一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D及其应用转让专利
申请号 : CN201911268812.3
文献号 : CN110862976B
文献日 : 2021-04-27
发明人 : 周峻沛 , 黄遵锡 , 张蕊 , 李娜 , 韩楠玉 , 唐湘华
申请人 : 云南师范大学
摘要 :
本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，公开了一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D及其应用，突变体K321DH328D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该突变体经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，活性为67～148％；经3.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min后，活性为63～92％；经3.0～30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，活性为90～163％。本发明的一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D可应用于农业、制革、污水处理等行业。
权利要求 :
1.一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D，其特征在于，所述的突变体K321DH328D由木糖苷酶序列SEQ ID NO.3第321位的赖氨酸及第328位的组氨酸都突变为天冬氨酸得到，所述的突变体K321DH328D的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述盐耐受的盐为KCl、Na2SO4或Na2SO4。
2.权利要求1所述突变体K321DH328D的编码基因k321dh328d，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。
4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求2所述的编码基因。
5.权利要求1所述的木糖苷酶突变体K321DH328D的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）合成突变体K321DH328D的编码基因k321dh328d；
2）将1）中合成的序列和表达载体pEasy‑E1相连接，即可获得包含k321dh328d的表达载体；
3）将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达K321DH328D的重组菌株；
4）培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体K321DH328D表达；
5）回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体K321DH328D。
6.权利要求1所述的突变体K321DH328D在农业、制革和污水处理中的应用。
说明书 :
一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及蛋白质改造技术，具体为一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D及其应用。
背景技术
[0002] 木糖是一种来源丰富的五碳糖，其广泛存在于植物中，也存在于动物中。在植物中，木糖聚合而成木聚糖，木聚糖构成植物细胞壁的组成成分，约占植物细胞干重的15％～
35％。内切木聚糖酶(endo‑1,4‑β‑D‑xylanase，EC3.2.1.8)可随机地切割木聚糖的主链骨
架，生成低聚木糖，而木糖苷酶(β‑D‑xylosidase，EC3.2.1.37)可将低聚木糖水解为木糖
(Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29:3～23.)。除了木聚糖外，植物的糖蛋
白中也含有木糖，其可被木糖苷酶降解(Leszczuketal.PlantPhysiologyandBiochemist
ry,2019,139:681～690.)。此外，动物体内的蛋白聚糖也含有木糖，其也可被木糖苷酶降解
(Takagakietal.TheJournalofBiologicalChemistry,1990,265:854～860.)。木糖可作为
原料，用于生产乙醇、乳酸、木糖醇等。
35％。内切木聚糖酶(endo‑1,4‑β‑D‑xylanase，EC3.2.1.8)可随机地切割木聚糖的主链骨
架，生成低聚木糖，而木糖苷酶(β‑D‑xylosidase，EC3.2.1.37)可将低聚木糖水解为木糖
(Collinsetal.FEMSMicrobiologyReviews,2005,29:3～23.)。除了木聚糖外，植物的糖蛋
白中也含有木糖，其可被木糖苷酶降解(Leszczuketal.PlantPhysiologyandBiochemist
ry,2019,139:681～690.)。此外，动物体内的蛋白聚糖也含有木糖，其也可被木糖苷酶降解
(Takagakietal.TheJournalofBiologicalChemistry,1990,265:854～860.)。木糖可作为
原料，用于生产乙醇、乳酸、木糖醇等。
[0003] 氯化钾和硫酸铵是在农业种植中应用相对广泛的一种化肥；在皮革软化过程中，需要添加硫酸钠，在此过程中加入木聚糖酶，可达到促进皮纤维松散，提高成品革的柔软
度、手感和物理机械性能的效果(专利：ZL201710574969.3)。除了农业种植和制革外，盐还
广泛存在于其它的生产实践中，包括污水处理、洗涤、食品加工、造纸等。不耐盐的酶在应用
上具有一定的局限性，例如，不耐盐的木糖苷酶将无法和化肥同时施用，不利于降解农业废
料中的低聚木糖，从而导致木聚糖的循环利用降低，进一步导致土壤肥力降低。因此，为了
使酶具有更好的应用性，需要提高酶在盐中的稳定性。
度、手感和物理机械性能的效果(专利：ZL201710574969.3)。除了农业种植和制革外，盐还
广泛存在于其它的生产实践中，包括污水处理、洗涤、食品加工、造纸等。不耐盐的酶在应用
上具有一定的局限性，例如，不耐盐的木糖苷酶将无法和化肥同时施用，不利于降解农业废
料中的低聚木糖，从而导致木聚糖的循环利用降低，进一步导致土壤肥力降低。因此，为了
使酶具有更好的应用性，需要提高酶在盐中的稳定性。
发明内容
[0004] 针对上述技术问题，本发明的目的旨在提供一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D，K321DH328D可应用于农业、制革、污水处理等行业。
[0005] 为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 本发明通过蛋白质改造技术，设计了一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D，所述的突变体K321DH328D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，与GenBank记录
的木糖苷酶序列AQM74402(SEQ ID NO.3)相比，K321DH328D的第321位和328位氨基酸皆为
天冬氨酸，而AQM74402的第321位氨基酸为赖氨酸、第328位氨基酸为组氨酸。
的木糖苷酶序列AQM74402(SEQ ID NO.3)相比，K321DH328D的第321位和328位氨基酸皆为
天冬氨酸，而AQM74402的第321位氨基酸为赖氨酸、第328位氨基酸为组氨酸。
[0007] 所述的突变体K321DH328D在不同盐中的稳定性不同：K321DH328D经3.0～30.0％(w/v)的NaCl处理60min后，活性为22～36％；经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，活性
为67～148％；经3.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min后，活性为63～92％；经3.0～30.0％
(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，活性为90～163％。
为67～148％；经3.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min后，活性为63～92％；经3.0～30.0％
(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，活性为90～163％。
[0008] 本发明提供了所述的一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D的编码基因k321dh328d，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本发明的另一目的在于提供包含木糖苷酶突变体K321DH328D编码基因的重组载体。
[0010] 本发明的另一目的在于提供包含木糖苷酶突变体K321DH328D编码基因的重组菌。
[0011] 另外，本发明所述的木糖苷酶突变体K321DH328D在农业、制革和污水处理的应用也在本发明的保护范围内。
[0012] 本发明所述的一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D的制备方法，具体包括以下步骤：
[0013] 1)合成突变体K321DH328D的编码基因k321dh328d(SEQ ID NO.2)；
[0014] 2)将1)中合成的序列和表达载体pEasy‑E1相连接，即可获得包含k321dh328d的表达载体；
[0015] 3)将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达突变体K321DH328D的重组菌株；
[0016] 4)培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体K321DH328D表达；
[0017] 5)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体K321DH328D。
[0018] 本发明的有益效果为：
[0019] 与野生酶HJ14GH43相比，突变酶K321DH328D在高浓度KCl、Na2SO4和(NH4)2SO4中的稳定性得到了增强。经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，野生酶HJ14GH43的活性为28
～114％，突变酶K321DH328D的活性为67～148％；经10.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min
后，野生酶HJ14GH43的活性为47～78％，突变酶K321DH328D的活性为84～92％；经10.0～
30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，HJ14GH43的活性为38～116％，K321DH328D的活性为
116～163％。本发明的一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D可应用于农业、制
革、污水处理等行业。
～114％，突变酶K321DH328D的活性为67～148％；经10.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min
后，野生酶HJ14GH43的活性为47～78％，突变酶K321DH328D的活性为84～92％；经10.0～
30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，HJ14GH43的活性为38～116％，K321DH328D的活性为
116～163％。本发明的一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体K321DH328D可应用于农业、制
革、污水处理等行业。
附图说明
[0020] 图1是野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D的SDS‑PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；W：HJ14GH43；Mut：K321DH328D；
[0021] 图2是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在NaCl中的稳定性；
[0022] 图3是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在KCl中的稳定性；
[0023] 图4是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在Na2SO4中的稳定性；
[0024] 图5是纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在(NH4)2SO4中的稳定性。
具体实施方式
[0025] 下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实
施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属
于本发明保护的范围。
施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属
于本发明保护的范围。
[0026] 本发明以下实施例中的实验材料和试剂：
[0027] 1、菌株及载体：大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy‑E1购自北京全式金生物技术有限公司。
[0028] 2、酶类及其它生化试剂：pNP(p‑nitrophenol)和pNPX(p‑nitrophenyl‑β‑d‑xylopyranoside)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得
到)。
到)。
[0029] 3、培养基
[0030] LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
[0031] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书
进行。
进行。
[0032] 实施例1表达载体的构建和转化
[0033] 1)根据GenBank记录的木糖苷酶核苷酸序列KY391885(SEQ ID NO.4)，合成野生木糖苷酶HJ14GH43的编码基因hJ14GH43；另合成突变酶K321DH328D的编码基因k321dh328d
(SEQ ID NO.2)；
(SEQ ID NO.2)；
[0034] 2)将(1)中合成的序列分别和表达载体pEasy‑E1相连接，即可分别获得包含hJ14GH43和k321dh328d的表达载体；
[0035] 3)将连接产物分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得分别表达野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D的重组菌株。
[0036] 实施例2野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D的制备
[0037] 将含hJ14GH43和k321dh328d的重组菌株以0.1％的接种量分别接种于LB(含100μ‑1
gmL Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。
gmL Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。
[0038] 然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg mL‑1Amp)培养液中，快速振荡培养约2～3h(OD600达到0.6～1.0)后，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，于20℃
继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris～HCl缓冲液悬浮
菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，
吸取上清并用Nickel‑NTAAgarose和0～500mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白。
继续振荡培养约20h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0Tris～HCl缓冲液悬浮
菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12,000rpm离心10min后，
吸取上清并用Nickel‑NTAAgarose和0～500mM的咪唑分别亲和和洗脱目的蛋白。
[0039] SDS‑PAGE结果(图1)表明，野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在大肠杆菌中都得到了表达，经纯化后，产物均为单一条带。
[0040] 实施例3纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D的性质测定
[0041] 采用pNP法测定纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D的活性：将pNPX溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM；反应体系含50μL适量酶液，450μL的2mM底物；底物在反应温度
下预热5min后，加入酶液再反应适当时间，然后加2mL1MNa2CO3终止反应，冷却至室温后在
405nm波长下测定释放出的pNP；1个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生1μmolpNP所需
的酶量。
下预热5min后，加入酶液再反应适当时间，然后加2mL1MNa2CO3终止反应，冷却至室温后在
405nm波长下测定释放出的pNP；1个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生1μmolpNP所需
的酶量。
[0042] 1)纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在NaCl中的稳定性
[0043] 将纯化的酶液置于3.0～30.0％(w/v)NaCl水溶液中，在20℃下处理60min，然后在pH7.0及20℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应10min，测定
纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
[0044] 结果表明：野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在NaCl中的稳定性非常相似，两者都不太稳定，经3.0～30.0％(w/v)的NaCl处理60min后，野生酶HJ14GH43活性剩余20～
44％，突变酶K321DH328D活性剩余22～36％(图2)。
44％，突变酶K321DH328D活性剩余22～36％(图2)。
[0045] 2)纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在KCl中的稳定性
[0046] 将纯化的酶液置于3.0～30.0％(w/v)KCl水溶液中，在20℃下处理60min，然后在pH7.0及20℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应10min，测定
纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
[0047] 结果表明：突变酶K321DH328D在KCl中的稳定性优于野生酶HJ14GH43，经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，野生酶HJ14GH43的活性为28～114％，突变酶K321DH328D
的活性为67～148％(图3)。
的活性为67～148％(图3)。
[0048] 3)纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在Na2SO4中的稳定性
[0049] 将纯化的酶液置于3.0～30.0％(w/v)Na2SO4水溶液中，在20℃下处理60min，然后在pH7.0及20℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应10min，测
定纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
定纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
[0050] 结果表明：野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在Na2SO4中的稳定性不同，经3.0～30.0％(w/v)的Na2SO4处理60min后，野生酶HJ14GH43的酶活基本呈下降趋势，酶活剩余47
～86％，突变酶K321DH328D的酶活则呈现先下降后上升的趋势，酶活从63％可升至92％(图
4)。
～86％，突变酶K321DH328D的酶活则呈现先下降后上升的趋势，酶活从63％可升至92％(图
4)。
[0051] 4)纯化的野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在(NH4)2SO4中的稳定性
[0052] 将纯化的酶液置于3.0～30.0％(w/v)(NH4)2SO4水溶液中，在20℃下处理60min，然后在pH7.0及20℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应10min，
测定纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
测定纯化的HJ14GH43以及突变酶K321DH328D的酶学性质。
[0053] 结果表明：野生酶HJ14GH43和突变酶K321DH328D在(NH4)2SO4中的稳定性不同，经3.0～30.0％(w/v)的(NH4)2SO4处理60min后，野生酶HJ14GH43的活性为38～122％，突变酶
K321DH328D的活性为90～163％(图5)。
K321DH328D的活性为90～163％(图5)。
[0054] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和
变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。