT含量进行比较，见下表所示。

[0100] 下表为含有化合物BD‑3的本发明试剂盒1与商业化GGT检测试剂盒检测临床样本中GGT含量的对比表。

[0101]

[0102] 由上表可见：比率探针对实际样本中GGT含量的检测结果与ELISA方法检出的结果更为接近，也具有更低的标准偏差。

[0103] 经过试验研究，试剂盒2和试剂盒3与试剂盒1具有类同的效果。

[0104] 五、本发明试剂盒在肿瘤细胞检测中的应用。

[0105] 采用试剂盒1检测细胞中γ‑谷氨酰转肽酶的具体步骤：

[0106] 1、在37℃和5％CO2条件下，用含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞，培养的细胞为人肝癌细胞HepG2和人肺癌细胞
A549。

[0107] 细胞使用之前用DMEM清洗。

[0108] 2、在细胞中加入1mL DMEM，再加入10μL上述γ‑谷氨酰转肽酶检测试剂盒1，孵育0.5h后进行共聚焦荧光成像(激光共聚焦扫描显微镜厂家为Nikon，型号为ECLIPSE Ti2)。

[0109] 在激发光激发下，收集不同荧光波段(650～700nm和730～780nm)的荧光强度。比率信号为不同波段荧光信号强度的比率值。

[0110] 如图4～图11所示，为本发明试剂盒1分别用于人肝癌细胞HepG2(GGT高表达)和人肺癌细胞A549(GGT低表达)的共聚焦成像图。

[0111] 其中通过图4和图5两种GGT表达含量不同的肿瘤细胞的明场图可以看到，两种细胞的状态良好。通过对比图6和图7可以发现，GGT高表达的HepG2细胞中，650‑700nm波段的
光信号明显比GGT低表达的A549细胞强很多，证明了探针可以对细胞中的GGT含量进行定性
的检测。如图8和图9所示，两种细胞在730‑780nm波段的荧光信号的强度并没有明显区别。
当我们以收集650‑700nm波段的荧光信号得到细胞成像图对以收集730‑780nm波段的荧光
信号得到细胞成像图做比率后，得到图10和图11。通过对比，HepG2中的比率值远高于在
A549细胞中的比率值，因此通过这种方法我们可以更加准确的判断细胞中GGT含量的高低，
而降低来自激光强度、成像曝光时间等成像条件改变带来的干扰。

[0112] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其
发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。