一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用，涉及基因工程及发酵工程领域。本发明提供的一种葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，且本发明还提供了编码上述葡萄糖氧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的葡萄糖氧化酶具有良好的性质，最适pH 5.5，最适温度30℃，具有较好的适低温性。所述葡萄糖氧化酶作为一种新型的酶制剂，可广泛应用于饲料、食品、医药等行业。

权利要求

1.一种葡萄糖氧化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述葡萄糖氧化酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.包含权利要求2所述编码葡萄糖氧化酶的基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的制备方法为将葡萄糖氧化酶的基因插入到质粒pPIC ZaA上的EcoR 1和Not 1限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。

5.包含权利要求2所述编码葡萄糖氧化酶的基因或权利要求3或4所述重组载体的重组菌株。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为：用重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞即得。

7.权利要求1所述葡萄糖氧化酶在食品保鲜中的应用。

8.权利要求2所述基因、权利要求3或4所述的重组载体或权利要求5或6所述重组菌株在产业化生产葡萄糖氧化酶中的应用。

9.权利要求1所述葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求3或4所述的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

2)培养所述重组菌株，诱导葡萄糖氧化酶的表达，收集上清液；

3)回收并纯化所述上清液，得到葡萄糖氧化酶。

说明书

一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程及发酵工程技术领域，更具体的说是涉及一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4,GOD)是一种需氧脱氢酶，主要分布于多种动物、植物和微生物中，以分子氧为电子受体，专一性将β‑D‑葡萄糖催化氧化成葡萄
糖酸并产生过氧化氢。葡萄糖氧化酶在化学、制药、食品、饮料、临床诊断、生物技术等众多
领域有广泛的应用，包括用于糖尿病检测的葡萄糖生物传感器、食品防腐剂等。

[0003] 葡萄糖氧化酶作为天然生物保鲜剂之一，能够消耗氧气产生过氧化氢，具有巨大的潜在应用价值。Xu等(LWT 92(2018):339‑346)利用葡萄糖氧化酶保鲜南美白对虾，发现
其不仅能有效防止对虾褐变，而且对其色泽、气味、硬度、弹性、咀嚼性等品质指标都有良好
的保持作用。

[0004] 目前葡萄糖氧化酶最主要的生产菌株是黑曲霉和青霉，但黑曲霉和青霉生产产量低、纯化工艺繁杂，且在低温环境下酶活性较低，在水产品保鲜应用方面效果不佳。

[0005] 因此，如何提供一种葡萄糖氧化酶，优化其理化性质，并提供一种用基因工程方法构建的更优良的生产菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用。

[0007] 本发明从青霉中得到了一个新的葡萄糖氧化酶基因，编码的葡萄糖氧化酶在酸性及中性的范围有高活性及稳定性，且具有较好的适低温性能，这些特点意味着本发明的新
的葡萄糖氧化酶在水产品保鲜方面将会更有应用价值。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 一种葡萄糖氧化酶M5GOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0010] 其中，SEQ ID NO.1：

[0011] MKSIILASALASLAAAQGFTPAEQIDVQASLISDPNKVAGQTFDYIIAGGGLTGLTVAAKLSENPNITVLVIEKGFYESNNGPIIENPNDYGLIFGSSVDQNYLTVPMAINNRTLEVKSGKGLGGSTLINGDSWTGPDKVQIDS
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DGWVGYVKQNFRANWHAVGTCSMMSRELGGVVDPTAKVYGTQGLRVIDGSIPPTQVSSHVMTVFYGMALKIADAVL
ADYKP。

[0012] 该酶全长605个氨基酸，N端前16个氨基酸为信号肽序列“MKSIILASALASLAAA”，SEQ ID NO.5。

[0013] 因此，成熟的葡萄糖氧化酶M5GOD的理论分子量为63.860KDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2：

[0014] QGFTPAEQIDVQASLISDPNKVAGQTFDYIIAGGGLTGLTVAAKLSENPNITVLVIEKGFYESNNGPIIENPNDYGLIFGSSVDQNYLTVPMAINNRTLEVKSGKGLGGSTLINGDSWTGPDKVQIDSWETVLGNTGWNYDALK
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[0015] 该葡萄糖氧化酶pH作用范围广，在pH值为3～7范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力，最适pH为5.5。该酶最适作用温度30℃。

[0016] 进一步的：一种葡萄糖氧化酶基因，编码上述的葡萄糖氧化酶的基因，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0017] 其中，SEQ ID NO.3：

[0018] ATGAAGTCCATCATTCTTGCCTCTGCCCTCGCCTCTCTAGCTGCAGCCCAGGGCTTCACTCCAGCCGAGCAGATTGATGTCCAGGCCAGCCTGATCTCCGACCCTAACAAGGTCGCCGGCCAGACATTCGACTACATCATCGCT
GGAGGTGGTCTGACAGGTCTTACCGTTGCGGCCAAGCTGTCTGAGAACCCTAACATCACCGTCCTTGTCATCGAAA
AGGGCTTCTACGAGTCCAATAATGGGCCCATCATCGAAAACCCCAACGACTATGGCTTGATCTTCGGTAGCTCTGT
TGACCAAAACTACCTCACCGTTCCCATGGCCATCAACAACCGTACCCTGGAAGTCAAGTCTGGCAAGGGTCTCGGT
GGTTCCACGTTGATTAACGGTGACTCCTGGACCGGTCCCGACAAGGTCCAGATTGACTCCTGGGAGACTGTCTTGG
GAAATACCGGTTGGAACTATGACGCCCTCAAGGGGTACATGAAGGAAGCCGAGCTTGCTCGTTACCCAACCGCCAG
TCAGATTGCCGCCGGTATCTACTTCAACGAAACCTGCCATGGATTCAACGGCACCGTTAACGCCGGACCCCGTGAT
GATGGTACCCCTTACTCTCCCCTTATGAAAGCCCTCATGAACACCACCTCTGCCAAGGGTGTTCCCACTCAGCTTG
ACTTCCTCTGCGGTCGCCCTCGTGGTGTCTCCATGATCTACAACAACTTGCTGCCTGACCAGACCCGTGCGGATGC
TGCTCGCGAGTGGCTTCTTCCCAACTATAAGCGCCCCAACTTGAGCATTCTTACCGGCCAGGTTGTTGGAAAGGTT
CTCTTCACTCAAACCGCGACTGGCCCCAAGGCTACTGGTGTTAATTTTGGCACCAACAAGGCCATCAATTTCAACG
TCTTGGCCAAGCACGAGGTCCTTTTGGCTGCTGGCTCTGCCATCTCGCCCCTAATCCTCGAGCACTCTGGTATTGG
TCTAAAGTCTGTCCTCGACCAGTTCAATATCACCCAGCTCGTCGAGCTTCCCGTCGGTCTCAATATGCAGGACCAG
ACCACCACCACTGTCCGCGCCCGAGCCAAGGCGTCTTCTGCTGGTCAGGGCCAGGCCGTCTACTTTGCCAACTTCA
CTGAGGTCTTTGGTGACTACTCCGCTCGAGCTACCGATTTACTCAACACCAAGCTCTCCCAGTGGGCCAACGAGAC
TGTTGCACGCGGAGGCTTCAACAACGCCACCGCTCTCTTAATCCAGTATGAGAACTACCGTAACTGGCTCCTGAAC
GAGGACGTTGCCTATGTCGAGCTTTTCCTCGACACCAACGGAAAGATGAACTTTGACTTGTGGGATCTCATCCCCT
TCACGCGCGGCTCTACGCACATAGCACACGCCGACCCTTATCTGCAGTCCTTCTCCAACAATCCCATGTTCCTGTT
GAACGAGCTTGACCTTCTTGGCCAGGCTGCTGGCTCGATGCTGGCTCGTGAGATCCAGAACTCGGGTGAGCTGGCC
AACTACTTTGACGGCGAGGATATCCCCGGGGCAAATCTCTTGCCCTACAACGCTACCCTCGATGGCTGGGTTGGAT
ATGTCAAGCAGAACTTTCGTGCCAACTGGCACGCTGTCGGGACTTGTTCTATGATGTCCCGGGAGCTTGGTGGTGT
TGTTGATCCTACGGCCAAGGTCTACGGTACCCAGGGTCTTCGTGTCATTGATGGTTCTATTCCACCCACCCAGGTG
TCATCTCACGTTATGACCGTTTTCTACGGTATGGCTTTGAAGATTGCCGATGCTGTTCTGGCTGACTACAAGCCC。

[0019] 本发明通过PCR的方法分离克隆了葡萄糖氧化酶基因M5GOD，cDNA全序列分析结果表明，葡萄糖氧化酶基因全长1815bp，其中，信号肽的碱基序列为：“ATGAAGTCCATCATTCTTG
CCTCTGCCCTCGCCTCTCTAGCTGCAGCC”，SEQ ID NO.6，此外，核苷酸序列以TAA为终止密码子。
所以编码成熟葡萄糖氧化酶蛋白的的核苷酸序列全长1767bp，如SEQ ID NO.4所示：

[0020] CAGGGCTTCACTCCAGCCGAGCAGATTGATGTCCAGGCCAGCCTGATCTCCGACCCTAACAAGGTCGCCGGCCAGACATTCGACTACATCATCGCTGGAGGTGGTCTGACAGGTCTTACCGTTGCGGCCAAGCTGTCTGAGAAC
CCTAACATCACCGTCCTTGTCATCGAAAAGGGCTTCTACGAGTCCAATAATGGGCCCATCATCGAAAACCCCAACG
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GGCCAGGCCGTCTACTTTGCCAACTTCACTGAGGTCTTTGGTGACTACTCCGCTCGAGCTACCGATTTACTCAACA
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TGATGGTTCTATTCCACCCACCCAGGTGTCATCTCACGTTATGACCGTTTTCTACGGTATGGCTTTGAAGATTGCC
GATGCTGTTCTGGCTGACTACAAGCCC。

[0021] 将葡萄糖氧化酶M5GOD基因序列及推导出的氨基酸序列在NCBI中进行BLAST比对，该基因与来源于青霉的葡萄糖氧化酶氨基酸序列一致性为74％。说明M5GOD是一种新的葡
萄糖氧化酶。

[0022] 进一步的，包含上述编码葡萄糖氧化酶的基因的重组载体。

[0023] 优选的：重组载体为pPIC ZaA‑M5GOD。

[0024] 将本发明的葡萄糖氧化酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选
为将葡萄糖氧化酶基因插入到质粒pPIC ZaA上的EcoR1和Not 1限制性酶切位点之间，使该
核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC ZaA‑M5GOD。

[0025] 进一步的：包含上述编码葡萄糖氧化酶的基因或上述重组载体的重组菌株。

[0026] 优选的：重组菌株为毕赤酵母X33/M5GOD。

[0027] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)，得到重组菌株X33/M5GOD。

[0028] 进一步的：上述葡萄糖氧化酶M5GOD在食品保鲜中的应用。

[0029] 进一步的：上述基因、上述的重组载体或上述重组菌株在产业化生产葡萄糖氧化酶中的应用。

[0030] 进一步的：一种制备葡萄糖氧化酶M5GOD的方法，包括以下步骤：

[0031] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

[0032] 2)培养重组菌株，诱导葡萄糖氧化酶的表达，收集上清液；

[0033] 3)回收并纯化上清液，得到葡萄糖氧化酶M5GOD。

[0034] 本发明从青霉中克隆得到一个新的葡萄糖氧化酶基因，其编码的葡萄糖氧化酶在酸性和中性条件下具有较高的酶活力，并且其具有较好的适低温性能。

[0035] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用，取得的技术效果为提供了一种适低温的葡萄糖氧化酶、编码
上述葡萄糖氧化酶的基因、包含上述葡萄糖氧化酶的重组载体、包含上述葡萄糖氧化酶基
因的重组菌株、制备上述葡萄糖氧化酶的方法及葡萄糖氧化酶的应用。

附图说明

[0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。

[0037] 图1为重组葡萄糖氧化酶的最适pH值示意图。

[0038] 图2为重组葡萄糖氧化酶的pH稳定性示意图。

[0039] 图3为重组葡萄糖氧化酶最适反应温度示意图。

[0040] 图4为重组葡萄糖氧化酶热稳定性示意图。

[0041] 图5为重组葡萄糖氧化酶用于保鲜应用的挥发性盐基氮含量示意图。

[0042] 图6为重组葡萄糖氧化用于保鲜应用的菌落总数示意图。

具体实施方式

[0043] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本发明保护的范围。

[0044] 本发明实施例公开了一种葡萄糖氧化酶M5GOD及其编码基因和应用。

[0045] 实验材料和试剂：

[0046] 菌株和载体：

[0047] 大肠杆菌DH5a、毕赤酵母X33、载体pPIC ZaA均购自Invitrogen公司。

[0048] 酶类及其它生化试剂：

[0049] 限制性内切酶和连接酶均购自公司；其它均为国产生化试剂。

[0050] 培养基：

[0051] 种子培养基(/L)：NaNO32g，K2HPO41g，KCl 0.5g，MgSO40.01g，蔗糖30g；

[0052] 大肠杆菌培养基LB：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0；

[0053] 酵母培养基YPD：2％胰蛋白胨、1％酵母粉、2％葡萄糖；

[0054] BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)；

[0055] BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

[0056] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》第三版J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进
行。

[0057] 实施例1

[0058] 青霉中葡萄糖氧化酶编码基因M5GOD的克隆

[0059] 提取青霉基因组DNA：

[0060] 将青霉经种子培养基培养5天后，用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2ml提取液，研磨5min，然后将研磨液置于离心管中，采用基因组提取试剂盒提取。

[0061] 根据葡萄糖氧化酶基因序列设计合成引物F1和R1：

[0062] F1：5'‑AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCCAGGGCTTCACTCCAGCCG‑3'，SEQ ID NO.7；

[0063] 根据重组连接的引物设计原则，设计的引物序列为融合引物，前端的“AGAGAGGCTGAAGCTGAATTC”序列是pPIC ZaA载体与目的基因在EcoR1酶切位点连接处的
pPIC ZaA载体上的基因序列。

[0064] R1：5'‑TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGCTTAGGGCTTGTAGTCAGCCAGAA‑3'，SEQ ID NO.8。

[0065] 其中，前端的“TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGC”序列是pPIC ZaA载体与目的基因在Not 1酶切位点连接处的pPIC ZaA载体上的基因序列。

[0066] 以青霉总DNA为模板进行扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。将该片段回收后与载体
pPIC ZaA连接转化后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

[0067] 实施例2

[0068] 葡萄糖氧化酶工程菌株的构建

[0069] (1)表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

[0070] 将表达载体pPIC ZaA进行双酶切(EcoR 1和Not 1)，同时将编码葡萄糖氧化酶的M5GOD双酶切(EcoR 1和Not 1)，切出编码成熟葡萄糖氧化酶的基因片段与表达载体pPIC 
ZaA连接，构建成酵母表达载体pPIC ZaA‑M5GOD转入到大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑选阳性
转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶
Sac1进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母X33感受态细胞，转化细胞涂布于YPD平板
上，30℃培养2‑3天，挑取在平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考
毕赤酵母表达操作手册。

[0071] 以同样的方式构建包含信号肽序列的重组表达，具体为：

[0072] 根据葡萄糖氧化酶基因序列设计合成引物F2和R1：

[0073] F2：5'‑AGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGAAGTCCATCATTCTTGCCTC‑3'，SEQ ID NO.9；

[0074] R1：5'‑TGTTCTAGAAAGCTGGCGGCCGCTTAGGGCTTGTAGTCAGCCAGAA‑3'，SEQ ID NO.8。

[0075] 以青霉总DNA为模板进行扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃保温10min。将该片段回收后与载体
pPIC ZaA连接转化后送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

[0076] (2)高葡萄糖氧化酶活性转化子的筛选

[0077] 用灭过菌的牙签从长有转化子的板上挑取单菌落，按照编号先点到平板上，将平板置于30℃培养箱中培养2天，至菌落长出。按编号从平板上挑取转化子接种于3ml BMGY培
养基中于30℃摇床培养48h，离心收集菌体，加入1ml含有1％甲醇的BMMY诱导培养基，继续
30℃诱导培养，48h后取样检测各菌株上清液的酶活性，从中筛选出高葡萄糖氧化酶活性的
转化子。

[0078] 实施例3

[0079] 重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的发酵

[0080] (1)重组葡萄糖氧化酶在摇瓶中大量表达

[0081] 将筛选出的酶活较高的转化子接种于300ml BMGY液体培养基中，30℃200rpm振荡培养48h，进行菌体富集；4000×g离心5min，轻柔弃上清，将菌体转接到100ml含有1％甲醇
的BMMY液体培养基中，30℃200rpm诱导培养72h。诱导培养期间，每间隔24h补加一次甲醇溶
液，使甲醇终浓度保持在1％左右，10000×g离心10min收集上清。测定葡萄糖氧化酶的活
力，重组葡萄糖氧化酶的表达量为15U/ml。

[0082] (2)重组葡萄糖氧化酶的纯化

[0083] 收集摇瓶表达的重组葡萄糖氧化酶上清液，首先利用10kDa膜包进行脱盐和浓缩，再经阴离子交换柱层析纯化。以达到电泳纯的收集液作为表达酶学性质研究的样品。利用
考马斯亮蓝法测定纯化后酶液的蛋白质含量,计算得到酶蛋白的比活力。

[0084] 实施例4

[0085] 重组葡萄糖氧化酶的部分性质分析

[0086] (1)葡萄糖氧化酶M5GOD的最适pH及pH稳定性

[0087] 经纯化的实施例3葡萄糖氧化酶样品在不同pH值下测定酶活以确定其最适pH。配制不同pH值所用缓冲液：pH 1.0‑3.0的甘氨酸‑盐酸缓冲液；pH4.0‑6.0的乙酸‑乙酸钠系列
缓冲液及pH7.0‑9.0的Tris‑盐酸系列缓冲液，纯化的葡萄糖氧化酶在不同的缓冲体系。

[0088] 重组葡萄糖氧化酶的酶活力检测方法

[0089] 采用4‑氨基安替吡啉分光光度法对本发明的葡萄糖氧化酶进行酶活测定。在有氧条件下，催化葡萄糖脱氢产生的过氧化氢与无色的还原型4‑氨基安替吡啉和苯酚在辣根过
氧化物酶的作用下，生成红色的醌亚胺，在500nm下有最大的光吸收。将粗酶液直接用缓冲
液稀释至约10U/ml。取4支150*15的试管，加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml 
4‑氨基安替吡啉、0.1ml辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水，作
为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作，向样品管中加入0.1ml样品溶液，此时
开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取30sec时吸光度值为A0，
再反应1min后，读取吸光度值A1，得出ΔA500＝A1‑A0。

[0090] 酶活计算公式：

[0091] 试样中酶活力X1(U/mL或U/g)按照如下公式计算：

[0092] X1＝ΔA500×f×B×1000/(887×t×A×d)＝33.82×ΔA500×f

[0093] 式中：

[0094] f‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑酶液稀释倍数

[0095] B‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑反应液体积(3ml)

[0096] 1000‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑消光系数单位转换系数

[0097] 887‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑消光系数(L·mol‑1·cm‑1)

[0098] t‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑反应时间(min)，即读数A1与A0之间的时间差值1min。

[0099] A‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑加入样品体积(0.1ml)

[0100] d‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑比色皿的厚度(cm)

[0101] 酶活单位定义：在pH6.0，温度30℃条件下，每分钟能将1umol的β‑D‑葡萄糖氧化生成D‑葡萄糖酸和过氧化氢的酶量，定义为1个酶活性单位(IU)。

[0102] 30℃下测定的最适pH结果(参见图1)。

[0103] 表明最适pH值为5.5，在pH值4.0‑7.0范围内，酶活力能够维持在60％以上。

[0104] 将酶液在不同pH值的缓冲液中于25℃下处理2h，在最适pH下测定酶活性以研究该酶的pH稳定性。分析结果表明(参见图2)pH值2.0‑5.0之间基本稳定，能够维持80％以上的
酶活力。经pH6.0和7.0和处理后酶活力也能分别保持60％左右，说明该酶具有较良好的pH
稳定性。

[0105] (2)葡萄糖氧化酶M5GOD的最适温度及热稳定性

[0106] 在pH值6.0条件下，测定不同温度5‑70℃下已纯化葡萄糖氧化酶样品的酶活力。分析实验结果表明，该酶的最适反应温度为30℃，在20‑50℃之间依然具有60％以上的酶活力
(参见图3)。

[0107] 热稳定性测定为葡萄糖氧化酶样品在不同温度40℃、45℃、50℃、55℃下处理5min后，在30℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明(参见图4)该葡萄糖氧化酶在55℃下处理
后已基本失去酶活力。

[0108] 实施例5

[0109] 重组葡萄糖氧化酶的保鲜应用实验

[0110] 步骤1，选用鲜活草鱼致死后，去头去尾去内脏去骨去鱼鳞去皮，用无菌水清洗；

[0111] 步骤2，用经过煮沸消毒的刀具进行鱼肉分割，分割成长、宽、厚几乎均匀一致，随机分为4组。

[0112] 步骤3，将干净鱼肉在实施例3制备的葡萄糖氧化酶和葡萄糖的混合液中浸渍一段时间；葡萄糖氧化酶溶液酶活为1U/ml，葡萄糖为4％，鱼∶保鲜剂＝1∶1(kg/L)，浸渍时间为
10min。

[0113] 步骤4，取出于筛绢上室温沥干；

[0114] 步骤5，分装到聚乙烯无菌保鲜袋中，4℃冷藏保存。

[0115] 实施例7

[0116] 本发明重组葡萄糖氧化酶在草鱼冷藏保鲜中，对草鱼品质的影响：

[0117] 按照实施例6，对草鱼进行保藏，第0，2，4，6，8，10d取出，测定菌落总数，挥发性盐基氮含量，结果(参见图5和图6)表明在冷藏时间内，经本发明葡萄糖氧化酶处理的草鱼的
菌落总数和挥发性盐基氮含量都明显低于空白对照组。并对保鲜效果进行感官评价。结果
见表1。

[0118] 表1

[0119]

[0120]

[0121] 综上所述，本发明葡萄糖氧化酶在低温条件下催化效率高，可有效用于水产品低温保鲜。在水产品保鲜中应用时，水产品通过在低温葡萄糖氧化酶溶液中浸渍，能够在后续
保鲜过程中除氧，产生H2O2抑制微生物的繁殖，有效抑制变质，保持组织弹性。说明本发明低
温葡萄糖氧化酶在水产品保鲜中有潜在应用价值。

[0122] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

[0123] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的
一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明
将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一
致的最宽的范围。