一种转染NK细胞的基因和转染载体

摘要

本发明提供了一种转染NK细胞的基因和转染载体，属于基因工程技术领域，将ICasp9基因、T2A基因、IL15基因、T2A基因、NGFR基因、T2A基因和目的基因顺次串联。将本发明提供的转染NK细胞的基因连接到pCMV载体中，得到转染NK细胞的载体，将所述载体转染NK细胞后再经过药物筛选和流式筛选，得到表达目的基因的NK细胞，表达目的基因的NK细胞可以同时表达开关结构，在诱导物添加时即可引起自杀反应，防止了表达IL‑15的NK细胞长期存在，也可以在915NGFR细胞出现副作用时进行干预。

权利要求

1.一种转染NK细胞的基因，其特征在于，将ICasp9基因、T2A基因、IL15基因、T2A基因、NGFR基因、T2A基因和目的基因顺次串联；

所述目的基因包括GFP绿色荧光蛋白基因；

所述ICasp9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述T2A基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述IL15基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述NGFR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种转染NK细胞的载体，其特征在于，将权利要求1所述的基因连接到pCMV载体中，得到转染NK细胞的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述基因连接到pCMV载体中的体系每20μl包括：权利要求1所述的基因50ng、pCMV载体50ng、T4连接酶4000单位，溶剂为ddH2O。

4.根据权利要求2或3所述的载体，其特征在于，所述基因连接到pCMV载体中的条件包括：所述基因连接到pCMV载体中的时间为1.8～2.2h，所述基因连接到pCMV载体中的温度为

20～30℃。

说明书

一种转染NK细胞的基因和转染载体

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种转染NK细胞的基因和转染载体。

背景技术

[0002] NK细胞占正常成人循环血淋巴细胞中约15％，是一种固有免疫细胞。 NK细胞可识别和清除病原体感染以及突变的细胞。NK细胞作为一种固有免疫效应细胞，自1975年首次报道以来，展现出对靶细胞强大的杀伤能力。由于原代NK细胞增殖能力有限，而使用NK细胞系摆脱了昂贵的NK体外培养体系，降低了生产时间，因此在临床广为应用。其中NK-92细胞于1992 年分离自一名白人男性，是最容易基因编辑和修饰的NK细胞系，在临床广泛应用。NK92的增殖依赖较高浓度的白细胞介素。NK92细胞在治疗中需不断给病人回输大量的白细胞介素。白细胞介素是NK92细胞存续的保证，也是控制不良反应的机制。一旦白细胞介素撤除，NK92细胞即会短期内凋亡。白介素大量使用时副作用较高，因此需要一种方法降低或避免使用白介素。让NK92细胞自我表达白介素是一种可行的方式。如中国专利 CN03152968.2过表达了IL-15于NK92中，使细胞自己可以分泌一定量的 IL-15，避免了大量使用IL-15导致副作用。同时免除了培养过程中白介素的添加，简化了NK92细胞的培养。

[0003] 然而由于转入了IL-15的NK细胞可以无限增殖，因此具有潜在的致瘤性。NK细胞杀伤能力强，NK细胞治疗过程中也有可能导致急性或慢性过敏反应。以上这些问题急需临床应用该细胞时引入一种开关机制，在需要时及时终止NK92细胞的存续。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种转染NK细胞的基因和转染载体。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种转染NK细胞的基因，将ICasp9基因、T2A基因、IL15 基因、T2A基因、NGFR基因、T2A基因和目的基因顺次串联；所述目的基因包括GFP绿色荧光蛋白基因。

[0007] 优选的，所述ICasp9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0008] 优选的，所述T2A基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0009] 优选的，所述IL15基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

[0010] 优选的，所述NGFR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

[0011] 本发明还提供了一种转染NK细胞的载体，将上述技术方案所述的基因连接到pCMV载体中，得到转染NK细胞的载体。

[0012] 优选的，所述连接的体系每20μl包括：上述技术方案所述的基因50ng、 pCMV载体50ng、T4连接酶4000单位，溶剂为ddH2O。

[0013] 优选的，所述连接的条件包括：所述连接的时间为1.8～2.2h，所述连接的温度为20～30℃。

[0014] 本发明提供了一种编辑NK细胞的基因和转染载体，将ICasp9基因、 T2A基因、IL15基因、T2A基因、NGFR基因、T2A基因和目的基因顺次串联。通过对合成的基因之后进行酶切和连接反应将本发明提供的编辑NK 细胞的基因连接到pCMV载体中，得到转染NK细胞的载体，将该载体转染 NK细胞后再经过药物筛选和流式筛选，得到915NGFR细胞，915NGFR细胞可以同时表达开关结构，在诱导物添加时即可引起自杀反应，防止了表达 IL-15的NK细胞长期存在，也可以在915NGFR细胞出现副作用时进行干预。

附图说明

[0015] 图1为重组质粒的结构示意图；

[0016] 图2为无IL-2培养条件下细胞直径变化折线图；

[0017] 图3为无IL-2培养细胞数量变化折线图；

[0018] 图4为无IL-2培养条件下细胞活力变化折线图；

[0019] 图5为不同编辑载体GFP表达率散点图；

[0020] 图6为不同浓度诱导剂引发表达iCasp9的NK细胞凋亡图；

[0021] 图7为诱导剂特异引发表达iCasp9的NK细胞凋亡信号柱形图；

[0022] 图8为IL-15分泌量柱形图；

[0023] 图9为细胞筛选技术路线示意图。

具体实施方式

[0024] 本发明提供了一种转染NK细胞的基因，将ICasp9基因、T2A基因、IL15 基因、T2A基因、NGFR基因、T2A基因和目的基因顺次串联，所述目的基因包括GFP绿色荧光蛋白基因。

[0025] 在本发明中，所述ICasp9基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：

[0026] ggagtgcaggtggagactatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtg gtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatg ctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaact gactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgat gtggagcttctaaaactggaatctggcggtggatccggagtcgacggatttggtgatgtcggtgctcttgagagtttg aggggaaatgcagatttggcttacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctcattatcaacaatgtgaacttct gccgtgagtccgggctccgcacccgcactggctccaacatcgactgtgagaagttgcggcgtcgcttctcctcgct gcatttcatggtggaggtgaagggcgacctgactgccaagaaaatggtgctggctttgctggagctggcgcggcag gaccacggtgctctggactgctgcgtggtggtcattctctctcacggctgtcaggccagccacctgcagttcccagg ggctgtctacggcacagatggatgccctgtgtcggtcgagaagattgtgaacatcttcaatgggaccagctgcccca gcctgggagggaagcccaagctctttttcatccaggcctgtggtggggagcagaaagaccatgggtttgaggtggc ctccacttcccctgaagacgagtcccctggcagtaaccccgagccagatgccaccccgttccaggaaggtttgagg accttcgaccagctggacgccatatctagtttgcccacacccagtgacatctttgtgtcctactctactttcccaggtttt gtttcctggagggaccccaagagtggctcctggtacgttgagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcactc tgaagacctgcagtccctcctgcttagggtcgctaatgctgtttcggtgaaagggatttataaacagatgcctggttgct ttaatttcctccggaaaaaacttttctttaaaacatca。

[0027] 在本发明中，所述ICasp9基因的作用是：表达为可诱导型的Casp9蛋白，在小分子化合物诱导下二聚化，启动Caspase9信号通路，进而激活 Caspase3。Caspase3激活导致多种细胞器的降解，线粒体破坏，细胞膜外翻，细胞核裂解，细胞死亡。因而ICasp9基因可以作为CAR-NK细胞凋亡开关，在需要时诱发保护机制，有效避免细胞因子风暴和自身免疫病等风险事件。

[0028] 在本发明中，所述T2A基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

[0029] gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccct。

[0030] 在本发明中，所述IL15基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

[0031] agaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaact gaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaat aagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcacccc agttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcat gatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaag aatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacactt ct。

[0032] 在本发明中，所述IL15基因的作用是：与欲导入的基因共表达，表达后与IL-15受体结合激活NK。从而大幅提高转染质粒之后的细胞增殖速率，提高获得转染后细胞的比例。进而利用不含白介素(如NK细胞培养中常见的IL-2)的培养基可加速淘汰未编辑的野生型NK细胞。表达IL-15基因的 NK细胞在体内应用时，可以避免常规NK细胞产品需要联合注射白介素的弊端，提高NK体内延续性。

[0033] 在本发明中，所述NGFR基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示，具体序列如下所示：

[0034] gccacaaccatgggggcaggtgccaccggccgcgccatggacgggccgcgcctgctgctgttgctgcttc tgggggtgtcccttggaggtgccaaggaggcatgccccacaggcctgtacacacacagcggtgagtgctgcaaa gcctgcaacctgggcgagggtgtggcccagccttgtggagccaaccagaccgtgtgtgagccctgcctggacag cgtgacgttctccgacgtggtgagcgcgaccgagccgtgcaagccgtgcaccgagtgcgtggggctccagagca tgtcggcgccgtgcgtggaggccgacgacgccgtgtgccgctgcgcctacggctactaccaggatgagacgact gggcgctgcgaggcgtgccgcgtgtgcgaggcgggctcgggcctcgtgttctcctgccaggacaagcagaacac cgtgtgcgaggagtgccccgacggcacgtattccgacgaggccaaccacgtggacccgtgcctgccctgcaccg tgtgcgaggacaccgagcgccagctccgcgagtgcacacgctgggccgacgccgagtgcgaggagatccctgg ccgttggattacacggtccacacccccagagggctcggacagcacagcccccagcacccaggagcctgaggca cctccagaacaagacctcatagccagcacggtggcaggtgtggtgaccacagtgatgggcagctcccagcccgtg gtgacccgaggcaccaccgacgcggccgccagcacagtggtcgacgataaaataaaagattttatttag。

[0035] 在本发明中，所述NGFR基因的作用是：提供一种低免疫原性的分选标签。虽然NGFR之前未在NK细胞的筛选中有相关的应用记载，但NGFR 在NK细胞系中本底表达较低，是一种较好的表达标签蛋白，利于后期通过磁力筛选等方式建立细胞系。由于本发明提供的转染NK细胞的基因中含有 IL-15基因过表达元件，可以加速目标基因的共表达获得速度，因此很好的克服了NGFR基因较大，难于表达的NK细胞应用瓶颈。

[0036] 本发明还优选在优选在所述基因的两端加入侧翼序列，在5‘端加入NheI 酶切位点侧翼序列GCTAGC，在基因3‘端加入XbaI酶切位点侧翼序列 TCTAGA。

[0037] 在本发明中，所述目的基因包括GFP绿色荧光蛋白基因，所述GFP绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下所示：

[0038] atggagagcgacgagagcggcctgcccgccatggagatcgagtgccgcatcaccggcaccctgaacggc gtggagttcgagctggtgggcggcggagagggcacccccaagcagggccgcatgaccaacaagatgaagag caccaaaggcgccctgaccttcagcccctacctgctgagccacgtgatgggctacggcttctaccacttcggcac ctaccccagcggctacgagaaccccttcctgcacgccatcaacaacggcggctacaccaacacccgcatcgag aagtacgaggacggcggcgtgctgcacgtgagcttcagctaccgctacgaggccggccgcgtgatcggcgac ttcaaggtggtgggcaccggcttccccgaggacagcgtgatcttcaccgacaagatcatccgcagcaacgccac cgtggagcacctgcaccccatgggcgataacgtgctggtgggcagcttcgcccgcaccttcagcctgcgcgac ggcggctactacagcttcgtggtggacagccacatgcacttcaagagcgccatccaccccagcatcctgcagaa cgggggccccatgttcgccttccgccgcgtggaggagctgcacagcaacaccgagctgggcatcgtggagtac cagcacgccttcaagacccccatcgccttcgccagatcccgcgctcagtcgtccaattctgccgtggacggcacc gccggacccggctccaccggatctcgc。

[0039] 本发明还提供了一种转染NK细胞的载体，将上述技术方案所述的基因连接到pCMV载体中，得到转染NK细胞的载体。

[0040] 在本发明中，所述NK细胞优选为NK92细胞。

[0041] 在本发明中，所述连接的体系优选每20μl包括：上述技术方案所述的基因50ng、pCMV载体50ng、T4连接酶4000单位，溶剂为ddH2O。在本发明中，所述连接的条件优选包括：所述连接的时间优选为1.8～2.2h，更优选为2h；所述连接的温度优选为20～30℃。

[0042] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0043] 实施例1

[0044] 转染NK细胞的基因：ICasp9-T2A-IL15-T2A-NGFR-T2A-感兴趣的目的基因(感兴趣的目的基因如GFP绿色荧光蛋白基因)亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pCMV中。通过基因合成，合成时在基因5‘端加入NheI酶切位点侧翼序列GCTAGC，在基因3‘端加入XbaI酶切位点侧翼序列TCTAGA。使用NheI和XbaI 10U(Neb公司)于20μl Cutsmart体系中酶切合成的基因片段与pCMV质粒各1μg 1h。

[0045] 将酶切后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切取单一条带后进行胶回收。回收得到的基因片段与pCMV质粒分别取50ng，加入T4连接酶(ABclonal 公司)4000单位，用纯水补足体积于20μl后，室温连接2h，得到转染NK 细胞的载体。取1μl连接产物转化大肠杆菌DH5-alpha(全式金)，通过卡那霉素抗性筛选有效的单克隆并进行酶切验证。验证后菌种进行保存，直至需要使用时参考质粒大提试剂盒说明书进行大量细菌的摇取和质粒的提取(无内毒素质粒大提试剂盒，天根)。

[0046] 细胞培养：NK92细胞(来自ATCC)淋巴细胞培养基(大连珑辉生物技术公司，LY-08)培养，补加10％FBS(gibco,11099-141)，1％双抗(HyClone，sv30010)，1％BioMyc-3(BI，03-038-1B)，1000IU/ml IL-2(双鹭药业，注射用人重组白介素-2)，于细胞培养箱(Thermo，
5
HERAcell 240i)37℃， 5％CO2培养，每24h更换培养基，调整细胞密度至5×10个/ml。

[0047] 质粒转染：NK92细胞400g离心5min(eppendorf，5804R)，去除培养基，加入10ml无血清1640培养基(gibco，11875-093)重悬，400g离心 5min，去除上清，取1×107个细胞重悬于120μl无血清1640培养基中，加入 8μg质粒(上步骤提取得到)混匀，加至120μl电击管(Celetrix，12-0104) 中，电转仪(Celetrix，CTX-1500A)电转条件为电压600mV，电击时间30ms。电转后细胞立即转入20ml LY-08培养基中(包含10％FBS，1％双抗，1％ BioMyc-3，
1000IU/ml IL-2)培养48h后换液继续培养。

[0048] 药物筛选：细胞电转一周后加入puromycin(InvivoGen，ant-pr)，1μg/ml，培养筛选，每24h更换培养基，调整细胞密度至5×105个/ml。细胞数目达到 3×107个时进行流式筛选。

[0049] 流式筛选：待筛选细胞400g离心5min，去除培养基，无血清LY-08 培养基重悬，调整细胞密度至0.6×107个/ml，过70μm细胞筛，流式分选仪(SONY，SH800S)分选，收集强阳性活细胞，培养增殖，此时得到 915NGFR细胞。

[0050] 915NGFR细胞表达IL-15，在体外表现为增殖快，在体内，可在无细胞因子的环境下长期存在，尤其适应体内长期存在，并激活抗肿瘤免疫反应；915NGFR细胞可以同时表达开关结构，在诱导物添加时即可引起自杀反应。防止了表达IL-15的NK92细胞长期存在，也可以在NK92-915NGFR 细胞出现副作用时进行干预。

[0051] 实施例2

[0052] 与NK92比较，实施例得到的915NGFR细胞去除白介素培养时的形态学变化：

[0053] 实验方法：

[0054] 细胞培养：NK92、915NGFR各取5×105个细胞于1ml LY-08培养基培养，补加10％FBS，1％双抗，1％BioMyc-3，无IL-2，细胞培养箱37℃， 5％CO2，每24h更换培养基，调整细胞密度至5×105个/ml。取20μl细胞AOPI 染色，细胞计数仪测量细胞直径，连续检测记录4天，结果见表1和图2。

[0055] 表1培养细胞直径比较表

[0056]

[0057] 从表1和图2中可以得出，培养中，915NGFR在无IL-2条件下仍可快速增殖，细胞直径不变。而NK92细胞逐渐萎缩，死亡。

[0058] 实施例3

[0059] NK92比较，实施例1得到的915NGFR细胞去除白介素培养时的数量和活率变化：

[0060] 试验方法：

[0061] NK92、915NGFR各取5×105个细胞于1ml LY-08培养基培养，补加 10％FBS，1％双抗，1％BioMyc-3，无IL-2，细胞培养箱37℃，5％CO2，每24h更换培养基，调整细胞密度至5×105个/ml。取20μl细胞AOPI (Nexcelom，CS2-0106-5ml)染色，细胞计数仪(Nexcelom，CellometerK2) 计数细胞数目，记录细胞活率。连续检测记录4天，结果见图3和图4。

[0062] 从图3和图4中可以看出，细胞增殖数量变化中，915NGFR在无IL-2 条件下仍可快速增殖，数量增多，存活率基本维持不变，而NK92细胞无法继续增殖，存活率逐步下降。

[0063] 实施例4

[0064] 915NGFR载体与9-NGFR载体导入基因表达效率比较，以导入GFP 基因为例，IL-15基因的共同表达有效提高构建效率。

[0065] 试验方法：比较含有IL-15和不含IL-15基因表达对基因编辑效率的影响。分别构建915NGFR转染质粒载体与删除IL-15部件的载体(称为 9-NGFR)，以GFP作为目的基因检测细胞构建效率。细胞电转两种质粒后培养一周，通过流式细胞仪检测GFP阳性率，结果见图5。

[0066] 从图5中可以看出，加入IL-15模块后，有效提高转入质粒后的细胞增殖速率，加快转入质粒的细胞增殖。因此可见高表达GFP基因的细胞群落，呈聚集分布。而不加入IL-15模块时，阴性阳性细胞不展现出增殖速率差异，从而见细胞GFP表达呈现连续分布。

[0067] 实施例5

[0068] 不同浓度诱导剂浓度依赖性的导致915NGFR细胞凋亡

[0069] 试验方法

[0070] 实施例1制备的915NGFR细胞取3组5×105个细胞分别于1ml LY-08 培养基培养，分别加入AP1903(MCE)(100μM)0μl、0.1μl、1μl，培养12h。

[0071] 细胞400g离心5min，去除培养基，加入100μl Stainingbuffer(Biolegend) 重悬，加入PI染料(sigma，P4170)10μl/样，室温避光染色10min，加入 200μl Stainingbuffer混匀，流式仪(BD，LSRFortessa)分析凋亡结果，结果见图6。

[0072] 从图6中可以得出，加入AP1903至终浓度10nM即可导致细胞48.9％凋亡。加入AP1903至终浓度100nM更可以导致61.4％细胞发生凋亡。

[0073] 实施例6

[0074] AP1903特异诱导915NGFR细胞凋亡，而不诱导NK92细胞凋亡

[0075] 试验方法

[0076] NK92、实施例1制备的915NGFR各取5×105个细胞分别于1ml LY-08 培养基培养，分别加入AP1903(100μM)1μl，培养12h。

[0077] 细胞400g离心5min，去除培养基，加入100μl Stainingbuffer重悬，加入PI染料10μl/样，室温避光染色10min，加入200μl Stainingbuffer混匀，流式仪分析凋亡结果，结果见图7。

[0078] 从图7中可以得出，NK92不会在加入AP1903(100μM)后发生凋亡而915NGFR细胞很快发生高比例的细胞凋亡(61％细胞PI染色阳性，即发生凋亡)。

[0079] 实施例7

[0080] 培养基中IL-15含量检测(与公认的IL-15分泌细胞NK92-MI比较)

[0081] 试验方法

[0082] 实施例1制备的915NGFR，NK92，NK92-MI各取5×105个细胞分别于1ml LY-08培养基培养，补加10％FBS，1％双抗，1％BioMyc-3，1000IU/ml IL-2，于细胞培养箱37℃，5％CO2培养，分别于24h和48h取培养基上清。

[0083] 进一步使用依科赛生物技术公司人IL-15试剂盒(EH057)。

[0084] 1、制备标准品并稀释其浓度为500、250、62.5、31.25、15.625、 7.8、0pg/ml，分别将上清标本及不同浓度的标准品加入相应孔中，100μl/ 孔，随后在样品和标准品孔中加入50μl生物素化抗体工作液，封板胶纸封住反应空，室温120min。

[0085] 2、洗板机洗板，注入洗涤液350μl，注入与吸出间隔20s，洗板5次。

[0086] 3、除空白孔外加入酶结合物工作液，100μl/孔，室温，避光孵育60min。

[0087] 4、洗板机洗板，注入洗涤液350μl，注入与吸出间隔20s，洗板5次。

[0088] 5、加入显色底物(包括空白孔)100μl/孔，室温，避光孵育15min。

[0089] 6、加入终止液(包括空白孔)100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值 (Thermo，1510)，根据标准品绘制标准曲线，计算样品IL-15浓度。结果见图8。

[0090] 从图8中可以看出，NK92细胞释放IL15较少而915NGFR细胞可以大量释放IL15，24h上清IL-15浓度约18.4pg/ml，48h上清IL-15浓度约 26.9pg/ml。公知的IL-15分泌型NK92细胞亚型NK92-MI在24h上清IL-15 浓度约7.3pg/ml，48h上清IL-15浓度仅8.3pg/ml。

[0091] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。