抗PD-L1抗体及其用途转让专利
申请号 : CN201880044363.1
文献号 : CN110869390B
文献日 : 2021-05-11
发明人 : 李博华 , 王华菁 , 何晓文
申请人 : 上海原能细胞医学技术有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段能够与PD‑L1蛋白相结合,所述抗体包含抗体轻链或其片段和抗体重链或其片段,所述抗体轻链或其片段包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述抗体重链或其片段包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,其中,所述抗体包含选自以下任意一组的氨基酸序列:
(1)LCDR1:SEQ ID NO:54、LCDR2:SEQ ID NO:60、LCDR3:SEQ ID NO:63、HCDR1:SEQ ID NO:46、HCDR2:SEQ ID NO:48和HCDR3:SEQ ID NO:50;
(2)LCDR1:SEQ ID NO:55、LCDR2:SEQ ID NO:60、LCDR3:SEQ ID NO:64、HCDR1:SEQ ID NO:47、HCDR2:SEQ ID NO:48和HCDR3:SEQ ID NO:51;
(3)LCDR1:SEQ ID NO:55、LCDR2:SEQ ID NO:60、LCDR3:SEQ ID NO:64、HCDR1:SEQ ID NO:47、HCDR2:SEQ ID NO:48和HCDR3:SEQ ID NO:52;
(4)LCDR1:SEQ ID NO:56、LCDR2:SEQ ID NO:61、LCDR3:SEQ ID NO:64、HCDR1:SEQ ID NO:47、HCDR2:SEQ ID NO:48和HCDR3:SEQ ID NO:52;
(5)LCDR1:SEQ ID NO:57、LCDR2:SEQ ID NO:61、LCDR3:SEQ ID NO:64、HCDR1:SEQ ID NO:47、HCDR2:SEQ ID NO:48和HCDR3:SEQ ID NO:52;和,(6)LCDR1:SEQ ID NO:58、LCDR2:SEQ ID NO:61、LCDR3:SEQ ID NO:64、HCDR1:SEQ ID NO:47、HCDR2:SEQ ID NO:48和HCDR3:SEQ ID NO:52。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体轻链或其片段还包括框架区L‑FR1,L‑FR2,L‑FR3,和L‑FR4。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述框架区选自以下组:人共有框架序列和人种系序列。
4.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述L‑FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连,所述L‑FR1包含SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述L‑FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,所述L‑FR2包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述L‑FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,所述L‑FR3包含如SEQ ID NO:73‑75中任意一项所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述L‑FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连,所述L‑FR4包含SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL,且所述轻链可变区VL包含选自以下组中任意一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区,且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体轻链或其片段包含选自以下组中任意一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体重链或其片段还包括框架区H‑FR1,H‑FR2,H‑FR3,和H‑FR4。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述框架区选自以下组:人共有框架序列和人种系序列。
13.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述H‑FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连,所述H‑FR1包含选自SEQ ID NO:65‑67中任意一项所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述H‑FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,所述H‑FR2包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述H‑FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,所述H‑FR3包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述H‑FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,所述H‑FR4包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH,且所述重链可变区VH包含选自以下组中任意一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35。
18.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体重链或其片段还包含人恒定区,且所述人恒定区包括人IgG1恒定区。
19.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体重链或其片段包含选自下组中任意一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO: 32和SEQ ID NO:36。
20.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述PD‑L1蛋白选自下组:人PD‑L1蛋白、猴PD‑L1蛋白和鼠PD‑L1蛋白。
21.双特异性抗体,其包含能够特异性结合PD‑L1蛋白的第一靶向部分,其中所述第一靶向部分包含权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求21所述的双特异性抗体,其包含能够特异性结合CD137蛋白的第二靶向部分,其中所述第二靶向部分包含能够结合CD137蛋白的抗体或其抗原结合片段。
23.根据权利要求22所述的双特异性抗体,其中所述能够结合CD137蛋白的抗体包含scFv,且所述scFv包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求22或23所述的双特异性抗体,其包含第一多肽链和第二多肽链,其中所述第一多肽链包含所述能够结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区,所述能够结合CD137蛋白的抗体的重链可变区,以及所述能够结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区;且所述第二多肽链包含所述能够结合PD‑L1蛋白的抗体的轻链可变区。
25.根据权利要求24所述的双特异性抗体,其中所述第一多肽链中,所述能够结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区位于所述能够结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端,且所述能够结合CD137蛋白的抗体的重链可变区位于所述能够结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端;
或者,所述能够结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区位于所述能够结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端,且所述能够结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区位于所述能够结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
26.根据权利要求24所述的双特异性抗体,所述第一多肽链中所述能够结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区与所述能够结合CD137蛋白的抗体的重链可变区构成scFv。
27.根据权利要求24所述的双特异性抗体,其中所述第一多肽链中还包含人IgG恒定区,所述人IgG恒定区位于所述能够结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述能够结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端;或者,所述人IgG恒定区位于所述能够结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述能够结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
28.根据权利要求24所述的双特异性抗体,其中所述第一多肽链包含选自下组中任意一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。
29.根据权利要求24所述的双特异性抗体,其中所述第二多肽链包括选自SEQ ID NO:
15或SEQ ID NO: 34所示的氨基酸序列。
30.分离的一种或多种核酸分子,其编码权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求21‑29中任一项所述的双特异性抗体。
31.载体,其包含根据权利要求30所述的核酸分子。
32.细胞,其包含根据权利要求30所述的核酸分子或根据权利要求31所述的载体。
33.制备权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求21‑29中任一项所述的双特异性抗体的方法,所述方法包括在使得权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求21‑29中任一项所述的双特异性抗体表达的条件下,培养根据权利要求32所述的细胞。
34.药物组合物,其包含权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,权利要求21‑29中任一项所述的双特异性抗体,权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体和/或权利要求32所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
35.权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求21‑29中任一项所述的双特异性抗体,权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体、权利要求32所述的细胞和/或权利要求34所述的药物组合物在制备缓解或治疗肿瘤的药物中的用途,其中所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
36.权利要求1‑20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求21‑29中任一项所述的双特异性抗体,权利要求30所述的核酸分子、权利要求31所述的载体、权利要求32所述的细胞和/或权利要求34所述的药物组合物在制备抑制PD‑L1蛋白和PD‑1蛋白结合的试剂中的用途,其中所述PD‑L1蛋白选自下组:人PD‑L1蛋白、猴PD‑L1蛋白和鼠PD‑L1蛋白。
说明书 :
抗PD‑L1抗体及其用途
技术领域
背景技术
共刺激信号时,T细胞难以感受抗原刺激,不能产生有效免疫应答,还可导致对异源抗原的
衰竭或耐受。PD‑1可在T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、激活的单核细胞和树突状细胞(DCs)
+ +
上表达。PD‑1可由被活化的,但未被刺激的人CD4 和CD8T细胞、B细胞和骨髓细胞表达。PD‑
L1和PD‑L2在表达模式上有所不同。PD‑L1可表达于造血细胞,也可在多种非造血细胞表达,
而PD‑L2的表达主要限于树突状细胞和巨噬细胞。B7.1(CD80)也是PD‑L1的受体,它表达于
激活的B细胞,T细胞,巨噬细胞和树突状细胞。作为PD‑1和B7.1的配体,PD‑L1还选择性表达
于多种肿瘤细胞。抑制PD‑L1信号转导,包括阻断PD‑L1与PD‑1、B7.1任一或两者的相互作
用,从而阻止PD‑L1发送负性共刺激信号给T细胞和其它抗原呈递细胞,这可能增强对感染
(如急性和慢性)应答的免疫以及肿瘤免疫。
细胞溶解性T淋巴细胞应答,发挥抗肿瘤作用。CD137靶向疗法的抗肿瘤作用通过利用激动
型抗小鼠CD137单克隆抗体的小鼠体内抗肿瘤疗效研究证实。
疗效,结果表明两种抗体联合应用显示出比两者单用显著增强的抑瘤活性,但从顺应性和
疼痛的角度给患者带来不便,并且增加了治疗费用。研制这两种单克隆抗体的双特异抗体
(Bispecific antibody,BsAb)因其含有两种特异性抗原结合位点可解决以上问题。因此,
亟待开发新的抗PD‑L1抗体使其具有更加的药效和更低的免疫原性,以及PD‑L1/CD137双特
异性抗体以获得更好的抗肿瘤效果。
发明内容
白的结合;3)能够缓解或治疗肿瘤。本申请也提供了一种双特异性抗体具有下列性质中的
一种或多种:1)能够以较高的亲和力和特异性结合PD‑L1蛋白;2)能够以较高的亲和力和特
异性结合CD137蛋白;3)能够增强T细胞功能;4)能够缓解或治疗肿瘤。本申请还提供了所述
PD‑L1抗体、其抗原结合片段或变体、双特异性抗体的制备方法和应用。
S、R或V;X2是D、E或S;X3是N或R;X4是Y或E,且其中所述LCDR1根据抗体Kabat编号的索引确
定。
的氨基酸序列X1NSX2RPS,其中X1是G或E;X2是N或I,且其中所述LCDR2根据抗体Kabat编号的
索引确定。在某些实施方式中,所述LCDR2包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:60‑61。
在某些实施方式中,所述抗体轻链或其片段包含LCDR3,且所述LCDR3包含SEQ ID NO:62所
示的氨基酸序列:QSYDSSLSGX1V,其中X1是S或T,且其中所述LCDR3根据抗体Kabat编号的索
引确定。
实施方式中,所述L‑FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连,所述L‑FR1包含选自
下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:71。在某些实施方式中,所述L‑FR2位于所述LCDR1与所述
LCDR2之间,所述L‑FR2包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:72。在某些实施方式中,所
述L‑FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,所述L‑FR3包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID
NO:73‑75。在某些实施方式中,所述L‑FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连,所
述L‑FR4包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:76。
NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。在某些实施方式中,所述抗体重链或其片
段包含HCDR2,所述HCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列,且其中所述HCDR2根据抗体
Kabat编号的索引确定。在某些实施方式中,所述抗体重链或其片段包含HCDR3,且所述
HCDR3包含选自SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列:TMX1X2YX3X4GNX5DY,其中X1是D、E或G,X2是
G或E,X3是S或G,X4是Y或F,X5是F或Y,且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。在
某些实施方式中,所述HCDR3包含选自下组所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:50‑52。
实施方式中,所述H‑FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连,所述H‑FR1包含选自
下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:65‑67。在某些实施方式中,所述H‑FR2位于所述HCDR1与所
述HCDR2之间,所述H‑FR2包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:68。在某些实施方式中,
所述H‑FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,所述H‑FR3包含选自下组的氨基酸序列:SEQ
ID NO:69。在某些实施方式中,所述H‑FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,所
述H‑FR4包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:70。
NO:35。
些实施方式中,所述抗体轻链或其片段还包括框架区L‑FR1、L‑FR2、L‑FR3和L‑FR4。在某些
实施方式中,所述框架区选自以下组:人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中,
所述L‑FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连,所述L‑FR1包含以下的氨基酸序
列:SEQ ID NO:89。在某些实施方式中,所述L‑FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,所述L‑
FR2包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:90。在某些实施方式中,所述L‑FR3位于所述LCDR2
与所述LCDR3之间,所述L‑FR3包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:91。在某些实施方式中,
所述L‑FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连,所述L‑FR4包含以下的氨基酸序
列:SEQ ID NO:92。
述抗体重链或其片段还包括框架区H‑FR1、H‑FR2、H‑FR3和H‑FR4。在某些实施方式中,所述
框架区选自以下组:人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中,所述H‑FR1的C末端
与所述HCDR1的N末端直接或间接相连,所述H‑FR1包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:84‑
85。在某些实施方式中,所述H‑FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,所述H‑FR2包含以下的
氨基酸序列:SEQ ID NO:86。在某些实施方式中,所述H‑FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之
间,所述H‑FR3包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:87。在某些实施方式中,所述H‑FR4的N末
端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,所述H‑FR4包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:
88。
蛋白相结合,且以8×10 M或更低的KD值与CD137蛋白相结合。
体。在某些实施方式中,所述结合CD137蛋白的抗体包含scFv,且所述scFv包含选自以下的
氨基酸序列:SEQ ID NO:83。在某些实施方式中,所述的双特异性抗体包含第一多肽链和第
二多肽链,其中所述第一多肽链包含所述结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区,所述结合
CD137蛋白的抗体的重链可变区,以及所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区;且所述第
二多肽链包含所述结合PD‑L1蛋白的抗体的轻链可变区。
链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端;或者,所述结合PD‑L1蛋白的
抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端,且所述结合CD137
蛋白的抗体的轻链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
可变区的N端;或者,所述人IgG恒定区位于所述结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区的C端
且位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
序列:SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:34。
特异性抗体表达的条件下,培养所述的细胞。
学上可接受的佐剂。
治疗肿瘤的药物中的应用。
所述的细胞和/或所述的药物组合物。
识到的,本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱
离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地,本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例
性的,而非为限制性的。
附图说明
要说明书如下:
CDR。进行亲和力成熟时YN003各CDR区(包括CDR区中部分氨基酸残基及与CDR区临近的FR区
中个别氨基酸残基)随机化靶向的氨基酸残基以斜体字母表示。
具体实施方式
免疫球蛋白,并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体
片段或抗体衍生物,包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如,scFv),
以及与抗原结合的抗体片段(例如,Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所
有重组体形式,例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗
原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻
链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区
(CDR)的高变区,它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR
和四个FR区构成,它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、
CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导
该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞
(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
节T细胞抗原受体信号传导,并建议在维持自身耐受中起作用。缺乏共刺激信号时,T细胞难
以感受抗原刺激,不能产生有效免疫应答,还可导致对异源抗原的衰竭或耐受。PD‑L1可表
达于造血细胞,也可在多种非造血细胞表达。B7.1(CD80)也是PD‑L1的受体,它表达于激活
的B细胞,T细胞,巨噬细胞和树突状细胞。作为PD‑1和B7.1的配体,PD‑L1还选择性表达于多
种肿瘤细胞。抑制PD‑L1信号转导,包括阻断PD‑L1与PD‑1、B7.1任一或两者的相互作用,从
而阻止PD‑L1发送负性共刺激信号给T细胞和其它抗原呈递细胞,这可能增强对感染(如急
性和慢性)应答的免疫以及肿瘤免疫。
究表明CD137激动型单克隆抗体在许多模型中增加共刺激分子表达,并且显著增强细胞溶
解性T淋巴细胞应答,发挥抗肿瘤作用。CD137靶向疗法的抗肿瘤作用可以通过利用激动型
抗小鼠CD137单克隆抗体的小鼠体内抗肿瘤疗效研究证实。CD137已经成为免疫细胞的有力
激活剂,并成为治疗各种疾病的重要候选抗原。(参见Vinay,Dass S.,and Byoung
S.Kwon.″4‑1BB(CD 137),an inducible costimulatory receptor,as a specific
target for cancer therapy.″BMB reports 47.3(2014):122.)
白复合体。NFκB几乎存在于所有类型的动物细胞中并参与细胞对诸多刺激的响应,这些刺
激包括应激、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化LDL及细菌或病毒抗原。在针对感染的免
疫反应中,NFκB起到了重要的调节作用(κ轻链是免疫球蛋白的重要组成部分)。NFκB的调控
失常与癌症、炎症和自身免疫病、感染性休克、病毒感染以及免疫发育异常有关。NFκB亦与
突触可塑性及记忆过程有着密切关系。NFκB的主要靶细胞是趋化因子,免疫受体,黏附分
子,应激反应基因,凋亡调节剂,转录因子,生长因子,酶和细胞周期调节剂。此外,NFκB对几
种病毒启动子/增强子(例如HIV‑1和CMV)的转录有重要的影响(参见Tergaonkar,Vinay.″
NFκB pathway:A good signaling paradigm and therapeutic target.″The
international journal of biochemistry&cell biology 38.10(2006):1647‑1653.)。
计算:KD=c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知,KD值越大,说明解离越多,代表物质A、B之间的
亲和力越弱;反之,KD值越小,说明解离越少,代表物质A、B之间的亲和力越强。
特异性的,直接针对单个抗原性位点。此外,与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多
克隆抗体制备物相反,每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇修饰语″单克隆″不是被解
释为需要通过任何特殊方法产生抗体。例如,所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或
者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生单克隆抗体也可以得自噬菌
体抗体文库,使用例如Clackson etal.,Nature,352:624‑628(1991)和Marks et al.,
Mol.Biol.,222:581‑597(1991)所述的技术进行。
链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如,轻链和重链的可变区均来自一个动
物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区,而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序
列同源。例如,为获得嵌合抗体,可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区,而与其组
合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点,并且其特异性不受与其组合的恒
定区的来源的影响。同时,由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类,因此嵌合在注射时抗体引
发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
留原始抗体的抗原结合特性的改造抗体。例如,可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature
321:522(1986))及其变体;包括“重塑”(reshaping),(Verhoeyen,et al.,
1988Science239:1534‑1536;Riechmann,et al.,1988Nature332:323‑337;Tempest,et
al.,Bio/Technol 19919:266‑271),“高度加成”(hyperchimerization),(Queen,et al.,
1989Proc Natl Acad Sci USA 86:10029‑10033;Co,et al.,1991 Proc Natl Acad Sci
USA 88:2869‑2873;Co,et al.,1992J Immunol 148:1149‑1154)和“贴面”(veneering),
(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered
anti‑CD18 antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:
molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291‑
312)等技术手段,对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域,例如铰链区和恒定区结构
域也源自非人来源,则这些区域也可以被人源化。
免疫副反应。
的抗原结合臂中具有相同的特异性。双特异性抗体是从两种不同来源获得,并通过重组DNA
或细胞融合技术构建而成,使得它们保留原始抗体的两种特异性。双特异性抗体携带两个
不同的抗原结合位点。双特异性抗体的Fc部分不同于任意亲本单特异性抗体中的Fc部分。
由于双特异性抗体对于药物和肿瘤细胞都具有双重特异性,理论上其可导致在肿瘤中药物
积累高于在体内无肿瘤部位的积累。大部门双特异新抗体可以重定向细胞毒性效应细胞
(如Tc细胞,NK细胞,嗜中性粒细胞)至靶向细胞(例如肿瘤细胞)。双特异性抗体能够同时阻
断在发病机制中发挥独特或重叠功能的两种不同介质/通路,还可能通过与两种不同细胞
表面抗原而不是一种相互作用而增加结合特异性。(Fanger,Michael W.,and Paul
M.Guyre.″Bispecific antibodies for targeted cellular cytotoxicity.″Trends in
biotechnology,1991:375‑380),(Fan,Gaowei,et al.″Bispecific antibodies and
their applications.″Journal of hematology&oncology,2015:130)
由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成,并通常具有特定的三维结构特征
以及特定的电荷特征。表位根据结构,可分为构象表位和非构象表位(线性表位)。构象表位
与非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下前者丧失结合,而后者则不会。只位于抗原物
质表面、易与抗原识别受体或抗体结合的表位可称为功能性表位;位于分子内部、无免疫原
性的表位可称为隐藏性表位。表位可以由连续的残基构成,或者由被抗原聚合物的折叠造
成领近的不连续残基形成。在蛋白质中连续氨基酸所形成的表位通常在暴露到变性溶剂时
仍被保持,然而不连续氨基酸所形成的表位通常会在所述暴露后丧失。
F(ab′)2和Fv片段。在某些实施方式中,本申请所述的抗体可包括双链抗体、线性抗体、单链
抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。由木瓜蛋白酶消化具有完整结构的抗体后
(例如,去除了Fc区和铰链区)而产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段。Fab片段由
完整的轻链、重链可变区(VH)和重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段相对于抗
原结合是单价的,即它具有单一的抗原结合位点。F(ab)2抗体片段最初作为成对的Fab片段
产生,在它们之间有半胱氨酸相连接。由胃蛋白酶消化具有完整结构的抗体后产生单一的
大的F(ab′)2片段,其粗略地相当于两个通过二硫键相连具有不同的抗原结合活性的Fab片
段,且仍能够交联抗原。Fab′片段与Fab片段不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有几
个额外的残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fv片段由抗体单臂的VL和VH
结构域组成。
少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%)序列
同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同
的功能(例如,能够特异性结合PD‑L1),且在其基础上包含一个或多个(例如,1‑2个、1‑3个、
1‑4个、1‑5个、1‑6个、1‑7个、1‑8个、1‑9个、1‑10个或更多个)氨基酸的取代、缺失或添加的
氨基酸序列。
75%。根据IgG分子中的γ链抗原性差异,人IgG有四个亚型:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG在
免疫中发挥重要的作用。在本申请中,术语“IgG1”通常是指IgG中占比最高的一类亚型,与
Fc受体有较高亲和性。
或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录
和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引
入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述载体的
合适的宿主细胞,所述载体可以产生期望的表达产物。
或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的,意外的或故意的
突变,子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同,但能够表达
本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体
体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌),也可以是真核细胞
(例如酵母细胞,例如COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,HeLa细胞,HEK293细胞,COS‑1细
胞,NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中,所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如,所述
哺乳动物细胞可以是CHO‑K1细胞。在本申请中,术语“重组宿主细胞”通常指在其中引入了
重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞,还包括这些细胞的后
代。
淋巴恶性肿瘤。例如,可以为淋巴瘤。
例如,所述L‑FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连,且所述L‑FR2的C末端与所
述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如,所述L‑FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或
间接相连,且所述L‑FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中,例如,所
述H‑FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连,且所述H‑FR2的C末端与所述HCDR2
的N末端直接或间接相连。又例如,所述H‑FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相
连,且所述H‑FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。
5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
(例如,所述KD的值不高于约3×10 M、不高于约2×10 M、不高于约1×10 M、不高于约9×
‑10 ‑10 ‑10 ‑10 ‑10
10 M、不高于约8×10 M、不高于约7×10 M、不高于约6×10 M、不高于约5×10 M、不
‑10 ‑10 ‑10 ‑10
高于约4×10 M、不高于约3×10 M、不高于约2×10 M、不高于1×10 M、不高于约9×
‑11 ‑11 ‑11 ‑11 ‑11
10 M、不高于约8×10 M、不高于约7×10 M、不高于约6×10 M、不高于约1×10 M或以
‑11
下)的KD值与PD‑L1蛋白相结合。例如,所述的抗体、其抗原结合片段或变体可以以8×10 M
以下的KD值与PD‑L1蛋白相结合。
93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同一性的氨基酸序
列。在某些实施方式中,所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如,能够
特异性结合PD‑L1),且在其基础上包含一个或多个(例如,1‑2个、1‑3个、1‑4个、1‑5个、1‑6
个、1‑7个、1‑8个、1‑9个、1‑10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。又例
如,本申请中所述变体可以选自以下组:在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺
失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽;和与所述抗体或所述其抗原结合片段具有
85%以上(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约
96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
TGTX1SX2VGGYX3X4VS;其中X1是S、R或V;X2是D、E或S;X3是N或R;X4是Y或E,且其中所述LCDR1根
据抗体Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1,且所述LCDR1包
含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:54‑58。
体Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2,且所述LCDR2包含以
下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:60‑61。
Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3,且所述LCDR3包含选自
以下组的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:71。所述L‑FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间,所述L‑FR2
包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:72。所述L‑FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间,所述
L‑FR3包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:73‑75。所述L‑FR4的N末端与所述LCDR3的C末端
直接或间接相连,所述L‑FR4包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:76。在某些实施方式中,所
述框架区选自以下组:人共有框架序列和人种系序列。
ID NO:33,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
或T,且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体重链或其片段可包
含HCDR1,且所述HCDR1包含选自以下组的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:46和SEQ ID
NO:47。
F,X5是F或Y,且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体重链或其片
段可包含HCDR3,且所述HCDR3包含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:50~52。
自以下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67。所述H‑FR2位于所
述HCDR1与所述HCDR2之间,所述H‑FR2可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:68。所述H‑FR3
位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,所述H‑FR3可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:69。所
述H‑FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连,所述H‑FR4可包含以下的氨基酸序
列:SEQ ID NO:70。在某些实施方式中,所述框架区选自以下组:人共有框架序列和人种系
序列。
ID NO:35。在本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中,所述抗体重链或其片段还可包
含人恒定区。例如,所述人恒定区可包括人IgG恒定区。例如,所述人IgG恒定区可包含人
IgG1恒定区。
中X1是S、R或V;X2是D、E或S;X3是N或R;X4是Y或E,且其中所述LCDR1根据抗体Kabat编号的索
引确定。例如,所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1,且所述LCDR1包含选自下组的氨基酸序
列或其变体:SEQ ID NO:54‑58。所述抗体轻链或其片段包含LCDR2,且所述LCDR2包含SEQ
ID NO:59所示的氨基酸序列X1NSX2RPS,其中X1是G或E;X2是N或I,且其中所述LCDR2根据抗
体Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2,且所述LCDR2包含选
自下组的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:60‑61。所述抗体轻链或其片段包含LCDR3,且所
述LCDR3包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列:QSYDSSLSGX1V,其中X1是S或T,且其中所述
LCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。例如,所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3,且所述
LCDR3包含选自下组的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:63‑64。并且,本申请所述抗体包含
抗体重链或其片段,所述抗体重链或其片段包含HCDR1,且所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:
45所示的氨基酸序列:X1YAIS,其中X1是S或T,且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引
确定。例如,所述抗体重链或其片段可包含HCDR1,且所述HCDR1包含选自以下组的氨基酸序
列或其变体:SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47。例如,所述抗体重链或其片段可包含HCDR2,且
所述HCDR2包含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:48,且其中所述HCDR2根据抗体
Kabat编号的索引确定。又例如,所述抗体重链或其片段包含HCDR3,且所述HCDR3包含选自
SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列:TMX1X2YX3X4GNX5DY,其中X1是D、E或G,X2是G或E,X3是S或G,
X4是Y或F,X5是F或Y,且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。所述抗体重链或其
片段可包含HCDR3,且所述HCDR3包含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:50~52。
包括SEQ ID NO:63或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46;HCDR2的氨基酸
序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。例
如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑002或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑
3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体中L‑FR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:73或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;
且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:65或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体;且H‑FR4的氨基酸序列
可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑002与
其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,本申请所
述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区,所述轻链可变区的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:4或其变体;且其中重链可包含重链可变区,所述重链可变区的氨基酸
序列可包括SEQ ID NO:2或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑
002或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,本申请所述的
抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所
示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可
包括抗体YN‑002或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:46或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
002或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:73或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
65或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑002或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:2或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑002或与其具有相同的轻链可
变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻链
的氨基酸序列可如SEQ ID NO:8所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:6所示。例如,
该参比抗体可包括抗体YN‑002或与其具有相同的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:46或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:50或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑003或与
其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体
中L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FRI的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:66或其变体;H‑FR2
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或
其变体;且H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片
段或变体可包括抗体YN‑003或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗
体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变
区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11或其变体;且其中重链可包含重链
可变区,所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9或其变体。例如,该抗体、其抗原
结合片段或变体可包括抗体YN‑003或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在
某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻链
的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。例如,
该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑003或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:46或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
003或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
66或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑003或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:9或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑003或与其具有相同的轻链可
变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻链
的氨基酸序列可如SEQ ID NO:15所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:13所示。例
如,该参比抗体可包括抗体YN‑003或与其具有相同的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:51或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑035或与
其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体
中L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体;H‑FR2
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或
其变体;且H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片
段或变体可包括抗体YN‑035或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗
体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变
区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体;且其中重链可包含重链
可变区,所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31或其变体。例如,该抗体、其抗
原结合片段或变体可包括抗体YN‑035或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。例
如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑035或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:55或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:51或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
035或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
67或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑035或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FRI‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:31或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑035或与其具有相同的轻链
可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:34所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:32所示。例
如,该参比抗体可包括抗体YN‑035或与其具有相同的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:52或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑036或与
其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体
中L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体;H‑FR2
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或
其变体;且H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片
段或变体可包括抗体YN‑036或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗
体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变
区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体;且其中重链可包含重链
可变区,所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该抗体、其抗
原结合片段或变体可包括抗体YN‑036或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例
如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑036或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:55或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
036或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
67或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑036或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑036或与其具有相同的轻链
可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:34所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例
如,该参比抗体可包括抗体YN‑036或与其具有相同的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:52或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑037或与
其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体
中L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体;H‑FR2
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或
其变体;且H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片
段或变体可包括抗体YN‑037或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗
体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变
区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37或其变体;且其中重链可包含重链
可变区,所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该抗体、其抗
原结合片段或变体可包括抗体YN‑037或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例
如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑037或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:56或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
037或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
67或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑037或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑037或与其具有相同的轻链
可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:38所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例
如,该参比抗体可包括抗体YN‑037或与其具有相同的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:52或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑038或与
其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体
中L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体;H‑FR2
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或
其变体;且H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片
段或变体可包括抗体YN‑038或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗
体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变
区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39或其变体;且其中重链可包含重链
可变区,所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该抗体、其抗
原结合片段或变体可包括抗体YN‑038或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例
如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑038或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:57或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
038或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
67或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑038或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑038或与其具有相同的轻链
可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:40所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例
如,该参比抗体可包括抗体YN‑038或与其具有相同的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:52或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑039或与
其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些情形中,所述抗体、其抗原结合片段或变体
中L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体;L‑FR4的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体;H‑FR2
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或
其变体;且H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片
段或变体可包括抗体YN‑039或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑FR1‑4的抗
体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变
区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41或其变体;且其中重链可包含重链
可变区,所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该抗体、其抗
原结合片段或变体可包括抗体YN‑039或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。
在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例
如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑039或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:58或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
039或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体包含L‑
FR1‑4及H‑FR1‑4,且L‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体;L‑FR2的氨基酸序
列可包括SEQ ID NO:72或其变体;L‑FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体;L‑
FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体;且H‑FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:
67或其变体;H‑FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体;H‑FR3的氨基酸序列可包
括SEQ ID NO:69或其变体;H‑FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如,该抗
体或其抗原结合片段可包括抗体YN‑039或与其具有相同的LCDR1‑3、HCDR1‑3、L‑FR1‑4及H‑
FR1‑4的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区,所述轻
链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41或其变体;且所述重链可变区的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:35或其变体。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑039或与其具有相同的轻链
可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含轻链和重链,所述轻
链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:42所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例
如,该参比抗体可包括抗体YN‑039或与其具有相同的轻链及重链。
下(例如,所述KD的值不高于约5×10 M、不高于约4×10 M、不高于约3×10 M、不高于约2
‑9 ‑9 ‑10
×10 M、不高于约1×10 M或不高于约1×10 M或以下)的KD值与CD137蛋白相结合。例如,
‑9
以3×10 M以下的KD值与CD137蛋白相结合。
93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同一性的氨基酸序
列。在某些实施方式中,所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如,能够
特异性结合CD137),且在其基础上包含一个或多个(例如,1‑2个、1‑3个、1‑4个、1‑5个、1‑6
个、1‑7个、1‑8个、1‑9个、1‑10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2,且所述LCDR2包含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ
ID NO:81。又例如,所述抗体轻链或其片段包含LCDR3或其变体,且所述LCDR3可包含以下的
氨基酸序列:SEQ ID NO:82。
直接或间接相连,所述L‑FR1可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:89。所述L‑FR2位于所述
LCDR1与所述LCDR2之间,所述L‑FR2可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:90。所述L‑FR3位
于所述LCDR2与所述LCDR3之间,所述L‑FR3可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:91。所述
L‑FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连,所述L‑FR4可包含以下的氨基酸序列:
SEQ ID NO:92。
20。
链或其片段包含HCDR2,且所述HCDR2可包含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID NO:78。所
述抗体重链或其片段包含HCDR3,且所述HCDR3可包含以下的氨基酸序列或其变体:SEQ ID
NO:79。
的氨基酸序列:SEQ ID NO:84‑85。所述H‑FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间,所述H‑FR2
可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:86。所述H‑FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间,所
述H‑FR3可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:87。所述H‑FR4的N末端与所述HCDR3的C末端
直接或间接相连,所述H‑FR4可包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:88。
定区。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:77或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:79或其变体。例如,所述抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑005或
与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原
结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体;且其重链可变
区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:18或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包
括抗体YN‑005或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,本
申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列可如
SEQ ID NO:23所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:21所示。例如,该抗体、其抗原结
合片段或变体可包括抗体YN‑005或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:77或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:79或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
005或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含
轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体;
且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO 18或其变体。例如,该参比抗体可包括
抗体YN‑005或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述
参比抗体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链的
氨基酸序列可如SEQ ID NO:21所示。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑005或与其具有相同
的轻链及重链。
LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:77或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体;HCDR3的氨基酸序列可
包括SEQ ID NO:79或其变体。例如,所述抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN‑006或
与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原
结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体;且其重链可变
区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:25或其变体。例如,该抗体、其抗原结合片段或变体可包
括抗体YN‑006或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,本
申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列可如
SEQ ID NO:23所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:27所示。例如,该抗体、其抗原结
合片段或变体可包括抗体YN‑006或与其具有相同的轻链及重链。
的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体;LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或
其变体;LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体;其HCDR1的氨基酸序列可包括
SEQ ID NO:77或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体;HCDR3的氨基
酸序列可包括SEQ ID NO:79或其变体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包括抗体YN‑
006或与其具有相同的LCDR1‑3及HCDR1‑3的抗体。在某些实施方式中,所述参比抗体可包含
轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体;
且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO 25或其变体。例如,该参比抗体可包括
抗体YN‑006或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中,所述
参比抗体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链的
氨基酸序列可如SEQ ID NO:27所示。例如,该参比抗体可包括抗体YN‑006或与其具有相同
的轻链及重链。
的值不高于约2×10 M、不高于约1×10 M、不高于约1×10 M或不高于约8×10 M或以
‑9 ‑9
下)的KD值与PD‑L1蛋白相结合,且其以8×10 M以下(例如,所述KD的值不高于约8×10 M、
‑9 ‑9 ‑9 ‑9
不高于约7×10 M、不高于约6×10 M、不高于约5×10 M、不高于约4×10 M、不高于约3×
‑9 ‑9 ‑9 ‑10
10 M、不高于约2×10 M、不高于约1×10 M或不高于约1×10 M或以下)的KD值与CD137蛋
白相结合。
合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽;和与所述抗体或所述
其抗原结合片段具有85%以上(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约
94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。所述
抗体、其抗原结合片段或变体可以是结合所述PD‑L1蛋白的抗体、其抗原结合片段或变体。
58;所述LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:60~61;和,所述LCDR3的氨基酸序列选自以下
组:SEQ ID NO:63‑64。在某些实施方式中,所述轻链或其片段可包含轻链可变区,且所述轻
链可变区的氨基酸序列可选自以下组:SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:33,SEQ ID
NO:37,SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。在某些实施方式中,所述抗体的轻链或其片段可包
含人恒定区,且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:48;和,所述HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:50~52。
体。在某些实施方式中,所述抗原结合片段选自以下组:Fab,Fab’,F(ab)2和Fv片段。在某些
实施方式中,所述变体选自以下组:在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或
添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽;和与所述抗体或所述其抗原结合片段具有85%以
上(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约
97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
NO:81和SEQ ID NO:82。在某些实施方式中,所述轻链或其片段可包含轻链可变区,且所述
轻链可变区包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:20。
ID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79。在某些实施方式中,所述抗体的重链或其片段可
包含重链可变区,且所述重链可变区的氨基酸序列可选自以下组:SEQ ID NO:18和SEQ ID
NO:25。
链可变区,以及所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区;且所述第二多肽链可包含所述结
合PD‑L1蛋白的抗体的轻链可变区。
位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端。又例如,在所述第一多肽链中,所述结
合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区可位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端,
且所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区可位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变
区的N端。
ID NO:83。
区可位于所述结合PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且可位于所述结合CD137蛋白的抗
体的重链可变区的N端。
变体;LCDR2的氨基酸序列可选自以下组:SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61或其变体;LCDR3的
氨基酸序列可选自以下组:SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64或其变体;且HCDR1的氨基酸序列
可选自以下组:SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47或其变体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:48或其变体;HCDR3的氨基酸序列可选自以下组:SEQ ID NO:50~52或其变体。在某些实
施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可选自
以下组:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ
ID NO:41或其变体;且其重链可变区的氨基酸序列可选自以下组:SEQ ID NO:2、SEQ ID
NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35或其变体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其
抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列可选自以下组的氨基酸序
列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID
NO:42且所述重链氨基酸序列可选自以下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、
SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体;且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:77或其变
体;HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体;HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID
NO:79或其变体。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可
变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体;且其重链可变区的氨基酸序列可选自以
下组或其变体:SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:25。在某些实施方式中,本申请所述的抗体、其
抗原结合片段或变体可包含轻链和重链,所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且
所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27所示。
体可包括抗体YN‑007或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中,所述第一多肽中,可包
含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO:
13所示的氨基酸序列;且,所述第二多肽中,可包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
性抗体可包括抗体YN‑051或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中,所述第一多肽可
包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和如SEQ ID
NO:32所示的氨基酸序列;且,所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
性抗体可包括抗体YN‑052或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中,所述第一多肽可
包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和如SEQ ID
NO:36所示的氨基酸序列;且,所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
体可包括抗体YN‑007或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中,所述第一多肽中,可包
含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO:
13所示的氨基酸序列;且,所述第二多肽中,可包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
性抗体可包括抗体YN‑051或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中,所述第一多肽可
包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、如SEQ ID
NO:23所示的氨基酸序列;且,所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
性抗体可包括抗体YN‑052或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中,所述第一多肽可
包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、如SEQ ID
NO:23所示的氨基酸序列;且,所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
如,所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体或其抗原结合
片段,也可以编码其中一部分(例如,HCDR1‑3、LCDR1‑3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多
种)。
的,(iii)纯化的,例如通过酶切和凝胶电泳分级分离,或者(iv)合成的,例如通过化学合
成。在某些实施方式中,所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
延伸PCR,具体操作可参见Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;和Ausube等人
Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley‑
Interscience,New York N.Y.,1993。
因,例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外,所述载
体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域
技术人员所熟知的,例如,可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA
翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中,所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控
制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化,但通常包含分别参与转录和翻译
起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列,例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如,5’非
转录表达控制序列可包含启动子区,启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动
子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中,每种或每个宿主细胞
可包含多个(例如,2个或以上)或多种(例如,2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例
如,可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中,例如真核细胞,如来自植物的细胞、真菌
或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中,例如
电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
特异性抗体表达的条件下,培养所述本申请所述的宿主细胞。且任选地收获所述抗体、其抗
原结合片段或变体。例如,可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等,这些方法
是本领域普通技术人员所了解的。
任选地药学上可接受的佐剂。
疗肿瘤的药物中的应用。其中,所述肿瘤包括结肠癌。
片段或变体,或所述的双特异性抗体,所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或
所述的药物组合物。其中所述T细胞为肿瘤相关的功能失调T细胞。
子、所述的载体所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。
克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
的轻链可变区包含LCDR1‑3,所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1‑3,所述LCDR1包含选自
下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:54‑58;所述LCDR2包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:
60‑61;和,所述LCDR3包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:63‑64;且,所述参比抗体的
重链可变区包含HCDR1‑3,所述HCDR1包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:46‑47;所述
HCDR2包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:48;和,所述HCDR3包含选自下组的氨基酸序
列:SEQ ID NO:50‑52。
NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41,且所述参比抗体的重链可变区包含选自下组的氨基
酸序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35。
SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42;且所述参比抗体的重链包含选自下组的氨
基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
基酸序列TGTX1SX2VGGYX3X4VS;其中X1是S、R或V;X2是D、E或S;X3是N或R;X4是Y或E,且其中所
述LCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。
中X1是G或E;X2是N或I,且其中所述LCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。
QSYDSSLSGX1V,其中X1是S或T,且其中所述LCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。
ID NO:71
75。
ID NO:76。
ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42。
NO:45所示的氨基酸序列:X1YAIS,其中X1是S或T,且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索
引确定。
Kabat编号的索引确定。
TMX1X2YX3X4GNX5DY,其中X1是D、E或G,X2是G或E,X3是S或G,X4是Y或F,X5是F或Y,且其中所述
HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。
ID NO:65‑67。
ID NO:70。
ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35。
SEQ ID NO:36。
抗体的轻链可变区包含LCDR1‑3,所述LCDR1‑3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:80‑82所示,
且,所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1‑3,所述HCDR1‑3的氨基酸序列依次如SEQ ID
NO:77‑79所示。
自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
基酸序列。
基酸序列。
酸序列。
的氨基酸序列。
基酸序列。
NO:25所示的氨基酸序列。
片段或变体。
体、其抗原结合片段或变体。。
CD137蛋白的抗体的重链可变区,以及所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区;且所述第
二多肽链包含所述结合PD‑L1蛋白的抗体的轻链可变区。
合CD137蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端;或
者,
的重链可变区的N端。
位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端;或者,所述人IgG恒定区位于所述结合
PD‑L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N
端。
方案79‑87中任一项所述的双特异性抗体。
特异性抗体的方法,所述方法包括在使得实施方案1‑39中任一项所述的抗体、其抗原结合
片段或变体,实施方案40‑78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体,或实施方案79‑
87中任一项所述的双特异性抗体表达的条件下,培养根据实施方案90所述的细胞。
项所述的双特异性抗体,实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的载体和/或实施方
案90所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
抗体,实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的载体、实施方案90所述的细胞和/或
实施方案92所述的药物组合物在制备缓解或治疗肿瘤的药物中的应用。
或变体,或实施方案79‑87中任一项所述的双特异性抗体,实施方案88所述的核酸分子、实
施方案89所述的载体、实施方案90所述的细胞和/或实施方案92所述的药物组合物。
方案79‑87中任一项所述的双特异性抗体,实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的
载体、实施方案90所述的细胞和/或实施方案92所述的药物组合物。
μg/ml(第三、四轮)PD‑L1蛋白的CBS缓冲液在4℃包被酶联免疫管过夜。该管随后用PBS缓冲
液洗涤,向其中加入10%的脱脂奶粉封闭免疫管,然后加入1ml封闭过的phage,在室温(20
±5℃)孵育1小时。用PBST充分洗涤后,加入800μl pH2.2的Gly‑HCl缓冲液洗脱,随后立即
加400μl的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液中和。然后加入到20ml处于对数生长期的E.coli SS320
中,E.coli的OD值约0.8,混匀后在37℃静置1小时。取出500μl菌液进行噬菌体滴度测定及
甘油保菌,剩余菌液用来涂平板,在37℃过夜培养。次日,将平板上的菌按比例接入到80ml
2YT‑Amp培养基中,使菌液OD值等于0.2。培养数小时,当OD值达到0.8时,加入160μl helper
phage混匀,在37℃静置1小时。然后加入IPTG、Kan抗生素,在250rpm,30℃振荡过夜培养。随
后收集上清,用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体,重悬于1.5ml的PBS缓冲液中进行富集筛选。
该板随后用10%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点,充分洗涤后,取单克隆的噬菌体上清加
入96孔板,在37℃孵育2小时。充分洗涤后,每孔加入HRP标记的抗M13抗体(27‑9421‑01,GE
healtcare),在37℃反应45分钟。充分洗涤后,每孔加入TMB显色,在室温(20±5℃)反应5‑
10分钟后,每孔加入硫酸终止反应,用酶标仪在450nm处测定各孔OD值。
酸序列如SEQ ID NO:1所示,噬菌体抗体1B10的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2
所示;编码所述噬菌体抗体1B10的轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,噬菌体
抗体1B10的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV‑λ载体。测序正确后将重、轻链表达载体
共转染293F细胞进行瞬时表达,并通过ProteinA柱纯化,得到噬菌体抗体1B10的完整IgG1,
λ抗体,将此抗PD‑L1全人源抗体命名为YN‑002。
NO:3所示,抗体YN‑002的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。编码抗体YN‑002的重链的核
苷酸序列如SEQ ID NO:5所示,YN‑002的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。编码抗体
YN‑002的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,抗体YN‑002的轻链的氨基酸序列如SEQ
ID NO:8所示。
来自人种系IGHJ4*02的JH节段。
48和SEQ ID NO:50所示。
区的FR1区中的1个氨基酸突变回种系序列,以及将YN‑002轻链可变区中FR2区中1个氨基酸
和FR3区中6个氨基酸突变回种系序列而制备得到的(参见图1)。抗PD‑L1全人源抗体YN‑003
的重链表达载体在上述构建的YN‑002的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突
变试剂盒,KM101)定点突变而获得。YN‑003轻链表达载体是在YN‑002轻链表达质粒的基础
上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒,KM101)定点突变而获得。
体YN‑003VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,其可通过突变抗体YN‑002VL的氨基酸序列
中7个氨基酸残基而得到,编码YN‑003VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。抗体YN‑
003重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示;编码YN‑003重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:
14所示;抗体YN‑003轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示;编码抗体YN‑003轻链的核苷
酸序列如SEQ ID NO:16所示。
Link Sulfo‑NHS‑LC‑Biotin,Pierce,21327)标记以下蛋白:重组的人PD‑L1‑Fc、重组的食
蟹猴PD‑L1‑Fc(90251‑C02H,购自北京义翘神州生物技术有限公司)、重组的小鼠PD‑L1‑Fc
(M5251,购自北京百普赛斯生物科技有限公司)、重组的犬PD‑L1‑Fc(70110‑D02H,购自北京
义翘神州生物技术有限公司)。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用分子相互作用分析仪
(Octet RED384,购自Pall ForteBio公司),使用含有0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓冲
液,进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原蛋白与SA传感
器(Pall ForteBio公司)固定,以1500rpm结合10分钟;然后再与对倍稀释的抗体溶液以
1500rpm结合10分钟,最后以1500rpm解离10分钟。得到的结果将通过Octet Data
Analysis9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析,得到KD值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)
值。
6
10/ml的稳定表达人PD‑L1的CHO细胞中,随后立即加入五倍比稀释的各抗体,混匀后孵育
(4℃,1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R‑PE Conjugate(life technology,SA10041),
孵育(4℃,30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。
结果如图2所示:YN‑002和YN‑003均能有效抑制人PD‑1与表达人PD‑L1的CHO细胞的结合。
京义翘神州生物技术有限公司,90311‑C02H)结合的能力。首先,用生物素(EZ‑Link Sulfo‑
NHS‑LC‑Biotin,Pierce,21327)标记食蟹猴PD‑1‑Fc。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用
fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪来进行PD‑L1抗体抑制食蟹猴PD‑
L1和食蟹猴PD‑1之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1%BSA及0.02%tween20
的PBS缓冲液)。使用浓度为100nM经过biotin偶联的重组的人PD‑1‑Fc与SA传感器固定,
1500rpm/min,结合10min;终浓度75nM的食蟹猴PD‑L1与三倍比稀释的抗体溶液混合,孵育
60分钟后上机结合10min,1500rpm/min。最后进行解离10分钟,1500rpm/min。得到的结果将
通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall Fortebio公司)进行数据分析。结果如图3所示:
YN‑002和YN‑003均能有效抑制食蟹猴PD‑L1‑Fc与食蟹猴PD‑1‑Fc的结合。
6
10/ml的稳定表达小鼠PD‑L1的CHO细胞中,随后立即加入五倍比稀释的各抗体,混匀后孵
育(4℃,1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R‑PE Conjugate(life technology,
SA10041),孵育(4℃,30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测
荧光强度。结果如图4所示:YN‑002和YN‑003均能有效抑制小鼠PD‑1与表达小鼠PD‑L1的CHO
细胞的结合。
小鼠分别腹腔注射人抗体IgG‑Fc蛋白(10mg/kg,每周二次,共两周),YN‑003抗体(10mg/kg,
每周二次,共两周)、Atezolizumab(10mg/kg,每周二次,共两周)。定期观测各组小鼠体重和
肿瘤大小的变化。实验结果表明:与对照IgG1‑Fc相比,YN‑003和Atezolizumab均可有效抑
制肿瘤生长,其中YN‑003的抗肿瘤作用更为显著(图5)。
ml(第三、四轮)CD137蛋白的CBS缓冲液在4℃包被酶联免疫管过夜。该管随后用PBS缓冲液
洗涤,向其中加入10%的脱脂奶粉封闭免疫管,然后加入1ml封闭过的phage,在室温(20±
45℃)孵育1小时。用PBST充分洗涤后,加入800μl pH2.2的Gly‑HCl缓冲液洗脱,随后立即加
400μl的pH8.0的Tris‑HCl缓冲液中和。然后加入到20ml处于对数生长期的E.coli SS320
中,E.coli的OD值约0.8,混匀后在37℃静置1小时。取出500μl菌液进行噬菌体滴度测定及
甘油保菌,剩余菌液用来涂平板,在37℃过夜培养。次日,将平板上的菌按比例接入到80ml
2YT‑Amp培养基中,使菌液OD值等于0.2。培养数小时,当OD值达到0.8时,加入160μl
helperphage混匀,在37℃静置1小时。然后加入IPTG、Kan抗生素,在250rpm,30℃振荡过夜
培养。随后收集上清,用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体,重悬于1.5ml的PBS缓冲液中进行富集筛
选。
小时。充分洗涤后,每孔加入HRP标记的抗M13抗体(27‑9421‑01,购自GE healtcare),在37
℃反应45分钟。充分洗涤后,每孔加入TMB显色,在室温(20±5℃)反应5‑10分钟后,每孔加
入硫酸终止反应,用酶标仪在450nm处测定各孔OD值。
17所示,噬菌体抗体1A6的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示;编码噬菌体抗体1A6的VL
的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示,噬菌体抗体1A6的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所
示。
通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV‑λ载体。测序正确后将重、轻链表达载体共转
染293F细胞进行瞬时表达,并通过ProteinA柱纯化,将1A6的完整IgG2,λ抗体,将此抗CD137
全人源完整抗体命名为YN‑005。
所示,编码抗体YN‑005VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。抗体YN‑005重链的氨基酸序
列如SEQ ID NO:21所示,编码抗体YN‑005重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示;抗体YN‑
005轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示,编码抗体YN‑005轻链的核苷酸序列如SEQ ID
NO:24所示。
来自人种系IGHJ3*02的JH节段。
005的LCDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82所示。
区的FR1区中的1个氨基酸突变回种系序列(参见图6)。抗CD137全人源抗体YN‑006的重链表
达载体在上述构建的YN‑005的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂
盒,KM101)定点突变获得。
体YN‑006VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。抗体YN‑006重链的氨基酸序列如SEQ ID
NO:27所示;编码抗体YN‑006重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示;且抗体YN‑006轻链的
氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示,编码YN‑006轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
力。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用分子相互作用分析仪(Octet RED384,购自Pall
ForteBio公司),使用含有0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓冲液,进行抗原抗体结合动力
学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定,以1500rpm结合5分钟;然后再与对倍稀
释的重组人CD137‑His蛋白抗原溶液(100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56nM)以1500rpm结
合5分钟,最后以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的
结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析,得到KD
值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。测量得到的CD137抗体YN‑005和YN‑006的结合亲和力结果参
见表5。
北京百奥赛图基因生物技术有限公司)。在第3天时将小鼠平均分为3组,每组7只,给每组荷
瘤小鼠分别腹腔注射人抗体IgG‑Fc蛋白(3mg/kg,每周二次,共两周),CD137抗体YN‑006抗
体(3mg/kg,每周二次,共两周)、CD137抗体Utomilumab(3mg/kg,每周二次,共两周)。定期观
测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。实验结果表明:与对照IgG1‑Fc相比,YN‑006和
Utomilumab均可有效抑制肿瘤生长,值得注意的是,YN‑006的抗肿瘤作用显著强于
Utomilumab(如图7所示)。
基因,并将其通过重组克隆至经AgeI和BamHI双酶切的pCMV‑IgG1AEM载体,构建成YN‑007的
第一多肽表达载体。
SEQ ID NO:16所示,抗体YN‑007第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
合亲和力。用生物素(EZ‑Link Sulfo‑NHS‑LC‑Biotin,Pierce,21327)标记重组的人PD‑L1‑
Fc和重组的小鼠PD‑L1‑Fc。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用分子相互作用分析仪(Octet
RED384,购自Pall ForteBio公司),使用含有0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓冲液,进行
抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原蛋白与SA传感器(Pall
ForteBio公司)固定,以1500rpm结合10分钟;然后再与对倍稀释的YN‑007抗体溶液以
1500rpm结合10分钟,最后以1500rpm解离10分钟。得到的结果将通过Octet Data
Analysis9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析,得到KD值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)
值。
(BLI)技术,使用分子相互作用分析仪(Octet RED384,购自Pall ForteBio公司),使用含有
0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓冲液,进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM
的抗体与AHC传感器固定,以1500rpm结合5分钟;然后再与对倍稀释的重组人CD137‑His蛋
白抗原溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56nM)以1500rpm结合5分钟,最后以1500rpm
解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的结果将通过Octet Data
Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析,计算出抗原与抗体的结合强度,得
到KD值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。
PCR对抗体YN‑003的六个CDR区(包括CDR区中部分氨基酸残基及与CDR区临近的FR区中个别
氨基酸残基)分别进行随机化(如图8所示)。
胞中,倍比稀释后涂2YT+AG平板,次日将菌苔从平板上刮下,扩大至300ml 2YT+Amp培养基,
37℃培养至OD 0.8左右,加入helper phage混匀后静置1小时,加入终浓度为1mM IPTG,50μ
g/ml的卡纳,30℃振摇过夜。次日离心收上清,0.45滤膜过滤除菌,加入1/5体积的PEG‑NaCl
沉淀phage,离心取沉淀,1/10体积的PBS重悬沉淀,测OD260计算噬菌体pfu,4℃保存,该噬
菌体抗体库可直接用于后期淘选。
二轮)或5nM(第三轮),4℃过夜;次日用含10%的脱脂奶粉的PBS缓冲液2ml封闭免疫管;将
1ml的封闭过的phage加入到免疫管中,室温孵育1h;PBST洗涤20次(第一轮)、50次(第二轮)
或100次(第三轮);加入pH2.2的Gly‑HCl缓冲液800μl洗脱,立即加400μl的pH8.0的Tris‑
HCl缓冲液中和;加入到20ml对数生长期OD约0.8的E.coli TG1中,混匀37℃静置1h;取出
500μl用来测定噬菌体滴度及甘油保菌;剩余菌液涂平板,培养箱中37℃过夜培养;第二天
刮下平板的菌,按一定比例接入80ml的2YT‑Amp培养基中,使OD等于0.2,培养数小时以OD达
到0.8时,加入160ul的helper phage,然后混匀37℃静置1h;加入IPTG、Kan抗生素,250rpm,
30℃,振荡培养过夜;收集上清,用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体,重悬于1.5ml的PBS缓冲液中;
重悬的噬菌体用于下一轮的富集筛选,3轮淘选之后,观察到显著的富集。利用ELISA对淘选
得到的噬菌体抗体克隆进行鉴定:在96孔ELISA板上包被人PD‑L1‑His蛋白,浓度1μg/ml,4
℃过夜。然后用10%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点,充分洗涤后,取单克隆的噬菌体上清
加入96孔板,37℃孵育2小时。充分洗涤后,加入HRP标记的抗M13抗体(GE healtcare,27‑
9421‑01),37℃作用45min,充分洗涤后加入TMB显色,室温下作用5‑10min后,最后用硫酸终
止反应,于450nm处测定各孔OD值,选择OD450值高的噬菌体抗体克隆进行测序。获得各噬菌
体抗体克隆的重、轻链可变区基因序列后,将各噬菌体抗体重新设计成全长IgG1,λ抗体:设
计引物对各噬菌体抗体克隆的VH进行PCR扩增,将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双
酶切的pCMV‑IgG1NDL抗体重链表达载体;设计引物对各噬菌体抗体克隆的的VL进行PCR扩
增,将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV‑λ抗体轻链表达载体。测序正
确后分别将各抗体的重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达,用无血清培养基培
养7天后收集细胞培养上清通过ProteinA柱纯化获得抗体蛋白,将纯化抗体用PBS进行透
析,最后用BCA Protein Assay Kit定量(Pierce,23225)。使用分子相互作用分析仪(Octet
RED384,购自Pall ForteBio公司)测量以上全长抗体针对重组的人PD‑L1‑His蛋白(上海原
能医学技术有限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用分子相互作用分析
仪(Octet RED384,购自Pall ForteBio公司),使用含有0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓
冲液,进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定,以1500rpm
结合5分钟;然后再与对倍稀释的抗原溶液(50,25,12.5,6.25,3.125,1.56nM),7个浓度梯
度,以1500rpm结合5分钟。最后在以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后
重复使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数
据分析,得到KD值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。筛选获得的亲和力提高的各突变体克隆后,
将不同CDR区中亲和力提高的氨基酸突变点利用Overlapping PCR等方法进行组合,然后再
按照以上方法表达、纯化抗体蛋白并测定亲和力。经过多轮筛选和组合,将亲和力最高的5
个YN‑003抗体突变体克隆分别命名为YN‑035抗体、YN‑036抗体、YN‑037抗体、YN‑038抗体、
YN‑039抗体。这5个抗体通过以上方法测定获得的亲和力数值参见表9。结果显示YN‑035抗
体、YN‑036抗体、YN‑037抗体、YN‑038抗体、YN‑039抗体的亲和力均高于抗PD‑L1抗体
Atezolizumab和Avelumab。
列如SEQ ID NO:33所示,YN‑035抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
列如SEQ ID NO:33所示,YN‑036抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
列如SEQ ID NO:37所示,YN‑037抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
列如SEQ ID NO:39所示,YN‑038抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。
列如SEQ ID NO:41所示,YN‑039抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
的轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比,其中下划线处为根据Kabat定义法确定
的CDR。其中,抗体YN003的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示,YN035~YN039的HCDR1
的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示;抗体YN003的HCDR2的氨基酸序列和抗体YN035~YN039
的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示;YN‑003的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:50
所示;YN‑035的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示;抗体YN036~YN039的HCDR3的氨
基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
56所示,抗体YN038的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示,抗体YN039的LCDR1的氨基
酸序列如SEQ ID NO:58所示;抗体YN003、抗体YN035~YN036的LCDR2的氨基酸序列如SEQ
ID NO:60所示;抗体YN037~YN039的LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示;抗体YN003
的LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示;抗体YN035~YN039的LCDR3的氨基酸序列如
SEQ ID NO:64所示。
的结合活性:1×10 /ml稳定表达人PD‑L1的CHO细胞中分别加入两倍比稀释的各PD‑L1抗
体,混匀后于4℃孵育1小时,洗细胞后加入Goat F(ab′)2 Anti‑Human IgG‑Fc
(DyLight650)(ab98593,Abcam),于4℃孵育30分钟,洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt
iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图11所示:YN‑035、YN‑036、YN‑037、YN‑038、YN‑
039均能有效结合表达人PD‑L1的CHO细胞。
PD‑1‑Fc蛋白(上海原能医学技术有限公司),用亚饱和浓度生物素标记的人PD‑1‑Fc加入1
6
×10 /ml的稳定表达人PD‑L1的CHO细胞中,随后立即加入两倍比稀释的各抗体,混匀后孵
育(4℃,1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R‑PE Conjugate(life technology,
SA10041),孵育(4℃,30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测
荧光强度。实验结果如图12所示:PD‑L1抗体YN‑035、YN‑036、YN‑037、YN‑038、YN‑039均能有
效抑制人PD‑1与表达人PD‑L1的CHO细胞的结合。
L1的结合活性:1×10/ml稳定表达小鼠PD‑L1的CHO细胞中分别加入两倍比稀释的各PD‑L1
抗体,混匀后于4℃孵育1小时,洗细胞后加入Goat F(ab′)2 Anti‑Human IgG‑Fc(DyLight
650)(ab98593),于4℃孵育30分钟,洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)
检测荧光强度。试验结果如图13所示:YN‑035、YN‑036、YN‑037、YN‑038、YN‑039均能有效结
合表达小鼠PD‑L1的CHO细胞。
标记小鼠PD‑1‑Fc(上海原能医学技术有限公司),用亚饱和浓度生物素标记的小鼠PD‑1‑Fc
6
加入1×10/ml的稳定表达小鼠PD‑L1的CHO细胞中,随后立即加入两倍比稀释的各抗体,混
匀后孵育(4℃,1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R‑PE Conjugate(life technology,
SA10041),孵育(4℃,30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测
荧光强度。结果如图14所示:PD‑L1抗体YN‑035、YN‑036、YN‑037、YN‑038、YN‑039均能有效抑
制小鼠PD‑1与稳定表达小鼠PD‑L1的CHO细胞的结合。
基因,并将其通过重组克隆至经AgeI和BamHI双酶切的pCMV‑IgG1AEM载体,构建成YN‑051的
第一多肽表达载体。YN‑051的第二多肽基因与YN‑035的轻链基因相同。YN‑035的第二多肽
表达载体为YN‑035的轻链表达载体。
ProteinA柱纯化获得抗体蛋白,将纯化抗体用PBS进行透析,最后用BCA Protein Assay
Kit定量(Pierce,23225)。
基因,并将其通过重组克隆至经AgeI和BamHI双酶切的pCMV‑IgG1AEM载体,构建成YN‑052的
第一多肽表达载体。YN‑052的第二多肽基因与YN‑036的轻链基因相同。YN‑052的第二多肽
表达载体为YN‑036的轻链表达载体。
ProteinA柱纯化获得抗体蛋白,将纯化抗体用PBS进行透析,最后用BCA Protein Assay
Kit定量(Pierce,23225)。
限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用分子相互作用分析仪(Octet
RED384,购自Pall ForteBio公司),使用含有0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓冲液,进行
抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定,以1500rpm结合5分
钟;然后再与对倍稀释的抗原溶液(50,25,12.5,6.25,3.125,1.56nM),7个浓度梯度,以
1500rpm结合5分钟。最后在以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复
使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分
析,得到KD值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。测量得到的YN‑007与人PD‑L1‑Fc的结合亲和力结
果参见表10。
限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术,使用分子相互作用分析仪(Octet
RED384,购自Pall ForteBio公司),使用含有0.1%BSA和0.02%Tween20的PBS缓冲液,进行
抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定,以1500rpm结合5分
钟;然后再与对倍稀释的重组人CD137‑His蛋白抗原溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、
1.56nM)以1500rpm结合5分钟,最后以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生
后重复使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行
数据分析,得到KD值,Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。
6
231细胞的结合:1×10/ml的MDA‑MB‑231细胞中分别加入两倍比稀释的各抗体,混匀后于4
℃孵育1小时,洗细胞后加入Goat F(ab′)2 Anti‑Human IgG‑Fc(DyLight 650)(ab98593,
abcam),于4℃孵育30分钟,洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光
强度。试验结果如图15所示:YN‑035、YN‑036、YN‑051和YN‑052均能有效结合MDA‑MB‑231细
胞。
和YN‑052与人PD‑L1的结合活性:1×10/ml稳定表达人PD‑L1的CHO细胞中分别加入两倍比
稀释的各抗体,混匀后于4℃孵育1小时,洗细胞后加入Goat F(ab′)2 Anti‑Human IgG‑Fc
(DyLight 650)(ab98593,abcam),于4℃孵育30分钟,洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt
iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图16所示:YN‑035、YN‑036、YN‑051、YN‑052、
YN007均能有效结合表达人PD‑L1的CHO细胞。
Biotin,Pierce,21327)标记人PD‑1‑Fc蛋白,用亚饱和浓度生物素标记的人PD‑1‑Fc加入1
6
×10 /ml的稳定表达人PD‑L1的CHO细胞中,随后立即加入两倍比稀释的各抗体,混匀后孵
育(4℃,1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R‑PE Conjugate(life technology,
SA10041),孵育(4℃,30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测
荧光强度。实验结果如图17所示:PD‑L1抗体YN‑035、YN‑036、YN‑051、YN‑052、YN007均能有
效抑制人PD‑1与表达人PD‑L1的CHO细胞的结合。
YN‑051和YN‑052与小鼠PD‑L1的结合活性:1×10 /ml稳定表达小鼠PD‑L1的CHO细胞中分别
加入两倍比稀释的各抗体,混匀后于4℃孵育1小时,洗细胞后加入Goat F(ab′)2 Anti‑
Human IgG‑Fc(DyLight 650)(ab98593,abcam),于4℃孵育30分钟,洗细胞后用流式细胞仪
(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图18所示:YN‑035、YN‑036、YN‑
051、YN‑052、YN007均能有效结合表达小鼠PD‑L1的CHO细胞。
LC‑Biotin,Pierce,21327)标记小鼠PD‑1‑Fc,用亚饱和浓度生物素标记的小鼠PD‑1‑Fc加
6
入1×10/ml的稳定表达小鼠PD‑L1的CHO细胞中,随后立即加入两倍比稀释的各抗体,混匀
后孵育(4℃,1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R‑PE Conjugate(life technology,
SA10041),孵育(4℃,30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测
荧光强度。结果如图19所示:PD‑L1抗体YN‑035、YN‑036、YN‑051、YN‑052、YN007均能有效抑
制小鼠PD‑1与表达小鼠PD‑L1的CHO细胞的结合。
和YN‑052与人CD137的结合活性:1×10/ml的稳定表达人CD137的293T细胞中分别加入两
倍比稀释的各抗体,混匀后于4℃孵育1小时,洗细胞后加入Goat F(ab′)2 Anti‑Human
IgG‑Fc(DyLight 650)(ab98593,abcam),于4℃孵育30分钟,洗细胞后用流式细胞仪
(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图20所示:YN‑006、YN‑007、YN‑
051和YN‑052均能有效结合表达人CD137的293T细胞。
(如图21a所示),单克隆抗体YN‑003、YN006、YN‑035、YN‑036均呈现为分子量大小约150kDa
的一条条带,而双特异抗体YN‑007、YN‑051、YN‑052均呈现为分子量大小约为200kDa的一条
条带;在还原条件下(如图21b所示),单克隆抗体YN‑003、YN006、YN‑035、YN‑036均呈现为分
子量大小约55kDa和25kDa的两条条带,而双特异抗体YN‑007、YN‑051、YN‑052均呈现为分子
量大小约为75kDa和25kDa的两条条带。
5
谷氨酰胺的DMEM培养基),密度为6×10个细胞/mL。96孔平板(购自PerkinElmer)铺板,每
孔加入50μl细胞悬液。以2.5∶1的比率加入交联抗体(山羊抗人IgG Fc),随后分别加入YN‑
006(10μg/ml)、YN‑035(10μg/ml)、YN‑035+YN‑006(10μg/ml+10μg/ml)、YN‑051(10μg/ml)、
YN‑003+YN006(10μg/ml+10μg/ml)、YN‑007(10μg/ml)、及对照抗体IgG Fc(10μg/ml),在37
℃孵育5小时。然后加入75μL的Bright‑Glo Luciferase试剂(购自Promega),使用酶标仪
(购自Tecan)测量萤光素酶活性。比较各抗体处理细胞组与未经抗体处理组的细胞荧光值
之比(参见图22)。结果表明,与对照IgG Fc相比,YN‑006、YN035+YN006、YN003+YN006、YN‑
007、YN‑051均具有明显的激动活性,而抗PD‑L1抗体YN‑035则无激动活性(参见图22)。
京百奥赛图基因生物技术有限公司)。在第6天时将小鼠平均分为8组,每组荷瘤小鼠分别腹
腔注射PBS(每周二次,共两周)、对照抗体人IgG‑Fc蛋白(7.5mg/kg,每周二次,共两周)、
CD137抗体YN‑006抗体(3mg/kg,每周二次,共两周)、PD‑L1抗体YN‑035(7.5mg/kg,每周二
次,共两周)、CD137抗体YN‑006抗体(3mg/kg,每周二次,共两周)+PD‑L1抗体YN‑035(7.5mg/
kg,每周二次,共两周)、抗PD‑L1/CD137双特异抗体YN‑051(7.5mg/kg,每周二次,共两周)、
抗PD‑L1抗体Atezolizumab(7.5mg/kg,每周二次,共两周)、抗PD‑L1抗体Avelumab(7.5mg/
kg,每周二次,共两周)。除了PBS组5只小鼠,其余7组每组6只。定期观测各组小鼠体重和肿
瘤大小的变化。实验结果如图23和表12所示。图23显示与PBS组或对照抗体人IgG‑Fc组相
比,YN006、YN035、YN006+YN035、YN051、Atezolizumab、Avelumab均具有显著抑瘤活性。其
中,YN006+YN035及YN051的抗肿瘤活性明显强于YN006、YN035、Atezolizumab、Avelumab。表
12显示本动物实验结束时,YN051组有5只小鼠肿瘤完全消退,而YN006+YN035组只有1只小
鼠肿瘤完全消退,表明YN051的治疗效果优于YN006+YN035。
在所附的权利要求和其等同方案的范围内。