5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用

摘要

本发明提供一种5‑氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用。本发明通过优化出发菌株中5‑氨基乙酰丙酸合成酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的RBS序列，使得菌株的产5‑氨基乙酰丙酸能力大幅提高，适用于大规模生产。

权利要求

1.一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌，其保藏编号为CGMCC No.19220。

2.一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌为ATCC13032/pZRA16。

3.生产5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）以pZWA1载体为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对为引物，PCR扩增得到带有SEQ ID NO.12所示的RBS序列的hemA基因片段，与质粒连接，构建重组质粒；

（2）以pZWA2载体为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.4所示的引物对或者SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.4所示的引物对为引物，PCR扩增得到带有SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示的RBS序列的ppc基因片段，将所获得的ppc基因片段与步骤（1）所得到的重组载体连接，得到二次重组质粒；

（3）将步骤（2）所得到的重组载体转化谷氨酸棒杆菌，得到所述生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌。

4.权利要求1或2所述谷氨酸棒杆菌在5-氨基乙酰丙酸制备中的应用。

5.一种5-氨基乙酰丙酸的制备方法，采用权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌制备5-氨基乙酰丙酸，包括使用所述的谷氨酸棒杆菌将底物转化为5-氨基乙酰丙酸，所述底物选自葡萄糖或者木薯渣。

6.根据权利要求5所述的制备方法，包括：培养权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌，使之生产5-氨基乙酰丙酸。

说明书

5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一株高产5-氨基乙酰丙酸的重组菌株，以及该菌株的构建方法和应用。

背景技术

[0002] 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。近年来，利用微生物经C4途径发酵生产ALA已经得到了产业化应用。

[0003] 随着代谢工程技术的不断发展，采用代谢工程手段构建ALA生产菌株的研究越来越多，其菌株的产量也有所提高。然而现有菌株产ALA的生产水平仍较低，目前文献报道的产ALA产量大都停留在几克级左右，少数文献报道的产量达到十几克，例如Yang P et al.报道的两阶段发酵工艺生产ALA，产量14.7 g/L(Yang P et al.,  Applied and Environmental Microbiology 2016,82:2709–2717)；Zhu CC et al报道的ALA生产工艺产量为11.5 g/L（Zhu CC et al.,Biotechnology and Bioengineering 2019,116:2018–2028）。但是现有产ALA的方法产量仍然较低，本领域急需生产水平更高、原料利用范围更广的菌株，以便降低生产成本，大规模推广应用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的微生物及其构建方法，还在于提供利用本发明的微生物制备5-氨基乙酰丙酸的方法。首先，本发明提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的微生物，所述微生物中5-氨基乙酰丙酸合成酶（HemA）的活性相比于未修饰的菌株增强。

[0005] 在本发明的实施方式中，所述微生物包括带有RBS序列的5-氨基乙酰丙酸合成酶编码基因片段，所述RBS序列如SEQ ID NO.12所示。

[0006] 在本发明的实施方式中，所述微生物进一步包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）活性增强，例如所述微生物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因片段带有SEQ ID NO.12-17所示的任一种的RBS序列。在一个实施方式中，所述生产5-氨基乙酰丙酸的微生物中5-氨基乙酰丙酸合成酶（HemA）活性增强，并且烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)的活性增强；上述两种酶的活性增强通过优化RBS序列实现，例如所述菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶编码基因片段带有如SEQ ID NO.12所示的RBS序列，且磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因片段带有SEQ ID NO.12-17所示的任一种的RBS序列。

[0007] 在本发明的实施方式中，所述微生物为重组微生物；在一个实施方式中，所述微生物为重组的棒状杆菌，例如重组的谷氨酸棒杆菌。具体地，所述微生物是以野生型微生物或其他经基因修饰的微生物为出发菌株进一步进行基因修饰所得的重组微生物。

[0008] 本发明还提供所述生产5-氨基乙酰丙酸微生物的构建方法：包括在微生物菌株的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因片段中引入SEQ ID NO.12所示的RBS序列；任选地，进一步将烯醇式丙酮酸羧化酶基因片段所带有的RBS序列替换为SEQ ID NO.12-17所示的任一种。

[0009] 在本发明的实施方式中，所述RBS序列的引入或者替换可采用本领域已知的方法实现，例如采用同源同组、基因编辑等方法引入或替换出发菌株中的RBS序列。

[0010] 在本发明的实施方式中，所述构建方法包括：

[0011] （1）根据ALA合成酶（HemA）编码基因的序列，通过PCR扩增得到带有目标RBS的hemA基因片段，使用已知的连接酶将带有目标RBS的hemA基因片段与质粒连接，构建重组质粒；

[0012] （2）根据磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）编码基因的序列，通过PCR扩增带有目标RBS的ppc基因片段，使用已知的连接酶将带有目标RBS的ppc基因片段与步骤（1）的重组质粒连接，构建二次重组质粒；

[0013] （3）将步骤（2）所得的二次重组质粒转化出发菌株，得到本发明的微生物。

[0014] 本发明提供所述微生物在5-氨基乙酰丙酸制备中的应用。

[0015] 本发明进一步提供一种5-氨基乙酰丙酸的制备方法，采用本发明所述的微生物制备。

[0016] 在本发明的实施方式中，所述制备方法包括使用本发明所述的微生物将底物转化为5-氨基乙酰丙酸，例如在含有所述底物的培养基中培养所述微生物，以在所述培养基中生产和积累所述5-氨基乙酰丙酸。

[0017] 在本发明的实施方式中，所述制备方法包括：培养本发明所述的微生物，使之生产5-氨基乙酰丙酸；任选地，从培养基中分离5-氨基乙酰丙酸。

[0018] 在本发明的实施方案中，所述底物选自葡萄糖或者其他作为碳源的生物质原料，所述生物质原料选自淀粉（玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉、木薯渣、木薯粉、土豆渣等）、木质纤维素（作物秸秆、玉米芯、甘蔗渣等）、糖蜜（甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜）等；优选地，所述生物质原料选自木薯渣。

[0019] 在本发明的实施方案中，其他作为碳源的生物质原料经淀粉酶、糖化酶和/或纤维素酶酶解后的水解液作为碳源。

附图说明

[0020] 图1：本发明所构建的产ALA谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pZRA15菌株的5L发酵罐发酵产ALA实验结果；其中左图为葡萄糖糖作为碳源的发酵结果，右图为木薯渣水解液作为碳源的发酵结果。

具体实施方式

[0021] 发明人经过广泛而深入的研究，将野生型磷酸烯醇式丙酮酸（PPC）和ALA合成酶（HemA）的RBS序列进行了替换，出乎意料地发现工程菌株的ALA产量有显著提升。同时，该菌株可以利用木薯渣为原料进行发酵，产量明显提高，进而在此基础上完成了本发明。

[0022] 术语定义与说明

[0023] 本文所述的微生物是指具有5-氨基乙酰丙酸生产能力的微生物，可以指在所述微生物用于发酵方法中时，能够通过发酵生产目标物质的微生物。也就是说，“具有5-氨基乙酰丙酸生产能力的微生物”可以指能够从碳源生产5-氨基乙酰丙酸的微生物。特别地，可以指当在培养基或反应混合物中，例如含有碳源的培养基中培养时，能够从培养基收集5-氨基乙酰丙酸并积累5-氨基乙酰丙酸。

[0024] 与未修饰的菌株相比，本发明的微生物可以在培养基或反应混合物中生产并积累更大量的5-氨基乙酰丙酸。未修饰菌株也可以称为“未修饰的微生物菌株”。短语“未修饰菌株”或“未修饰的微生物菌株”可以指未被修饰成具有特定特征的对照菌株，即本领域技术人员熟知的野生型菌株、出发菌株。具有5-氨基乙酰丙酸生产能力的微生物能够以例如3 g/L或更多，4 g/L或更多，或5 g/L，或15 g/L以上的量在培养基或反应混合物中累积5-氨基乙酰丙酸。特别地，本发明的微生物在发酵罐发酵培养时能够以16 g/L以上、甚至18.5 g/L及以上的量在培养基或反应混合物中累积5-氨基乙酰丙酸。

[0025] 可以用作构建本发明微生物的出发菌株没有特别限制，出发菌株的实例包括细菌，例如棒状杆菌。

[0026] 本发明的微生物是指基因修饰的重组微生物，可采用本领域已知的遗传工程方法将外源核酸导入微生物，或者可以转化微生物中的内源基因的序列或位置，包括采用基因同源重组或基因编辑等方法实现微生物基因组的改变。

[0027] 为了通过同源重组产生基因表达增强的重组微生物，首先构建包含ALA酶基因和烯醇式丙酮酸羧化酶基因的多核苷酸序列的DNA或重组DNA，所述重组DNA包含需要替换或引入的RBS序列。当抗药性标记用作选择标记时，必需选择针对在同源重组之前野生型菌株对其敏感的药物的抗药性基因。这将使得能够基于在抗生素存在的情况下的生长来区分已经历同源重组的菌株和未经历同源重组的菌株。然后，通过电转化等将具有插入基因序列的选择标记的DNA导入菌株，然后使用标记进行选择，从而通过同源重组将靶基因整合入宿主微生物的染色体。

[0028] 在一个实施方式中，所述ALA合成酶基因带有如SEQ ID NO.12所示的RBS序列，所述烯醇式丙酮酸羧化酶基因带有如SEQ ID NO.12-17中任一所示的RBS序列。

[0029] 具体地，构建本发明的微生物可根据如下方法进行：

[0030] （1）根据ALA合成酶（HemA）编码基因的序列，通过PCR扩增得到带有目标RBS的hemA基因片段，使用已知的连接酶将带有目标RBS的hemA基因片段与质粒连接，构建重组质粒；

[0031] （2）根据磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）编码基因的序列，通过PCR扩增带有目标RBS的ppc基因片段，使用已知的连接酶将带有目标RBS的ppc基因片段与步骤（1）的重组质粒连接，构建二次重组质粒；

[0032] （3）将步骤（2）所得的二次重组质粒转化出发菌株，得到本发明的微生物。

[0033] 可以通过已知的数据库，如NCBI的GenBank提供ALA合成酶和烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列和编码基因序列，但是数据库不限于此。详细地，ALA合成酶可以是来源于GenBank: JQ048720.1的基因编码，或与之具有约80％或更多、90％或更多、或95％或更多序列同一性的多核苷酸序列编码；烯醇式丙酮酸羧化酶可以是来源于GenBank: BA000036.3的基因编码，或与之具有约80％或更多、90％或更多、或95％或更多序列同一性的多核苷酸序列编码。此类具有序列同一性的多核苷酸序列包括缺失、修饰、取代或添加序列的一部分的多核苷酸序列，只要该多核苷酸序列可以在微生物中正常表达并且具有ALA合成酶和烯醇式丙酮酸羧化酶活性。

[0034] 本文所用的术语“内源性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

[0035] 本文所用的术语“与内源性相比增强蛋白质的活性”指的是通过修饰蛋白增强在微生物中蛋白质的细胞内活性与以自然状态具备的蛋白质活性相比提高细胞内活性。本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，包括但不限于通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的酶的编码基因，从而在该菌株中表达该酶，则该酶对于该菌株是“外源性”的。

[0036] 本文所述的“RBS序列”具有本领域技术人员普遍了解的定义，即核糖体结合位点，是指起始密码子上游的一段非翻译区。通过用更强的RBS序列，可以改善基因的翻译效率。术语“更强的RBS序列”可以指与基因固有的野生型RBS序列相比提供改善的mRNA翻译的RBS序列，可以通过修饰来改善基因的翻译效率，使酶的活性增强。本发明的优点：本发明提供了高产ALA的重组谷氨酸棒杆菌，并且本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌株能够高水平地生产ALA，降低生产成本。

[0037] 本文中“5-氨基乙酰丙酸”与“ALA”具有相同含义，可互换使用，均表示5-氨基乙酰丙酸，为一种分子式为C5O3NH9的化合物，结构式为NH2CH2-C(O)-CH2-CH2-COOH。“5-氨基乙酰丙酸合成酶”与“ALA合成酶”、“HemA”具有相同含义，可互换使用，均表示具有5-氨基乙酰丙酸合成催化活性的酶，尤其是来源于序列为GenBank: JQ048720.1的基因编码的5-氨基乙酰丙酸合成酶，优选氨基酸序列为SEQ ID NO.18的序列。

[0038] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0039] 材料与方法

[0040] 本发明实施例所用的DNA聚合酶购自大连宝生物公司的Pyrobest；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；高氯血红素、琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行；质粒构建测序验证由金唯智完成；E. coil DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。

[0041] LB培养基成分：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，固体培养基中添加2%的琼脂粉。

[0042] 5-氨基乙酰丙酸的检测方法：200 μL稀释的发酵液或酶活力测定反应终止后样品加入100 μL pH 4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5 μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15 min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42 mL冰醋酸，8 mL 70%高氯酸，1 g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10 min后测553 nm波长下的吸光度。

[0043] 实施例1 hemA表达优化载体构建

[0044] 根据NCBI公布的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) ATCC 17001 ALA合成酶编码基因的序列 (GenBank: JQ048720.1)，设计引物RBS2-hemA-F (SEQ ID NO.1)和hemA-R (SEQ ID NO.2)。以pZWA1载体 (WO2014121724A，该载体中hemA的RBS序列为RBS1)为模板通过PCR扩增得到带有RBS2的hemA基因片段，PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃ 10 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，循环30次，72℃延伸5 min。目的片段用EcoRI和SmaI双酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的质粒pEC-XK99E连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，验证正确的转化子进行测序验证，将正确的重组载体命名为pZRA8，即该载体中hemA的RBS序列由RBS1替换为RBS2。

[0045] 根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc的序列 (来源于GenBank: BA000036.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.19)，设计引物RBS1-ppc-F (SEQ ID NO: 3)和ppc-R(SEQ ID NO:4)。以pZWA2载体 (WO2014121724A，该载体中hemA和ppc的RBS序列均为RBS1)为模板通过PCR扩增得到带有RBS1的ppc基因片段，PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃ 10 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，循环30次，72℃延伸5 min。目的片段用SmaI和XbaI双酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的pZRA8载体连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，验证正确的转化子进行测序验证，将正确的重组载体命名为pZRA10，即该载体中hemA的RBS序列由RBS1替换为RBS2，ppc的RBS序列为RBS1。

[0046] 实施例2 hemA表达优化对ALA合成的影响

[0047] 将上述重组载体pZRA10转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，获得重组菌株ATCC13032/pZRA10。将上述重组菌株ATCC13032/pZRA10以及出发菌株ATCC13032/pZWA2分别接种10 mL含有50 µg/mL卡那霉素和20 g/L葡萄糖的LB液体培养基，30℃，200 rpm培养12 h。按照初始OD为0.5转接装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶，30℃，200 rpm培养3 h后加入终浓度为100 µM的IPTG，诱导培养36 h后收集发酵液，检测ALA的浓度。其中摇瓶发酵培养基配方为：Na2HPO4·12H2O 17.1 g/L，KH2PO4 3.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，MgSO4 2 mM，CaCl2 0.1mM，葡萄糖50 g/L，酵母粉2 g/L，甘氨酸6 g/L。卡那霉素终浓度为50 µg/mL。ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。摇瓶发酵结果见表1，优化前菌株ALA产量为3.13 g/L，优化后的菌株ATCC13032/ pZRA10 ALA产量达到了4.10 g/L，比出发菌株提高了31%，效果明显。

[0048] 表1 hemA表达优化菌株摇瓶发酵数据

[0049]

[0050] 实施例3 ppc表达优化载体构建

[0051] 利用实施例1同样的技术方法，通过引物设计和PCR扩增，分别得到带有RBS2-RBS7的ppc基因片段，所用引物序列RBS2-ppc-F、RBS3-ppc-F、RBS4-ppc-F、RBS5-ppc-F、RBS6-ppc-F、RBS7-ppc-F以及ppc-R分别如表2所示，RBS2-RBS7序列分别如表3所示。PCR扩增体系如下：PCR扩增参数为：94℃ 10 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，循环30次，72℃延伸5 min。目的片段用SmaI和XbaI双酶切处理，然后在DNA连接酶作用下将获得片段与同样酶切处理的pZRA8载体连接，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，验证正确的转化子进行测序验证，将正确的重组载体分别命名为pZRA11-pZRA16。

[0052] 表2 引物序列

[0053]

[0054] 表3 RBS序列

[0055]

[0056] 实施例4 ppc表达优化对ALA合成的影响

[0057] 将上述重组载体pZRA11-pZRA16转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，获得重组菌株。将上述重组菌株以及出发菌株ATCC13032/pZRA10分别接种10 mL含有50 µg/mL卡那霉素和20 g/L葡萄糖的LB液体培养基，30℃，200 rpm培养12 h。按照初始OD为0.5转接装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶，30℃，200 rpm培养3 h后加入终浓度为100 µM的IPTG，诱导培养36 h后收集发酵液，检测ALA的浓度。摇瓶发酵结果见表4，优化后的菌株ALA产量达到了4.32-5.52 g/L，相较于仅hemA表达优化的菌株，产ALA水平提高了5%-31%，效果显著。其中ATCC13032/pZRA15产ALA水平可以达到5.52 g/L。ATCC13032/pZRA15菌株已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），分类命名：谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），保藏编号：CGMCC No.19220，保藏日期2019年12月19日。

[0058] 表4 ppc表达优化菌株摇瓶发酵数据

[0059]

[0060] 实施例5 木薯渣水解液制备

[0061] 配置10%木薯渣（w/v）溶液，pH调至6.2，并按照0.1%（w/w）加入α-淀粉酶，90℃加热搅拌2 h进行液化。冷却至室温，pH调至4.2，按照0.3%（w/w）加入糖化酶，60℃处理2 h获得糖化液。糖化液冷却后pH调整至5.0，按照0.4%（w/w）加入纤维素酶，50℃处理12 h。获得的水解液离心通过旋转蒸发进行浓缩，获得约含有420 g/L葡萄糖的木薯渣水解液，用于后续的5 L发酵罐发酵。

[0062] 实施例6 5 L发酵罐发酵

[0063] 将上述重组菌株ATCC13032/pZRA15分别以葡萄糖和木薯渣水解液为碳源进行5 L发酵罐发酵，发酵培养基成分为：50 g/L葡萄糖（结晶糖或木薯渣水解液），6 g/L K2HPO4·3H2O，5 g/L NH4Cl，2 g/L酵母粉，1.5 g/L KH2PO4，1 g/L MgSO4，0.5 g/L NaCl，20 mg/L MnSO4·5H2O，11 mg/L CaCl2，5 mg/L硫胺素和0.1 mg/L生物素。发酵过程控制温度为30℃，通过自动流加氨水控制pH为6.0-6.5，通过转速和通气量控制溶氧为10%-30%。发酵结果见图1。ATCC13032/pZRA15菌株以葡萄糖为主要碳源时ALA产量达到了16.3 g/L，为目前报道的最高水平。利用木薯渣水解液为碳源时ALA产量进一步提升到了18.5 g/L，比采用葡萄糖提高了13%，原料成本大幅降低。

[0064] 本发明基于RBS序列对hemA和ppc的表达进行了优化调控，ALA产量从出发菌株的3.13 g/L提高到了5.52 g/L，最优表达菌株中ALA的产量提高了76%，效果非常显著。进一步通过碳源及发酵工艺的优化，ALA最高产量达到了18.5 g/L，获得的菌株及生产工艺具有重要的工业应用价值。

[0065] 以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。