分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗凤果花叶病毒(Pepino mosaic virus，PepMV)单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用。以提纯的PepMV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术获得1株能分泌抗PepMV单抗的杂交瘤细胞株23D11，其保藏号为CGMCC No.18845。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10‑8，抗体类型及亚类为IgG1、κ轻链，该单抗与PepMV有特异性免疫反应，而不与同属的马铃薯X病毒反应，也不与番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。利用23D11单抗建立多种检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/mL)。该细胞株的创制及该病毒血清学检测方法的建立为PepMV的检测诊断、流行病学调查及科学防控提供物质和技术支撑。

权利要求

1.一种分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株23D11，其特征在于能分泌抗凤果花叶病毒单抗，所述的杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18845。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株23D11分泌的抗凤果花叶病毒单抗，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、κ轻链，该单克隆抗体与凤果花叶病毒27kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PepMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释，单位为重量/体积，g/mL；

所述的单抗能与凤果花叶病毒有特异性免疫反应，而不与同属的马铃薯X病毒反应，也不与番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。

3.一种如权利要求2所述的抗凤果花叶病毒单抗在该病毒检测上的应用，其特征在于以抗凤果花叶病毒单抗为核心建立各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

说明书

分泌抗凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗凤果花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

[0002] 凤果花叶病毒(Pepino mosaic virus，PepMV)属于弯曲病毒科 (Flexiviridae)马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员，基因组为正义单链RNA。PepMV的基因组包含五个开放阅读框，分别表达5个蛋白，第一个阅读框编码1个164kDa的RNA聚合酶，中间3个阅读框分别编码26、14和9kDa蛋白组成三基因盒，参与病毒的胞间移动，最后一个阅读框编码一个27kDa的外壳蛋白。2000年该病毒首次在荷兰番茄上发现，如今已经是全球温室番茄作物的主要病毒病害。

[0003] PepMV可侵染多种茄科植物，尤其在番茄上引起严重危害，症状包括果实变色开裂，叶片花叶斑驳和坏死。PepMV症状的严重程度取决于环境条件，以及病毒分离物的特性。研究表明来自同一基因型的分离株之间的微小核苷酸序列差异就可增强病毒的侵袭能力和加重症状。该病毒一旦传入极易扩散流行，目前我国防止该病毒病的入侵主要策略是加强该病毒的口岸检验检疫。

[0004] 为了强化我国PepMV的检验检疫技术，急需建立检测PepMV 简单快速、经济有效、高通量的实用检测技术。与常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。本发明以纯化的PepMV病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌 PepMV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测 PepMV的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国PepMV的口岸检验检疫、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控建立等提供物质和技术支持。

发明内容

[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗凤果花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

[0006] 分泌抗凤果花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株23D11，它能分泌抗凤果花叶病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No.18845。

[0007] 一种所述的杂交瘤细胞分泌的抗凤果花叶病毒单克隆抗体，抗凤果花叶病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、κ轻链，与凤果花叶病毒27kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染 PepMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480 倍稀释(w/v,g/mL)。

[0008] 抗凤果花叶病毒单克隆抗体能与凤果花叶病毒有特异性免疫反应，而不与同属的马铃薯X病毒反应，也不与番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。

[0009] 抗凤果花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

[0010] 本发明与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株分泌大量抗PepMV特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的 ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA血清学检测方法及其检测试剂盒能快递、特异、灵敏、准确地检测PepMV；2)利用本发明所制备的单克隆抗体检测PepMV病毒，对操作人员的技术要求低，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本发明所制备的单克隆抗体可有效地用于田间PepMV的检测诊断及口岸检验检疫，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。

附图说明

[0011] 图1dot-ELISA方法检测PepMV的灵敏度分析；

[0012] 图2ACP-ELISA(A)、dot-ELISA(B)和Tissue print-ELISA(C) 和RT-PCR(D)检测口岸番茄样品中PepMV结果。2D图中的M代表1kb的DNA Marker。

[0013] 生物保藏

[0014] 分泌凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.18845。

具体实施方式

[0015] 分泌凤果花叶病毒单抗杂交瘤细胞株23D11于2019年11月4 日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18845，它能分泌抗凤果花叶病毒的单抗。

[0016] 一种所述的杂交瘤细胞分泌抗凤果花叶病毒单克隆抗体，抗凤果花叶病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为 IgG1、κ轻链，与凤果花叶病毒27kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染PepMV 番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释 (w/v,g/mL)。

[0017] 抗凤果花叶病毒单克隆抗体能与凤果花叶病毒有特异性免疫反应，而不与同属的马铃薯X病毒反应，也不与番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄黑环病毒和健康植物组织发生免疫反应。

[0018] 抗凤果花叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。

[0019] 本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗凤果花叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、灵敏度高、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立检测PepMV的高通量的血清学方法可应用于口岸检验检疫及田间植物样品中PepMV的检测诊断，从而为我国PepMV的口岸检验检疫及田间样品检测诊断和该病毒病害的科学防控提供物质和技术支持。

[0020] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

[0021] 一、杂交瘤细胞创制及其单克隆抗体的制备

[0022] 1.免疫原及检测抗原的制备

[0023] 用以下操作步骤提纯病毒粒子：

[0024] 1)将组织匀浆器在冰上预冷；

[0025] 2)称取感染PepMV的番茄病叶组织200g，加入400mL 0.5M磷酸盐缓冲液即PB缓冲液(含0.01M Na-EDTA和0.1％巯基乙醇，pH 7.5)，在组织匀浆器中匀浆5-10min使番茄植物组织充分匀浆，用双层棉纱布过滤匀浆液，滤液6000rpm离心20min去除植物残渣；

[0026] 3)所得的上清液在搅拌中加至终浓度为2.5％Triton X-100、4％PEG (分子量为6000)和0.1M NaCl，然后4℃搅拌4h以上；

[0027] 4)11000rpm离心15min后去上清；

[0028] 5)用pH 7.5的0.5M PB(含0.01M MgCl2和0.5M脲)将沉淀充分悬浮，6 000rpm离心15min后将上清收集于烧杯中于4℃放置，沉淀再悬浮、离心，重复3次；

[0029] 6)将上述离心上清液合并，33000rpm超速离心100min；

[0030] 7)所得沉淀用PB悬浮后8000rpm离心15min，收集上清液，沉淀再悬浮、离心，重复3次；

[0031] 8)将合并上清液加到超离管中，用注射器针头吸取30％蔗糖加到超离管的底部形成蔗糖垫，33000rpm超速离心100min；

[0032] 9)所得沉淀用适量的0.01M PB(含0.01M MgCl2，pH 7.5)悬浮，33 000rpm超速离心100min，去除蔗糖垫；

[0033] 10)所得沉淀用0.01M PB悬浮，所得悬浮液即为病毒提纯液；

[0034] 11)病毒提纯液经3％磷钨酸(pH 6.7)负染后，置于JEOL JEM-1200EX 电镜下观察发现大量高纯度的PepMV粒子。

[0035] 2.免疫动物

[0036] 用提纯的PepMV病毒粒子免疫8周龄BALB/c雌性小鼠： PepMV病毒粒子100μL/只与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后经腹腔加皮下注射200μL每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射200μL每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

[0037] 3.细胞融合

[0038] 取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按9:1的比例在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min 后去除培养基，含有细胞的离心管在37℃水浴中加入1mL 50％PEG (分子量1500)融合剂，融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，吸去上清后沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞板中，于37℃
5％CO2的细胞培养箱中培养。

[0039] 4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及细胞克隆

[0040] 细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底15％以上时，以感染PepMV 的番茄病叶粗提液为包被抗原用间接ELISA方法筛选阳性孔，共获 580个阳性孔。对580孔进行特异性分析，筛选出30个特异性好的细胞孔并进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌PepMV高度特异和灵敏单抗的杂交瘤细胞株23D11，即前述保藏号为CGMCC No. 18845的杂交瘤细胞。经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

[0041] 5.单克隆抗体腹水制备及纯化

[0042] 取14周龄左右BALB/c雄性小鼠，腹腔注射0.3-0.5mL降植烷， 7-10天后腹腔注入约7×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，用针头采取腹水，8000rpm离心3min，收集上清液即为单抗腹水。

[0043] 取1倍体积腹水加2倍体积0.85％生理盐水稀释，室温下边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液(pH 7.0)，4℃过夜，12,000rpm离心10min， 2mL 0.85％生理盐水悬浮沉淀，在4℃0.85％生理盐水中透析24h 后即获纯化的单抗，-80℃保存。

[0044] 6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

[0045] 将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1、 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果分析23D11 单抗亚类为IgG1、κ轻链。以提纯的病毒粒子为-8抗原，用间接ELISA 方法检测单抗腹水效价，分析结果表明单抗腹水效价达10 。

[0046] 7.单克隆抗体的特异性检测

[0047] 用感染马铃薯X病毒(PVX)、番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、番茄黄化曲叶病毒 (TYLCV)、番茄黑环病毒(TBRV)的病叶粗提液包被ELISA板，以番茄健康叶片粗提液为阴性对照，感染PepMV的番茄病叶粗提液为阳性对照，用ACP-ELISA方法分析单抗的特异性。ACP-ELISA方法的步骤：上述病毒感染的病叶和健康叶片分别在研钵中研磨，按 1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液匀浆，5000rpm离心3min 后上清100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2h；PBST洗涤3 次后用3％的脱脂奶粉封闭30-60min；加入1:5000倍稀释的单抗 100μL/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤3次后加:1:8000倍稀释的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100μL/孔，37℃孵育1-2h；
PBST洗涤4次后用PNPP底物显色30-60min，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，与阴性OD值比值大于3.0的样品为阳性。结果发现，23D11单抗对PepMV有强阳性免疫反应，而与感染PVX、ToMMV、ToMV、TSWV、TYLCV、TBRV 的病叶和健康番茄植物组织粗提液均无任何免疫反应。

[0048] 二、检测PepMV血清学方法的建立

[0049] 1检测PepMV的ACP-ELISA检测方法

[0050] 1.1ACP-ELISA方法的步骤：

[0051] 1)叶片在研钵中研磨后按1:20比例(w/v,g/mL)加入ELISA包被液继续匀浆3min，5000rpm离心3min后上清100μL/孔包被ELISA 板，以感染PepMV的番茄叶片组织作为阳性对照，以健康番茄叶片组织作阴性对照，4℃包被过夜或37℃包被2h；

[0052] 2)用PBST洗ELISA板3次，每次3min，之后每孔加入250μL封闭液(含3％脱脂奶的PBS)，37℃封闭0.5-1h；

[0053] 3)弃ELISA板中封闭液，PBST洗涤3次后，用封闭液适当稀释的单抗腹水100μL/孔，37℃孵育1-2h；

[0054] 4)弃ELISA板中单抗稀释液，PBST洗涤3次后加入适当稀释的AP 标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma)100μL/孔，37℃反应1-2h；

[0055] 5)PBST洗涤4次，每次3min。加PNPP底物于室温显色30-60min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或2M氢氧化钠终止反应后用Bio-Rad 680酶标仪测OD405，以P/N>3.0作为阳性判断标准。 1.2检测PepMV ACP-ELISA方法的建立

[0056] 采用方阵试验确定ACP-ELISA方法中抗体的最适工作浓度，即用 1:20倍稀释的(w/v,g/mL)PepMV病叶粗提液作为抗原包被ELISA 板；ELISA版横向每列分别加入1:1000-1:512000倍比稀释的PepMV 单抗并反应1h，PBST洗涤后ELISA板纵向每行分别加入 1:
1000-1:512000倍比稀释的AP标记的羊抗鼠IgG二抗，健康番茄植物稀释粗提液作为阴性对照，每个处理设3次重复，确定ACP-ELISA 中抗体的最适工作浓度。结果显示23D11单抗以1:
8000倍稀释和AP 标记的羊抗鼠IgG二抗以1:9000倍稀释为最适工作浓度，根据最适工作浓度建立检测PepMV的ACP-ELISA方法。

[0057] 1.3ACP-ELISA方法及PepMV单抗的特异性和灵敏度

[0058] 以感染PepMV的番茄病叶和健康番茄叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，取感染PVX烟草病叶、感染ToMMV、ToMV、 TSWV、TYLCV或TBRV番茄病叶和健康番茄叶片粗提液作为检测样品，加到ELISA板中，重复实验三次，分析PepMV单抗及建立的 ACP-ELISA方法的特异性。在最适抗体工作浓度下，该方法检测感染PepMV的番茄病叶均呈强阳性反应，而检测感染PVX、ToMMV、 ToMV、TSWV、TYLCV或TBRV番茄病叶和健康番茄叶片粗提液呈阴性反应，且与阳性样品的OD值差异极显著，说明该方法和单抗的特异性好。

[0059] 将感染PepMV的番茄病叶和健康番茄叶片分别用PBS缓冲液从 1:10倍至1:81,920倍(w/v,g/mL)倍比稀释，倍比稀释的粗提液依次加到ELISA板，分析ACP-ELISA方法检测感染PepMV病叶的灵敏度，实验重复三次。结果表明，ACP-ELISA检测病叶的灵敏度达到 1:40,960倍稀释(w/v,g/mL)，说明制备的单抗和建立的方法具有很好的灵敏度。

[0060] 2dot-ELISA检测方法的建立及口岸样品检测

[0061] 2.1dot-ELISA方法的检测步骤

[0062] 1)在研钵中研磨番茄植物组织，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.01M PBS缓冲液匀浆，5000rpm离心3min，上清即为植物组织粗提液；

[0063] 2)点样：取2-3μL粗提液点到硝酸纤维素(NC)膜上，同时设置健康和感染PepMV的番茄叶片粗提液分别作为阴性和阳性对照，37℃恒温箱烘干10min；

[0064] 3)NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01 M PBS)封闭液中室温封闭30min；然后，NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育1h；

[0065] 5)洗膜：用PBST洗膜3次，每次3min；

[0066] 6)NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育1h 后洗膜4-5次，每次3min；

[0067] 7)显色：66μL NBT和33μL BCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)混匀，用吸水纸把膜吸干，膜放入底物液中反应，室温避光显色15-20min。肉眼观察结果，当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变化时膜在自来水中漂洗终止反应，拍照并记录结果。

[0068] 2.2检测PepMV dot-ELISA方法的建立

[0069] 从1:1000倍开始分别进行倍比稀释PepMV单克隆抗体和AP标记的羊抗鼠IgG二抗，用方阵实验确定dot-ELISA方法中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。实验结果表明，单抗和酶标二抗的最适工作浓度分别为1:8000和1:8000倍稀释，以上述抗体的最适工作浓度建立检测植物中PepMV的dot-ELISA方法。

[0070] 2.3dot-ELISA方法检测PepMV的特异性和灵敏度

[0071] 以感染PepMV的番茄病叶和健康番茄叶片组织粗提液分别为阳性对照和阴性对照，以感染TSWV、TYLCV、TBRV、PVX、ToMMV 或ToMV番茄病叶以及健康番茄叶片作为检测样品，进行dot-ELISA 方法的特异性分析。该方法检测感染PepMV的番茄病叶粗提液呈强阳性反应，而检测感染TSWV、TYLCV、TBRV、PVX、ToMMV、 ToMV植物病叶以及健康番茄叶片粗提液均呈阴性反应，说明该方法和单抗的特异性非常的好。

[0072] 取感染PepMV的番茄病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS从 1:10至1:40960倍倍比稀释(w/v,g/mL)，同样对健康番茄叶片粗提液作相同处理。用dot-ELISA方法检测感染PepMV番茄病叶的灵敏度。灵敏度分析表明，当PepMV病叶粗提液稀释到1:20480倍(w/v, g/mL)时，用建立的dot-ELISA检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:20480倍稀释(图1)。

[0073] 3.检测PepMV的Tissue print-ELISA方法的建立

[0074] 3.1Tissue print-ELISA操作步骤:

[0075] 1)样品准备：取番茄茎秆，用刀片切一个横断面；

[0076] 2)点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PepMV植物组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

[0077] 3)封闭：NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％ Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭1h；

[0078] 4)一抗孵育：NC膜放入适当稀释的PepMV单抗中室温孵育1h；

[0079] 5)二抗孵育：用PBST洗膜3次后NC膜放入适当稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG中室温孵育1h；

[0080] 6)PBST洗膜4-5次，每次3min；

[0081] 7)加底物显色：10ml显色缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、 0.025M MgCl、pH 9.5)中加入66μl NBT和33μl BCIP底物(Promega)混匀，将膜浸入显色液中进行显色反应，直至阳性显色明显、阴性对照未显色时将膜在去离子水中漂洗终止反应，记录显色结果。

[0082] 3.2Tissue print-ELISA最适抗体工作浓度的确定

[0083] 通过常规方阵实验确定Tissue print-ELISA中单抗和酶标二抗的最适工作浓度。选择检测灵敏度和特异性最高时一抗、酶标二抗稀释度组合为Tissue print-ELISA的最适工作浓度。结果发现单抗23D11 和AP标记的羊抗鼠二抗分别稀释1:7,000和1:9,000倍时Tissue print-ELISA方法的检测灵敏度和特异性最佳，根据抗体最适工作浓度建立Tissue print-ELISA方法。

[0084] 4.建立的血清学方法的口岸检验检疫应用

[0085] 用建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法对 2019年来自口岸一批共25个番茄样品进行PepMV检测，发现其中有7个样品产生阳性反应(图2A-2C)。样品同时用RT-PCR方法进行分析，结果表明所有血清学方法检测阳性样品中均扩增到PepMV 特异性的基因片段，而所有血清学检测阴性的样品中均未扩增到特异性基因片段(图2D)，PCR产物核酸测序及序列比对分析表明， RT-PCR阳性样品确实感染PepMV，表明3种血清学方法的检测结果与RT-PCR完全一致。说明ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA方法能准确、可靠地用于植物中PepMV的检测。

[0086] 5.凤果花叶病毒dot-ELISA检测试剂盒

[0087] 1)试剂盒主要成分：

[0088]

[0089] 以上试剂均保存于4℃

[0090] 硝酸纤维素膜(NC)10张

[0091] 脱脂奶粉30g

[0092] 10X PBST 1瓶 100mL

[0093] 底物缓冲液 1瓶 100mL

[0094] 2)检测番茄样品的操作步骤：

[0095] a.番茄植物组织称重、在研钵中研磨，按1:20-50比例(w/v,g/mL) 加入0.01M PBS(pH7.4)后匀浆；

[0096] b.匀浆液5,000rpm离心3min；

[0097] c.取2.5μL上清点样于NC膜上，同时设置健康和感染PepMV的番茄组织分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min；

[0098] d.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

[0099] e.NC膜放入1:5,000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

[0100] f.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:8,000稀释的AP 酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

[0101] g.PBST洗膜4-5次，每次3min；

[0102] h.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl2、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

[0103] 3)保存及有效期：

[0104] 于2-8℃避光保存，有效期12个月。

[0105] 4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)配方：

[0106]

[0107] 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL

[0108] 6.凤果花叶病毒Tissue print-ELISA检测试剂盒

[0109] 1)试剂盒主要成分：

[0110]

[0111] 以上试剂均保存于4℃

[0112] 硝酸纤维素膜(NC)10张

[0113] 脱脂奶粉30g

[0114] 10X PBST 1瓶 100mL

[0115] 底物缓冲液 1瓶 100mL

[0116] 2)检测番茄样品的操作步骤：

[0117] a.样品准备：取番茄的叶片或茎，将嫩叶卷成圆筒状用刀片切一个横断面，嫩茎直接切成横断面；

[0118] b.点样：将横断面在NC膜上按压3sec，同时将健康和感染PepMV 组织分别作为阴性和阳性对照，37℃烘箱干燥5min；

[0119] c.NC膜浸入到含5％脱脂奶粉的PBST(含0.05％Tween-20的0.01M PBS)封闭液中室温封闭30min；

[0120] d.NC膜放入1:5,000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

[0121] e.用PBST洗膜3-4次，每次3min；NC膜放入1:8,000稀释的AP 酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30-60min；

[0122] f.PBST洗膜4-5次，每次3min；

[0123] g.66μL NBT和33μL BCIP底物加入到10mL底物缓冲液(0.1M Tris Cl、0.1M NaCl、0.025M MgCl、pH9.5)中，混匀后膜放入底物液中显色，肉眼观察结果，待阳性对照显明显紫色而阴性对照没有任何显色时自来水漂洗膜终止反应，拍照记录结果。

[0124] 3)保存及有效期：

[0125] 于2-8℃避光保存，有效期12个月。

[0126] 4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)配方：

[0127]

[0128] 加蒸馏水950mL溶解后调pH至7.4，定容至1,000mL。