一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药、制备方法及治疗类风湿性关节炎的用途

摘要

本发明公开了一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药、制备方法及治疗类风湿性关节炎的用途，该前药具有如下的化学结构：该JAK3共价抑制剂前药利用了生理和病理条件下ROS水平的差异，可以选择性地在发病组织处释放出现有技术中式(1)所示的活性化合物，具有优异的膜透过性、抗增殖活性和调控STAT信号通路的能力，在类风湿性关节炎炎症小鼠模型中呈现出较好的治疗作用，且在ICR健康小鼠中显示出极低的毒性，成功地避免了JAK抑制剂分子在各类生物大分子或其他正常生理组织中与硫醇官能团共价结合，可以用于制备抗类风湿性关节炎药物。

权利要求

1.一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药，其特征在于，化学结构式如下：

2.权利要求1所述JAK3共价抑制剂前药的制备方法，其特征在于：由式(1)所示的化合物经4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯醚化得到；

3.权利要求1所述JAK3共价抑制剂前药在制备治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。

说明书

一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药、制备方法及治疗类风湿

性关节炎的用途

技术领域

[0001] 本发明属于药物合成领域，具体涉及一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药、制备方法及治疗类风湿性关节炎的用途。

背景技术

[0002] 类风湿性关节炎是一种全身性、进行性的慢性自身免疫疾病(Therapeutic suppression of tissue reactivity.I.Comparison of the effects of cortisone and aminopterin.Am J Med Sci 1951,221,169-75.Synthesis and Evaluation of Hydrogen Peroxide Sensitive Prodrugs of Methotrexate and Aminopterin for the Treatment of Rheumatoid Arthritis.J Med Chem 2018,61,3503-3515.Therapeutic suppression of tissue reactivity.II.Effect of aminopterin in rheumatoid arthritis and psoriasis.Am J Med Sci 1951,221,176-82.)，症状主要表现为关节内膜损伤、软骨侵蚀、骨损伤和关节畸形等(The comparative effectiveness of abatacept versus anti-tumour necrosis factor switching for rheumatoid arthritis patients previously treated with an anti-tumour necrosis factor.Ann Rheum Dis 2015,74,430-6.Discovery and development of Janus kinase(JAK)inhibitors for inflammatory diseases.J Med Chem 2014,57,5023-38.)。截至目前，治疗类风湿性关节炎的药物主要分为TNF单克隆抗体和甲氨蝶呤两类(Biologic RheumatoidArthritis Therapies Do We Need More Comparative Effectiveness Data？Biodrugs 2012,26,65-70.)；并非所有患者使用这两类药物后都能起效(Genome-wide association study of response to methotrexate in early rheumatoid arthritis patients.Pharmacogenomics Journal 
2018,18,528-538.van Vollenhoven,R.F.Treatment of rheumatoid arthritis:state of the art 2009.Nature Reviews Rheumatology 2009,5,531-541.)；其中，甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的作用机制尚未明确(Methotrexate in rheumatoid arthritis:a quarter century of development.Trans Am Clin Climatol Assoc 2013,124,16-
25.Methotrexate an OldDrug withNew Tricks.Int J Mol Sci 2019,20.)。

[0003] JAK(Janus kinase)类小分子抑制剂如Tofacitinb(pan-JAK inhibitor)、Baricitinib(JAK1/2inhibitor)等为治疗类风湿性关节炎提供了一种新的策略(JAK inhibitors  for  the  treatment  of  autoimmune  and  inflammatory diseases.Autoimmun Rev 2019,18,102390.Efficacy ofbaricitinib in the treatment of rheumatoid arthritis.Expert opinion on pharmacotherapy 2017,18,1399-
1407.New alternative in the treatment ofrheumatoid arthritis:clinical utility ofbaricitinib.Ther Clin Risk Manag 2019,15,275-284.Tofacitinib for the treatment of moderate-to-severe psoriasis.Expert Rev Clin Immunol 2015,11,
443-55.)。然而由于JAK类小分子抑制剂的选择性较差，在实际应用的过程中引起了感染(Evaluation of the effect of tofacitinib exposure on outcomes in kidney transplant patients.Am J Transplant 2015,15,1644-53.)、贫血(Interleukin-6:from basic biology to selective blockade of pro-inflammatory activities.Semin Immunol 2014,26,2-12.Effects of Janus kinase inhibitor tofacitinib on circulating serum amyloid A and interleukin-6during treatment for rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol 2014,175,208-14.)、血脂升高(The JAK-STAT pathway:
impact on human disease and therapeutic intervention.Annual review of medicine 2015,66,311-28.)、不良免疫反应(Recent progress and perspective in JAK inhibitors for rheumatoid arthritis:from bench to bedside.J Biochem 2015,158,
173-9.)等毒副作用(Safety and efficacy of tofacitinib,an oral janus kinase inhibitor,for the treatment of rheumatoid arthritis in open-label,longterm extension studies.J Rheumatol 2014,41,837-52.)。JAK共价抑制剂的发现使解决其面临的亚型选择性问题成为可能(Selective JAK3 Inhibitors with a Covalent Reversible Binding Mode Targeting aNew Induced Fit Binding Pocket.Cell Chem Biol 2016,23,1335-1340.)。JAK家族蛋白激酶的ATP结合域高度保守，但与区域内JAK1、JAK2和TYK2特定位置氨基酸为色氨酸(Ser)不同，JAK3同区域内氨基酸为半胱氨酸909(Cys909)。而根据报道，JAK3共价抑制剂对BTK(Bruton’s tyrosine kinase)或EGFR(Epidermal growth factor receptor)均表现出了一定的抑制活性(Development of Selective Covalent Janus Kinase 3Inhibitors.J Med Chem 2015,58,6589-606.)。

[0004] Michael Forster课题组于2017年设计并合成了高选择性JAK3共价抑制剂，化学结构如式(1)所示，其IC50为0.127nM(Selective JAK3 Inhibitors with a Covalent Reversible Binding Mode Targeting a New Induced Fit Binding Pocket.Cell Chem Biol 2016,23,1335-1340.)。测试过程中我们发现该抑制剂能够抑制正常组织器官内JAK3的活性，进而可能导致贫血、感染等毒副作用。

[0005]

[0006] 为了克服上述式(1)所示化合物的毒副作用，特提出本发明。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药、制备方法及治疗类风湿性关节炎的用途。

[0008] 本发明上述目的通过如下技术方案实现：

[0009] 一种ROS响应性JAK3共价抑制剂前药，化学结构式如下：

[0010]

[0011] 上述JAK3共价抑制剂前药的制备方法，由式(1)所示的化合物经4-(溴甲基)苯硼酸频哪醇酯醚化得到；

[0012]

[0013] 根据文献报道的方法进行化合物1的合成Selective JAK3 Inhibitors with a Covalent Reversible Binding Mode Targeting a New Induced Fit Binding Pocket.Cell Chem Biol 2016,23,1335-1340)。环己胺的亲核芳族取代得到中间体5，然后通过Pd/H2还原得到中间体6。中间体6经过咪唑闭环反应得到中间体7，随后利用Dess-Martin高碘烷氧化得到醛中间体8。中间体8去保护基得到游离吡啶9，经过Horner-Wadsworth-Emmons-反应得到中间体酮1。合成路线如下：

[0014]

[0015] 其中，各步骤反应试剂、条件和产率如下：

[0016] (i)TEA,Me2CHOH,80℃,yield 91％；

[0017] (ii)H2,Pd/C,EtOH,THF,13h,50℃,yield 94％；

[0018] (iii)DMF/H2O,10min；KHSO5,1h,yield 82％；

[0019] (iv)Dess-Martin periodinane,dry DCM,25℃,1h,yield 82％；

[0020] (v)NaOH,THF/MeOH,50℃,5h,yield 84％；

[0021] (vi)acetic acid:Piperidine＝1:1,EtOH,80℃,1h,yield 24％；

[0022] (Vii)a),K2CO3,H2O,DMF,overnight；b),138500-85-3,30mins,yield 24％。

[0023] 上述JAK3共价抑制剂前药在制备治疗类风湿性关节炎药物方面的应用。

[0024] 有益效果：

[0025] 生理环境下活性氧(ROS，如H2O2)在人体免疫系统中发挥着重要作用；病理条件下，由于氧化应激水平升高，发病组织中的H2O2相较正常组织高出100倍以上，浓度可达到约1mM。本发明提供的JAK3共价抑制剂前药利用了生理和病理条件下ROS水平的差异，可以选择性地在发病组织处释放出现有技术中式(1)所示的活性化合物，具有优异的膜透过性、抗增殖活性和调控STAT信号通路的能力，在类风湿性关节炎炎症小鼠模型中呈现出较好的治疗作用，且在ICR健康小鼠中显示出极低的毒性，成功地避免了JAK抑制剂分子在各类生物大分子或其他正常生理组织中与硫醇官能团共价结合，可用于制备抗类风湿性关节炎药物。

附图说明

[0026] 图1为时间对前药活化的影响；

[0027] 图2为H2O2浓度对前药活化的影响；

[0028] 图3为前药(2)在不同介质中的稳定性；

[0029] 图4为前药(2)和原药(1)对JAK-STAT3/5信号通路的影响；

[0030] 图5为前药(2)和原药(1)对BaF3-Tel-JAK3细胞增殖活性的影响；

[0031] 图6为各组小鼠后爪直径(A)和体重(B)比较；

[0032] 图7为各组小鼠血液中炎症因子(IL-2，G-CSF和SAA)水平比较；

[0033] 图8为各组小鼠踝关节的病理组织切片比较；

[0034] 图9为各组小鼠组织(心脏、肝、脾、肺和肾)中STAT3和STAT5的磷酸化水平比较，其中前药(2)的浓度为20mg/kg；

[0035] 图10为前药(2)和原药(1)对ICR健康小鼠的安全性评价，其中(A)为治疗期间各组的体重变化；(B)为治疗后各组的组织重量；(C)为各组织HE染色切片。

具体实施方式

[0036] 下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

[0037] 一、化合物的合成和结构确证

[0038] 所有试剂可商购，无需进一步纯化即可使用。利用旋转蒸发仪(BüchiRotavapor)在低于55℃的条件下减压浓缩有机溶液。使用0.25mm硅胶板(GF-2.5)薄层色谱法(TLC)在紫外光下可视化监测反应。使用四甲基硅烷(TMS)内标的氘代溶剂，BrukerAV-300核磁共振仪测量1H NMR和13C NMR光谱。利用Water Q-Tof微型质谱仪表征ESI-MS和高分辨率质谱(HRMS)。分析结果在理论值的0.40％之内。使用Agilent C18(4.6mm×150mm，3.5μM)色谱柱进行HPLC研究，甲醇/水的混合溶剂以0.5mL/mL的流速验证目标化合物的纯度(≥95％)检测器利用254nm波长紫外进行最小值和峰值检测。

[0039] N-cyclohexyl-5-nitro-1-(phenylsulfonyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-amine(5)

[0040] 将4-氯-5-硝基-1-(苯磺酰基)-1H吡咯[2,3-b]吡啶(3.36g，10mmol)和环己胺(3.21g，30mmol)添加到异丙醇(40ml)中，在氮气保护下回流1.5h。固体在反应期间溶解。在薄层色谱法显示原料消耗充分后，将混合物倒入饱和NH4Cl溶液中，过滤，用水冲洗，真空干燥，得到化合物5，为黄色固体(3.64g，91％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.14(s,1H),9.12(s,1H),8.28–8.18(m,2H),7.72–7.49(m,4H),6.75(d,J＝4.2Hz,1H),2.12(td,J＝12.1,10.5,
7.2Hz,2H),1.88(s,2H),1.61–1.36(m,3H),1.49(s,1H),0.11(s,3H).

[0041] N4-cyclohexyl-1-(phenylsulfonyl)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-4,5-diamine(6)

[0042] 向化合物5(3.64g，9.1mmol)的甲醇溶液中加入钯/C催化剂(10％)，在45℃的H2气氛下搅拌过夜，过滤掉催化剂，浓缩残渣，得到化合物6，为灰紫色固体(3.18g，94％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.17(dd,J＝7.4,1.9Hz,2H),7.86(s,1H),7.63–7.52(m,1H),7.49(dd,J＝9.4,5.6Hz,3H),6.60(d,J＝4.2Hz,1H),3.74(td,J＝9.8,9.4,4.7Hz,1H),2.11(dd,J＝11.8,4.2Hz,2H),1.84(dt,J＝12.0,4.0Hz,2H),1.71(dd,J＝10.5,6.5Hz,1H),1.51–1.30(m,2H),1.35–1.21(m,3H),0.12(s,3H).

[0043] (5-(1-cyclohexyl-6-(phenylsulfonyl)-1,6-dihydroimidazo[4,5-d]pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)f uran-2-yl)methanol(7)

[0044] 将化合物6(100mg，0.27mmol)溶于2.7ml DMF和9.45μl H2O中，并向溶液中加入5-羟甲基-2-呋喃甲醛(41mg，0.324mmol)。在室温下将溶液搅拌10分钟后，添加KHSO5(116mg，0189mmol)。继续搅拌1h，直到TLC显示原料全部消耗。将混合物倒入半饱和NaHCO3溶液中，过滤，沉淀重新溶解在DCM中。经盐水洗涤、Na2SO4干燥后，用普通50-100％EA/PE梯度硅胶柱层析法对有机相进行浓缩和纯化，得化合物7，为淡褐色固体(89mg，69％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.79(s,1H),8.22–8.14(m,3H),8.06(d,J＝4.1Hz,1H),7.77–7.62(m,4H),7.20(d,J＝4.2Hz,1H),7.10(d,J＝3.4Hz,1H),6.61(d,J＝3.4Hz,1H),4.85(s,1H),4.56(d,J＝
3.7Hz,3H),2.18(d,J＝12.1Hz,3H),1.95(d,J＝12.4Hz,5H),1.51(s,4H).

[0045] 5-(1-cyclohexyl-6-(phenylsulfonyl)-1,6-dihydroimidazo[4,5-d]pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)f uran-2-carbaldehyde(8)

[0046] 将化合物7(3g，6.12mmol)加入DCM(120ml)中，于0℃下加入DMP试剂(3.2g，7.32mmol)。缓慢搅拌混合物1小时并达到环境温度，直到薄层色谱显示原料完全转化。将混合物倒入饱和NaHCO3溶液中进行淬火，用DCM(50ml×3)萃取水相。有机相析出并用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，然后在硅胶上用25-50％的EA/PE梯度柱层析法纯化，得到化合物8，为黄色固体(2.4g，82％)。1H NMR(400MHz,Acetone)δ10.26(s,1H),9.02–8.82(m,1H),8.53(ddd,J＝21.6,4.0,1.7Hz,1H),8.13(d,J＝1.5Hz,1H),7.91(dd,J＝30.2,2.3Hz,1H),
7.73–7.62(m,1H),7.60–7.51(m,2H),7.31(t,J＝3.2Hz,1H),7.18–6.95(m,3H),6.57(d,J＝5.6Hz,1H),4.89(s,1H),4.73(s,1H),3.64(dd,J＝7.2,5.4Hz,2H),3.59(t,J＝7.1Hz,
1H),3.51(t,J＝6.5Hz,1H),3.25(t,J＝6.9Hz,1H),3.15(td,J＝7.0,4.4Hz,2H),3.06(s,
1H),2.78(s,1H).

[0047] 5-(1-cyclohexyl-1,6-dihydroimidazo[4,5-d]pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)furan-2-carbaldehy de(9)

[0048] 向溶有化合物8(3.7g，7.81mmol)的无水THF(165ml)和无水甲醇(55ml)溶液中添加Cs2CO3(7.7g，23.4mmol)，将混合物在室温下搅拌6小时。当TLC显示原料完全转化时，将混合物倒入饱和NH4Cl溶液中，并用EA(3×150ml)提取。有机相析出，用盐水洗涤，Na2SO4干燥，并使用普通50-100％EA/PE梯度在硅胶上通过柱层析纯化，得化合物9，为黄色固体(2.4g，82％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.13(s,1H),9.77(s,1H),8.72(s,1H),7.80(d,J＝3.7Hz,
1H),7.59(t,J＝3.0Hz,1H),7.41(d,J＝3.7Hz,1H),6.86(dd,J＝3.6,1.8Hz,1H),5.12–
4.83(m,1H),2.38(d,J＝12.1Hz,2H),2.05–1.95(m,4H),1.54(t,J＝11.2Hz,3H).[0049] (E)-2-cyano-3-(5-(1-cyclohexyl-1,6-dihydroimidazo[4,5-d]pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)fura n-2-yl)-N,N-dimethylacrylamide(1)

[0050] 将化合物9(320mg，0.96mmol)溶于N，N-二甲基-2-氰基乙酰胺(213mg，1.9mmol)和甲醇(40ml)中，向上述悬浮液中加入乙酸(0.12ml，1.9mmol)和哌啶(0.20ml，1.9mmol)，将混合物在氮气气氛下加热至80℃，反应1小时。TLC显示完全转化后，用EA稀释，用盐水冲洗。用EA(3×20ml)萃取水相，有机相析出，用盐水洗涤，Na2SO4干燥，并使用普通50-100％EA/PE梯度在硅胶上通过柱层析纯化，得到化合物1，为黄色固体(345mg，84％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.13(s,1H),8.71(d,J＝6.4Hz,1H),7.82(s,1H),7.52(d,J＝3.8Hz,1H),7.42(d,J＝3.7Hz,1H),7.24(dd,J＝24.1,3.8Hz,1H),5.12–4.85(m,1H),3.05(d,J＝4.9Hz,6H),
2.15–1.88(m,6H),1.70–1.45(m,4H).

[0051] (Z)-2-((5-(1-cyclohexyl-1,6-dihydroimidazo[4,5-d]pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-yl)furan-2-yl)(h ydroxy)methyl)-3-(dimethylamino)-3-((4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)benzyl)oxy)acrylonitrile(2)

[0052] 将化合物1(50mg，0.12mmol)溶于DMF(5ml)中，加入K2CO3(32mg，0.23mmol)和一滴水，搅拌过夜。然后加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(30mg，0.144mmol)，继续搅拌直到薄层色谱显示发生转化。将混合物倒入水中，用EA(3×20ml)提取。有机相析出，用盐水洗涤，Na2SO4干燥，并使用普通的1％-5％MeOH/DCM梯度在硅胶上通过柱层析纯化，得到化合物2，为黄色固体(18mg，24％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.78(s,1H),8.55(s,1H),7.98(s,1H),7.82(d,J＝7.5Hz,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,2H),7.43(d,J＝7.5Hz,1H),7.28(d,J＝8.2Hz,2H),5.67(s,1H),4.02(s,1H),3.53(m,1H),2.92(s,6H),2.38–2.34(m,2H),2.04–1.91(m,4H)，1.54(m,2H),1.29(s,9H).

[0053] 二、化合物的药代动力学特性

[0054] 1、前药的活化

[0055] 利用前药(2)的DMSO溶液配制50μL终浓度为1mM的水溶液。在EppendorfEP管中配制H2O2浓度为10mM的PBS缓冲液(450μL，pH 7.4)。在37℃下将上述两种溶液混合，开始孵育并计时，分别在0、0.5、1、2和4小时后取样，通过RP-HPLC-UV(λ＝254nm)进行化合物含量分析检测。

[0056] 利用前药(2)的DMSO溶液配制180μL终浓度为1mM的水溶液，将样品分成6等份，每份30μL。分别向上述每个样品中加入含H2O2的PBS缓冲液，设置H2O2的终浓度分别为0、10、100、1000和10000μM。37℃下开始孵育并计时，孵育2小时后取样，并通过RP-HPLC-UV(λ＝
254nm)进行化合物含量分析检测。

[0057] 2、理化性质及渗透率的测定

[0058] pKa和分配系数(log D，pH 7.4)依据Gemini Profiler仪器(pION)上的Avdeef和Tsinman4的方法，采用“gold-standerd”Avdeef-Bucher电位滴定法测定的。用pSOLModel 3仪器(美国马萨诸塞州剑桥市的pION Inc.)获得电位溶解度数据，然后用随附的计算机程序pS处理。

[0059] 渗透率(Pe)通过标准平行人工膜渗透率测定法(pION的PAMPA)测定。在PAMPA Explorer仪器(马萨诸塞州沃本市的pION Inc.)上使用PAMPAExplorer命令软件(版本3.6.0.6)进行如下操作：用pH 7.4的系统缓冲液(pION Inc.，Woburn，MA)制备稀释为2mM浓度的测试化合物，然后将150μL稀释的测试化合物转移至UV板(马萨诸塞州沃本市的pION Inc.)，并将UV光谱作为参考板。将预装的PAMPA三明治(pION Inc.，马萨诸塞州沃本市)上的膜涂上4μLGIT脂质(pION Inc.，马萨诸塞州沃本市)。然后在接受室中充满200μL受体溶液缓冲液(pION Inc.，Woburn，MA)，在供体室中充满150μL稀释的测试化合物。组装PAMPA三明治，将其置于Gut-Box控制的环境室中搅拌30分钟。将水界面层设置为40μM以进行搅拌，读取供体和受体的紫外光谱(200–500nm)。渗透系数是使用PAMPAExplorer命令软件(版本
3.6.0.6)基于参考板，供体板和受体板的AUC计算得出的。所有化合物均一式三份进行测试，数据以平均值表示。该测定的标准品为地高辛和普萘洛尔(pH＝7.4时，Pe＝541.5×10–6
)。

[0060] 3、稳定性测试

[0061] 3.1、化学稳定性测试

[0062] 向预热的PBS(0.1％DMSO)溶液中添加10μL前药溶液(在DMSO中为1mM)。在0.25、0.5、1、2、4、8和24小时后取样，然后进行RP-UPLC-UV(λ＝254nm)分析。

[0063] 3.2、模拟的胃和肠液稳定性测试

[0064] 模拟胃液(SGF)的制备：向去离子水(95mL)中加入氯化钠(0.20g)，浓HCl(0.70mL)和胃蛋白酶(Sigma，P-7000，0.32g)，溶液最终体积浓缩至100mL。

[0065] 模拟肠液(SIF)的制备：向0.1N氢氧化钠水溶液(38mL)中加入磷酸二氢钾(KH2PO4，0.68g)和胰酶(Sigma，P-1625，1.0g)，使溶液溶解用去离子水稀释至100mL最终体积。通过添加1N氢氧化钠水溶液将溶液的pH调节至7.5。

[0066] 将前药溶液(10μL，在DMSO中为10mM)添加到990μLSGF或SIF中。将该混合物在37℃下孵育。在0.25、0.5、1、2、4、8和24小时后取样(90μL)，进行RP-UPLC-UV(λ＝306nm)分析。对照组被设置为不添加胃蛋白酶或胰酶，平行进行后续步骤。

[0067] 3.3、人和小鼠血浆稳定性测试

[0068] 向2mL的去离子水中加入2mL冻干的血浆(Sigma，对于人血浆为P9523，对于小鼠血浆为P9275)。将此稀释的血浆(250μL)添加到预热的PBS(240μL，37℃)中。在开始测定之前，将混合物以300rpm摇动10分钟。将前药溶液(1mM，10μL)添加到预热的PBS/血浆混合物中，最终浓度为20μM。在0.25、0.5、1、2、4、8和24小时后采集样品(50μL)，并进行RP-UPLC-UV(λ＝254nm)分析。

[0069] 4、实验结果

[0070] 4.1、前药的活化

[0071] 4.1.1、前药的活化机制

[0072] 如下所示，前药(2)由H2O2触发，硼酸酯苄醚基转化为烯醇式结构(3)，由于化学不稳定性，化合物(3)将通过1,4消除被转化为原药(1)，而硼酸酯转化为无毒副作用的肼在体内代谢。

[0073]

[0074] 4.1.2、时间对前药活化的影响

[0075] 检测了在H2O2病理生理浓度下前药(2)的活化效果。如图1所示，前药(2)能够以时间依赖的方式释放。给药0.5小时后，检测到前药释放(原药含量为7.8％，前药含量为78.1％)；给药4小时后，前药(2)已经完全释放(未检测到前药)。

[0076] 4.1.3、H2O2浓度对前药活化的影响

[0077] 检测了H2O2浓度对前药活化的影响。于37℃下，2小时内，使用不同浓度的H2O2(最大浓度为1mM)溶液(含30％PBS)检测前药(2)的释放。如图2所示，前药可以借助浓度依赖的方式释放。在H2O2浓度为0.1μM或低于0.1μM时，前药(2)未释放(未检测到原药)；在1μM H2O2浓度下，前药(2)部分释放(含量27.1％)。在10μM和更高的浓度下，前药(2)完全释放(未检测到前药)。

[0078] 4.2、理化性质及渗透率

[0079] 使用Gemini Profiler仪器确定了酸解离常数(pKa)和溶解度，并使用PAMPA仪器测试了渗透率(Pe)以比较前药(2)和原药(1)这两种化合物的理化性质。结果如表1所示，前药(2)的pKa特性与原药(1)类似；前药(2)的溶解度比原药(1)略弱；不过前药(2)膜渗透性比原药(1)更好。

[0080]

[0081] 4.3、稳定性

[0082] 为了表征前药(2)在生理盐水、小鼠血浆(mouse plasma)、人血浆(humanplasma)、模拟肠液(simulated intestinal fluid，SIF)和模拟胃液(simulated gastric fluid，SGF)中的稳定性，与37℃条件下选取了不同时间点(0.25、0.5，1、2、4、8、12和24h)进行检测。实验结果如图3所示，前药(2)的含量在24小时内始终大于95％。上述测试结果表明前药(2)具有良好的稳定性。

[0083] 三、化合物的药理和毒理评价

[0084] 1、蛋白质印迹分析

[0085] 通过Western印迹评估蛋白质表达。收集并裂解用不同浓度的化合物处理的BaF3-Tel-JAK3细胞。在SDS-PAGE中将含有蛋白质的上清液转移到PVDF膜上，封闭膜并与一抗一起孵育，然后在黑暗中与二抗孵育1小时。结果通过Odyssey红外成像系统(LI-COR，林肯，内布拉斯加州，美国)检测。从Cell Signaling Technology公司(美国马萨诸塞州贝弗利市)商业购买使用的抗体，分别为GADPH(#5174)，p-Stat3(#9145S)，Stat3(#9133S)，p-Stat5(#4322S)，Stat5(#25656S)。

[0086] 2、细胞活力测定

[0087] 使用MTT测定法测定细胞活力。将处于对数期的Tel-JAK3-BaF3细胞以每孔70-80％汇合的密度接种到96孔板中，在37℃和5％CO2的条件下过夜培养。使用/不使用0.1mM H2O2处理药物或前药后，添加20μL 5mg/mLMTT，并将细胞在37℃下孵育4小时。弃去上清液，并向每个孔中加入150μL DMSO。将混合物在小型振荡器上在室温下振荡5分钟，并通过Multiskan Spectrum Microplate Reader(Thermo，USA)在570nm和630nm下测量分光光度吸光度。对每个浓度点以平行方式进行一式三份实验，结果以平均值±SEM表示。A570nm与A630nm的差值作为细胞活力的指标。来自用DMSO培养的细胞的孔的净吸光度被认为是
100％生存力值。通过以下公式计算处理的细胞的存活率百分比：

[0088] 存活率(％)＝(A570nm-A630nm)处理过的细胞/(A570nm-A630nm)对照×100％。

[0089] 3、抗关节炎体内动物实验

[0090] 3.1、炎症模型的构建

[0091] 在第-1天，通过从尾巴底部约0.5cm的皮下注射，用完全弗氏佐剂(CFA，Difco)中的100μg鸡II型胶原蛋白(CII，Chondrex)进行皮内免疫。在第二次免疫后一周的第21天，可以观察到疾病发生。

[0092] 3.2、给药、取样和检测

[0093] 将30只8-10周的类风湿性关节炎Dba/1j雄性小鼠随机分为正常组(生理盐水，ip)、前药5mg/kg组(前药2，5mg/kg，ip)、前药10mg/kg组(前药2，10mg/kg，ip)、前药20mg/kg组(前药2，20mg/kg，ip)、原药组(原药1，10mg/kg，ip)和模型组(即Vehicle组或Saline组，生理盐水，ip)。一旦观察到肿胀，就开始实验并持续14天。每周测量三次这些小鼠的后爪直径和体重。在最后一次给药后24小时处死所有动物，并提取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。测量器官的重量，并通过HE染色法检查器官病变状况。

[0094] 3.3、血清中IL-2，G-CSF和SAA的检测

[0095] 使用市售试剂盒根据血清制造商(IL-2(IL-2(m)ELISA kit,Catalog#KGEMC002-1),G-CSF(G-CSF(m)ELISA kit,Catalog#KGEHC132-1),SAA(SAA(m)ELISA kit,Catalog#EA-5202))的说明进行测试。

[0096] 3.4、免疫印迹

[0097] 将组织称重并放入匀浆器中研磨成匀浆，然后用PBS洗涤匀浆并低速离心，制备细胞悬液并裂解。在SDS-PAGE中将含有蛋白质的上清液转移到PVDF膜上，封闭膜并与一抗一起孵育，然后与二抗在黑暗中孵育1小时。结果通过Odyssey红外成像系统(LI-COR，林肯，内布拉斯加州，美国)检测。从Cell Signaling Technology公司(美国马萨诸塞州贝弗利)商业化购买的抗体，GADPH(#5174)，p-Stat3(#9145S)，Stat3(#9133S)，p-Stat5(#4322S)，Stat5(#25656S)抗体。

[0098] 4、前药的安全性评估

[0099] 将30只ICR健康小鼠(雌雄各半)随机分为3组(n＝10)：前药组(前药2，100mg/kg，ip)，原药组(原药1，100mg/kg，ip)和对照组(生理盐水，ip)。连续给药14天以记录小鼠的体重。在最后一次给药后24小时处死所有动物，提取心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。测量器官的重量，通过HE染色检查器官病变状况。

[0100] 5、实验结果

[0101] 5.1、蛋白质印迹

[0102] 针对BaF3-Tel-JAK3细胞进行了蛋白质印迹分析，分别检测了前药(2)和原药(1)对JAK3-STAT3/5信号通路的影响。如图4所示，前药(2)和药物(1)对p-STAT3和p-STAT5均具有调节作用。值得注意的是，前药(2)对pSTAT3和pSTAT5的负调节作用强于原药(1)。

[0103] 5.2、细胞活力

[0104] 测试了H2O2存在和不存在的情况下，原药(1)和前药(2)对BaF3-tel-JAK3细胞(一种JAK3激酶活性依赖性生长转基因细胞系)的抗增殖活性。结果如图5所示，前药(2)可以在含有H2O2的介质中释放并发挥抗增殖活性，IC50为563.7nM，前药(2)略强于原药(1)(IC50＝790.4nM)，略弱于托法替尼(IC50＝236.2nM，阳性对照)。而前药在没有H2O2的培养基中丧失了抗增殖活性(IC50>10μM，原药(1)IC50＝764.0nM)。

[0105] 5.3、小鼠的脚直径和体重

[0106] 将前药(2)引入了类风湿性关节炎的小鼠模型中以进行前药体内有效性检测，该模型是一类常见的体内类风湿药物药效评估模型。将30只8-10周的类风湿性关节炎Dba/1j雄性小鼠随机分为6组，利用i.p的方式每天一次给予生理盐水、前药(2)(5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg)和原药(1)(10mg/kg)，共14天，记录了小鼠的脚直径和体重，分别如图6(A)和图6(B)所示。实验结果表明，前药(2)和原药(1)对小鼠足部肿胀具有免疫抑制作用，前药
20mg/kg组和原药组在小鼠足部表现出最大的肿胀抑制作用。另外，前药组对小鼠足肿胀抑制表现出较强的剂量依赖性。

[0107] 5.4、小鼠血清中的炎症因子水平

[0108] 证实前药(2)在体内对类风湿性关节炎有效后，测量了每组小鼠血清中的炎症因子水平，即白介素2(Interleukin-2，IL-2)，粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)和血清淀粉样蛋白A(Serum amyloidA，SAA)。如图7所示，前药给药组以剂量依赖性方式显著降低了血液中炎症因子的浓度。

[0109] 5.5、小鼠踝关节病理组织切片

[0110] 对每组小鼠的踝关节进行了病理组织切片HE分析，以确定给药后类风湿性关节炎Dba/1j小鼠的病理状况，如图8所示。实验结果显示：与正常组相比，模型组小鼠的滑膜细胞紊乱并严重退化，软骨和骨骼被侵蚀，伴有滑膜增生，滑膜细胞无序变性，滑膜血管扩张充血；与模型组相比，前药(2)和原药(1)对类风湿性关节炎Dba/1j小鼠的滑膜细胞紊乱、软骨和骨骼侵蚀、滑膜增生滑膜细胞无序变性、和滑膜血管扩张充血的病理状况有显著改善作用。

[0111] 5.6、组织中STAT3和STAT5的磷酸化水平

[0112] 检测前药(2)和药物(1)对心、肝、脾、肺和肾等各种组织中JAK3-STAT5信号通路的影响，对每种组织进行了蛋白质印迹实验。实验如图9所示，该前药(2)对非病变组织不具有JAK3活性，而原药(1)下调了其他组织中STAT5的磷酸化水平，说明前药(2)对病理组织具有选择性，副作用明显降低。

[0113] 5.7、前药的安全性评估

[0114] 为了测试前药(2)和原药(1)在ICR健康小鼠中的安全性，14天内每天为ICR健康小鼠腹腔注射5倍有效剂量(100mg/kg)的药物，记录了给药过程中ICR健康小鼠的体重，如图10(A)所示。比较三组数据，前药组和对照组的体重趋势相似，而原药组的小鼠在第八天后体重增加。此外，还对实验小鼠的器官进行了解剖，称重和病理分析。治疗后各组的组织重量如图10(B)，原药组的肝脏和脾脏的重量与对照组和前药组相比有所增加，其他组织之间的重量没有显著差异。病理切片分析如图10(C)所示，原药(1)在心脏和肺部具有明显的炎症浸润。实验结果表明，在ICR健康小鼠中以单次给予100mg/kg/day给药剂量的前药(2)，14天内具备较好的安全性。这表明前药(2)对ICR健康小鼠的副作用比原药(1)显著降低，安全性显著提高。

[0115] 本发明开发了一种利用H2O2触发的、可将药物递送至类风湿性关节炎相关组织的新型JAK3共价抑制剂前药。通过封闭共价抑制剂的活泼基团，在维持原药活性的同时降低了毒性，且具备良好的理化性质和化学稳定性。该前药(2)在小鼠足部类风湿性关节炎模型上显示出足够良好的治疗效果，与此同时正常组织(尤其是脾脏和肺脏)中的JAK3-STAT信号通路却没有受到影响。因此与原药(1)相比，前药(2)的安全性具有显著的改善。

[0116] 上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。