阿霉素-甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备方法及其应用转让专利
申请号 : CN201911181097.X
文献号 : CN110917360B
文献日 : 2021-04-27
发明人 : 郑化 , 刘灿 , 李单 , 宋亚静 , 陈钢
申请人 : 武汉理工大学
摘要 :
本发明涉及到一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备方法及其应用。其制备为：首先合成得到2‑(吡啶基二硫代)‑乙胺盐酸盐；然后将对羟基苯甲醛接枝到透明质酸中的羧基上；再将2‑(吡啶基二硫代)‑乙胺盐酸盐继续接枝到透明质酸的羧基上；接着与阿霉素的氨基反应形成亚胺键；然后与甲氨喋呤一起溶于甲酰胺，滴加到蒸馏水中来包裹甲氨喋呤，最后在二硫苏糖醇催化下交联得到阿霉素‑甲氨喋呤联合给药纳米传递系统。制备过程相对简洁且易于控制，实现了阿霉素和甲氨喋呤的联合给药，具有pH/GSH双敏感特性，提高药物的被动靶向性，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用，在抗肿瘤药物控制释放领域有广阔的应用前景。
权利要求 :
1.一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)氮气保护下，以甲醇为溶剂，巯基乙胺盐酸盐与2,2‑二硫二吡啶在冰醋酸催化下反应，后处理得到产物PDA·HCl，其反应式为：(2)氮气保护下，以1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐/N‑羟基琥珀酰亚胺为组合催化剂，以甲酰胺为溶剂，对羟基苯甲醛的羟基与透明质酸的羧基发生酯化反应，透析、冷冻、干燥得到产物HA‑CHO，其反应式为：(3)氮气保护下，以1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐/N‑羟基琥珀酰亚胺为组合催化剂，以甲酰胺为溶剂，步骤(2)所得产物HA‑CHO的羧基与步骤(1)所得产物PDA·HCl的氨基发生酰胺化反应，透析、冷冻、干燥得到产物PDA‑HA‑CHO，其反应式为：(4)氮气保护下，以三乙胺为催化剂，以甲酰胺为溶剂，步骤(3)所得产物PDA‑HA‑CHO的醛基与阿霉素的氨基避光反应形成亚胺键，透析、冷冻、干燥得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX，其化学反应式为：
(5)将步骤(4)所得产物PDA‑HA‑imine‑DOX和甲氨喋呤溶于甲酰胺，逐滴滴入转速范围在1800‑2000rpm搅拌的蒸馏水中，室温搅拌过夜，透析、离心、冷冻、干燥得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX；
(6)将步骤(5)所得产物PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX在二硫苏糖醇催化作用下搅拌过夜进行交联反应，然后透析、离心、冷冻、干燥得到纳米粒，即为阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中透明质酸的分子量为
5300～34800Da。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中巯基乙胺盐酸盐与2,2‑二硫二吡啶的摩尔比为1:2；
所述步骤(2)中透明质酸、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～2:1～2，透明质酸和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:2～10；
所述步骤(3)中HA‑CHO、1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～2:1～2，HA‑CHO和PDA·HCl的摩尔比为1:1～2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2～4，PDA‑HA‑CHO与阿霉素的摩尔比为1:1～2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中PDA‑HA‑imine‑DOX与甲氨喋呤的摩尔比为1:0.5～4。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX与二硫苏糖醇的摩尔比为3～5:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体为：2,2‑二硫二吡啶的甲醇溶液中加入冰醋酸，然后与巯基乙胺盐酸盐的甲醇溶液混合，30‑35℃氮气保护下反应36～48h，减压浓缩得到黄色的油状物，加入乙醚得到沉淀，所得沉淀再用甲醇溶解，重复至无油相物质，真空干燥得到白色粉末，即为PDA·HCl；
步骤(2)具体为：将透明质酸溶于甲酰胺中，搅拌下加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，反应0.5～1h后加入N‑羟基琥珀酰亚胺，继续反应0.5～1h，然后与对羟基苯甲醛的甲酰胺溶液混合，30‑35℃下搅拌反应36～48h后经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥得产物HA‑CHO；
步骤(3)具体为：将HA‑CHO溶于甲酰胺中，搅拌条件下加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，反应0.5～1h后加入N‑羟基琥珀酰亚胺，继续反应0.5～1h，然后与PDA·HCl的甲酰胺溶液混合，加三乙胺调节pH至8‑9，30‑35℃下搅拌反应36～48h后经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥得产物PDA‑HA‑CHO。
8.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体为：将三乙胺和阿霉素溶于甲酰胺中避光30～35℃反应3～4h，然后与PDA‑HA‑CHO的甲酰胺溶液混合，30‑35℃氮气条件下搅拌反应36～48h，经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
9.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)具体为：将PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX溶于蒸馏水中，得到高分子前药溶液，加催化剂二硫苏糖醇，室温搅拌过夜，经蒸馏水透析、离心、冷冻、干燥得到产物交联PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
10.一种权利要求1‑9任一项所述的制备方法制备得到的阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统在制备抗癌药物方面的应用，其特征在于，所述抗癌药物中同时包含阿霉素和甲氨喋呤，并能够控制释放和靶向传递。
说明书 :
阿霉素‑甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备方法及其
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及纳米生物医药技术领域，具体是一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备方法及其应用。
背景技术
[0002] 在全球女性中乳腺癌是第二大致命的癌症类型，早期无典型症状，易被忽视，加上现代生活节奏快、工作压力大、饮食不规律，疾病便不请自来。当乳房中出现肿块、非经期疼
痛、乳头溢液，皮肤出现“橘皮样”，就应该向专业医疗机构检查。然而，在大多数乳腺癌病例
中，手术切除癌组织是必要的，但由于残留恶性细胞，复发和转移的风险很大。因此，乳腺癌
的新治疗方式的需求正在扩大。
痛、乳头溢液，皮肤出现“橘皮样”，就应该向专业医疗机构检查。然而，在大多数乳腺癌病例
中，手术切除癌组织是必要的，但由于残留恶性细胞，复发和转移的风险很大。因此，乳腺癌
的新治疗方式的需求正在扩大。
[0003] 阿霉素(DOX)俗称多柔比星、羟柔红霉素，是一种蒽环糖苷广谱抗肿瘤抗生素，被视为化疗的基石，多与其他抗癌药物联用。作为细胞周期非特异性药物，它可以嵌入DNA核
碱基之间，影响细胞中相应基因的转录。阿霉素能成功抑制多种恶性肿瘤，临床上主要用于
治疗乳腺癌、卵巢癌等。阿霉素虽然抗瘤谱广、疗效好，但是其毒副作用较大，特别是心脏毒
性大严重限制了其临床应用。
碱基之间，影响细胞中相应基因的转录。阿霉素能成功抑制多种恶性肿瘤，临床上主要用于
治疗乳腺癌、卵巢癌等。阿霉素虽然抗瘤谱广、疗效好，但是其毒副作用较大，特别是心脏毒
性大严重限制了其临床应用。
[0004] 甲氨喋呤(MTX)是叶酸拮抗型抗癌药物，主要通过抑制二氢叶酸还原酶而阻断癌细胞DNA的合成。它是细胞周期特异性药物，选择性的作用于细胞的S期，临床上主要用于急
性淋巴细胞白血病、恶性葡萄胎等，对乳腺癌、肺癌等均有一定的疗效。它具有骨髓抑制、肝
肾功能损伤等副作用。
性淋巴细胞白血病、恶性葡萄胎等，对乳腺癌、肺癌等均有一定的疗效。它具有骨髓抑制、肝
肾功能损伤等副作用。
[0005] 单药治疗的不足，其一维作用机制易使化学抗性突变的出现和肿瘤复发，已经无法满足临床的需要，特别是晚期癌症患者。近期临床研究表明，把联合化疗作为多种癌症治
疗的标准，通过适当的药物组合治疗可以促进协同作用，提高目标选择性和阻止癌症耐药
性的发展。其中纳米药物传递系统通常纳米粒介于10nm至200nm之间，显示出更有利的药代
动力学特征，与小分子药物相比：这些载药纳米粒子表现出延长的体循环寿命，持续存在药
物释放动力学，以及更好的肿瘤积累被动和主动机制，可通过纳米药物传递系统实现抗癌
药物的联合给药。
疗的标准，通过适当的药物组合治疗可以促进协同作用，提高目标选择性和阻止癌症耐药
性的发展。其中纳米药物传递系统通常纳米粒介于10nm至200nm之间，显示出更有利的药代
动力学特征，与小分子药物相比：这些载药纳米粒子表现出延长的体循环寿命，持续存在药
物释放动力学，以及更好的肿瘤积累被动和主动机制，可通过纳米药物传递系统实现抗癌
药物的联合给药。
[0006] 因此，亟需一种简单方法制备得到联合给药纳米传递系统，用于阿霉素和甲氨喋呤联合给药。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备及其应用，该纳米传递系统制备过程相对简洁且易于控制，实现了抗癌药物阿霉素和甲氨喋
呤的联合给药，且表现出pH/GSH双敏感特性，提高药物的被动靶向性，降低药物对正常组织
和细胞的毒副作用，在抗肿瘤药物控制释放领域有广阔的应用前景。
呤的联合给药，且表现出pH/GSH双敏感特性，提高药物的被动靶向性，降低药物对正常组织
和细胞的毒副作用，在抗肿瘤药物控制释放领域有广阔的应用前景。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
[0009] 提供一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统的制备方法，具体包括以下步骤：
[0010] (1)氮气保护下，以甲醇为溶剂，巯基乙胺盐酸盐与2,2‑二硫二吡啶在冰醋酸催化下反应，后处理得到产物PDA·HCl，其反应式为：
[0011]
[0012] (2)氮气保护下，以1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)为组合催化剂，以甲酰胺为溶剂，对羟基苯甲醛的羟基与透明质酸
(HA)的羧基发生酯化反应，透析、冷冻、干燥得到产物HA‑CHO，其反应式为：
(HA)的羧基发生酯化反应，透析、冷冻、干燥得到产物HA‑CHO，其反应式为：
[0013]
[0014] (3)氮气保护下，以EDC·HCl/NHS为组合催化剂，以甲酰胺为溶剂，步骤(2)所得产物HA‑CHO的羧基与步骤(1)所得产物PDA·HCl的氨基发生酰胺化反应，透析、冷冻、干燥得
到产物PDA‑HA‑CHO，其反应式为：
到产物PDA‑HA‑CHO，其反应式为：
[0015]
[0016] (4)氮气保护下，以三乙胺(TEA)为催化剂，以甲酰胺为溶剂，步骤(3)所得产物PDA‑HA‑CHO的醛基与阿霉素(DOX)的氨基避光反应形成亚胺键，透析、冷冻、干燥得到产物
PDA‑HA‑imine‑DOX，其化学反应式为：
PDA‑HA‑imine‑DOX，其化学反应式为：
[0017]
[0018] (5)将步骤(4)所得产物PDA‑HA‑imine‑DOX和甲氨喋呤溶于甲酰胺，逐滴滴入转速范围在1800‑2000rpm搅拌的蒸馏水中，室温搅拌过夜，透析、离心、冷冻、干燥得到产物PDA‑
HA‑imine‑DOX‑MTX；
HA‑imine‑DOX‑MTX；
[0019] (6)将步骤(5)所得产物PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX在二硫苏糖醇(DTT)催化作用下搅拌过夜进行交联反应，然后透析、离心、冷冻、干燥得到纳米粒(交联PDA‑HA‑imine‑DOX‑
MTX)，即为阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统。
MTX)，即为阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统。
[0020] 按上述方案，步骤(1)中巯基乙胺盐酸盐与2,2‑二硫二吡啶的摩尔比为1:2。
[0021] 按上述方案，步骤(2)中透明质酸、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:1～2:1～2，透明质酸和对羟基苯甲醛的摩尔比为1:2～10。
[0022] 按上述方案，步骤(2)中透明质酸的分子量为5300～34800Da。
[0023] 按上述方案，步骤(3)中HA‑CHO、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:1～2:1～2，HA‑CHO和PDA·HCl的投料摩尔比为1:1～2。
[0024] 按上述方案，步骤(4)中阿霉素与三乙胺的摩尔比为1:2～4，PDA‑HA‑CHO与阿霉素的摩尔比为1:1～2。
[0025] 按上述方案，步骤(5)中PDA‑HA‑imine‑DOX与甲氨喋呤的摩尔比为1:0.5～4。
[0026] 按上述方案，步骤(6)中PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX与DTT的摩尔比为3～5:1。
[0027] 按上述方案，步骤(1)具体为：2,2‑二硫二吡啶的甲醇溶液中加入冰醋酸，然后与巯基乙胺盐酸盐的甲醇溶液混合，30‑35℃氮气保护下反应36～48h，减压浓缩得到黄色的
油状物，加入乙醚得到沉淀，所得沉淀再用甲醇溶解，重复至无油相物质，真空干燥得到白
色粉末，即为PDA·HCl。
油状物，加入乙醚得到沉淀，所得沉淀再用甲醇溶解，重复至无油相物质，真空干燥得到白
色粉末，即为PDA·HCl。
[0028] 按上述方案，步骤(2)具体为：将透明质酸溶于甲酰胺中，搅拌下加入EDC·HCl，反应0.5～1h后加入NHS，继续反应0.5～1h，然后与对羟基苯甲醛的甲酰胺溶液混合，30‑35℃
下搅拌反应36～48h后经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥得产物HA‑CHO。
下搅拌反应36～48h后经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥得产物HA‑CHO。
[0029] 按上述方案，步骤(3)具体为：将HA‑CHO溶于甲酰胺中，搅拌条件下加入EDC·HCl，反应0.5～1h后加入NHS，继续反应0.5～1h，然后与PDA·HCl的甲酰胺溶液混合，加三乙胺
调节pH至8‑9，30‑35℃下搅拌反应36～48h后经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥得产物PDA‑
HA‑CHO。
调节pH至8‑9，30‑35℃下搅拌反应36～48h后经DMF和蒸馏水透析、冷冻、干燥得产物PDA‑
HA‑CHO。
[0030] 按上述方案，步骤(4)具体为：将三乙胺和阿霉素溶于甲酰胺中避光30～35℃反应3～4h，然后与PDA‑HA‑CHO的甲酰胺溶液混合，30‑35℃氮气条件下搅拌反应36～48h，经DMF
和蒸馏水透析、冷冻、干燥后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX，
和蒸馏水透析、冷冻、干燥后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX，
[0031] 按上述方案，步骤(6)具体为：将PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX溶于蒸馏水中，得到高分子前药溶液，加催化剂DTT，室温搅拌过夜，经蒸馏水透析、离心、冷冻、干燥得到产物交联
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
[0032] 本发明提供一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统在抗癌药物阿霉素和甲氨喋呤控制释放和靶向传递领域的应用。
[0033] 本发明提供一种阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统，该纳米传递系统可同时实现阿霉素和甲氨喋呤的负载，且具有pH和GSH(谷胱甘肽)双敏感特性。本发明以透明质
酸为高分子载体，在透明质酸上引入醛基和二硫键，其中醛基与阿霉素中的氨基反应形成
亚胺键，不仅偶联抗癌药物阿霉素，形成的亚胺键还具有pH敏感性，具体体现在：在正常体
循环中(pH为7.4)，可以控制阿霉素的释放，而在癌细胞环境中(pH为5.0)，阿霉素释放百分
率大大提升，从而达到靶向给药的治疗效果；而在包覆抗癌药物甲氨喋呤的时候，通过交联
过程二硫键可以固定封锁甲氨喋呤，且表现出GSH浓度敏感性，主要体现在：在正常体循环
中，GSH浓度较低时，可以封锁甲氨喋呤防止泄露产生毒副作用，而在癌细胞环境中，高GSH
浓度可以使得甲氨喋呤释放出来，从而达到靶向给药的治疗效果。
酸为高分子载体，在透明质酸上引入醛基和二硫键，其中醛基与阿霉素中的氨基反应形成
亚胺键，不仅偶联抗癌药物阿霉素，形成的亚胺键还具有pH敏感性，具体体现在：在正常体
循环中(pH为7.4)，可以控制阿霉素的释放，而在癌细胞环境中(pH为5.0)，阿霉素释放百分
率大大提升，从而达到靶向给药的治疗效果；而在包覆抗癌药物甲氨喋呤的时候，通过交联
过程二硫键可以固定封锁甲氨喋呤，且表现出GSH浓度敏感性，主要体现在：在正常体循环
中，GSH浓度较低时，可以封锁甲氨喋呤防止泄露产生毒副作用，而在癌细胞环境中，高GSH
浓度可以使得甲氨喋呤释放出来，从而达到靶向给药的治疗效果。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0035] 1.本发明可以实现抗癌药物阿霉素和甲氨喋呤的联合给药，且表现出pH/GSH双敏感特性，在正常体循环中可以控制抗癌药物的释放，循环更稳定，而达到微酸和高GSH的肿
瘤微环境时，阿霉素和甲氨喋呤会大量释放出来，提高药物的被动靶向性，提高治疗指数，
降低药物对正常组织和细胞的毒副作用，使用药更安全。
瘤微环境时，阿霉素和甲氨喋呤会大量释放出来，提高药物的被动靶向性，提高治疗指数，
降低药物对正常组织和细胞的毒副作用，使用药更安全。
[0036] 2.将细胞周期非特异性药物阿霉素和细胞周期特异性药物甲氨喋呤联用，阿霉素是广谱抗生素药物，直接作用于DNA，甲氨喋呤是叶酸拮抗药物，主要作用于细胞的S期，将
两个不同作用机制的药联用，可协同治疗乳腺癌，提高乳腺癌治疗指数。
两个不同作用机制的药联用，可协同治疗乳腺癌，提高乳腺癌治疗指数。
[0037] 3.本发明所制备的纳米传递系统的纳米粒粒径大小在140～200nm，与小分子药物相比，这些载药纳米粒子表现出延长的体循环寿命，具有EPR(高通透性和滞留)效应，能够
使药物在病灶部位富集，便于定向输送药物，增加药效，减少药物副作用。
使药物在病灶部位富集，便于定向输送药物，增加药效，减少药物副作用。
[0038] 4.制备过程相对简洁且易于控制，在抗肿瘤药物控制释放领域有广阔的应用前景。
附图说明
[0039] 图1为本发明实施例1中HA(A)，HA‑CHO(B)，PDA‑HA‑CHO(C)，PDA‑HA‑imine‑DOX(D)的红外光谱图。
[0040] 图2为本发明实施例1中HA、HA‑CHO、PDA‑HA‑CHO和PDA‑HA‑imine‑DOX的1H‑NMR。
[0041] 图3为本发明实施例1中HA、DOX、HA‑CHO和PDA‑HA‑imine‑DOX的紫外图。
[0042] 图4为本发明实施例1中制备得到的PDA‑HA‑imine‑DOX(左边)、PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX(中间)和交联后PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX(右边)的TEM图。
[0043] 图5为本发明实施例1中制备得到的PDA‑HA‑imine‑DOX、PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX和交联后PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX的粒径分布图。
[0044] 图6为本发明实施例1中制备得到的交联PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX在不同pH和GSH介质中的释药曲线图。
具体实施方式
[0045] 下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0046] 实施例1
[0047] (1)将882mg(4mmol)2,2‑二硫二吡啶溶于含有160μL冰醋酸的甲醇(4.16mL)中，注入充满氮气的茄形瓶中，然后将228mg(2mmol)巯基乙胺盐酸盐溶于1.75mL甲醇后缓慢滴加
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
[0048] (2)将100mg(0.263mmol)透明质酸(HA，MW＝5300Da)溶于5mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入100mg(0.526mmol)EDC·HCl，1h后加60.53mg(0.526mmol)NHS，常
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
[0049] (3)将450mg(1mmol)步骤(2)得到的HA‑CHO溶于10mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入382mg(2mmol)EDC·HCl，1h后加238mg(2mmol)NHS，常温下活化1h，将
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9，在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9，在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
[0050] (4)将139mg(0.24mmol)盐酸阿霉素溶于带有97μL(0.96mmol)三乙胺的甲酰胺(10mL)中，随后注入充满氮气的茄形瓶中，并在35℃下避光搅拌4h除去盐酸。随后加入溶于
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
[0051] (5)将50mg(0.011mmol)步骤(4)得到的PDA‑HA‑imine‑DOX和2.5mg(0.0055mmol)MTX溶于2mL甲酰胺，以2s/滴的速度滴入转速范围在1800‑2000rpm搅拌的10mL蒸馏水中，室
温缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
温缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
[0052] (6)将步骤(5)所得25mg PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX溶于5mL蒸馏水，加入3mg DTT，在空气中常温搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，冷冻干燥得到纳米粒(交联PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX)，即为阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统。
imine‑DOX‑MTX)，即为阿霉素和甲氨喋呤联合给药纳米传递系统。
[0053] 图1为本发明实施例1中HA(A)，HA‑CHO(B)，PDA‑HA‑CHO(C)，PDA‑HA‑imine‑DOX(D)‑1
的红外光谱图。图中显示：A为透明质酸的红外图谱图；B为HA‑CHO的红外图谱图，1737cm 是
‑1
HA‑CHO中对羟基苯甲醛上C＝O的伸缩振动吸收峰，609cm 处是苯环对位单取代峰，可以证
明对羟基苯甲醛已经接枝到透明质酸上；C为PDA‑HA‑CHO的红外图谱图，相比较B和A来说，
‑1 ‑1 ‑1
HA中原有的羰基伸缩振动峰1620cm 裂分成1690cm 和1656cm ，可以表明HA上继续接枝了
‑1
PDA·HCl；D为PDA‑HA‑imine‑DOX的红外图谱图，1210cm 是阿霉素中苯环上甲氧基伸缩振
动峰，其他峰不明显，只能推测可能接了阿霉素。
的红外光谱图。图中显示：A为透明质酸的红外图谱图；B为HA‑CHO的红外图谱图，1737cm 是
‑1
HA‑CHO中对羟基苯甲醛上C＝O的伸缩振动吸收峰，609cm 处是苯环对位单取代峰，可以证
明对羟基苯甲醛已经接枝到透明质酸上；C为PDA‑HA‑CHO的红外图谱图，相比较B和A来说，
‑1 ‑1 ‑1
HA中原有的羰基伸缩振动峰1620cm 裂分成1690cm 和1656cm ，可以表明HA上继续接枝了
‑1
PDA·HCl；D为PDA‑HA‑imine‑DOX的红外图谱图，1210cm 是阿霉素中苯环上甲氧基伸缩振
动峰，其他峰不明显，只能推测可能接了阿霉素。
[0054] 图2为本发明实施例1中HA、HA‑CHO、PDA‑HA‑CHO和PDA‑HA‑imine‑DOX的1H‑NMR。图中显示：与HA相比，HA‑CHO上增加三个化学位移值，分别是δ7.35和δ8.36和δ9.45，其中δ
7.35和δ8.36为苯环的化学位移，δ9.45为醛基的化学位移，说明HA‑CHO成功连接在HA上；与
HA‑CHO相比，PDA‑HA‑CHO的核磁上多了六个峰，各峰的归属如下：δ＝8.25、7.75、7.30和
6.99(PDA中的吡啶环上的4个氢)，4.18和3.94(PDA中的亚甲基氢)。表明PDA已成功地接枝
到了HA‑CHO上；与PDA‑HA‑CHO相比，PDA‑HA‑imine‑DOX的核磁上多了一个峰，δ＝8.41即为
反应生成的亚胺键，证明阿霉素已成功接枝到PDA‑HA‑CHO上。
7.35和δ8.36为苯环的化学位移，δ9.45为醛基的化学位移，说明HA‑CHO成功连接在HA上；与
HA‑CHO相比，PDA‑HA‑CHO的核磁上多了六个峰，各峰的归属如下：δ＝8.25、7.75、7.30和
6.99(PDA中的吡啶环上的4个氢)，4.18和3.94(PDA中的亚甲基氢)。表明PDA已成功地接枝
到了HA‑CHO上；与PDA‑HA‑CHO相比，PDA‑HA‑imine‑DOX的核磁上多了一个峰，δ＝8.41即为
反应生成的亚胺键，证明阿霉素已成功接枝到PDA‑HA‑CHO上。
[0055] 图3为本发明实施例1中HA、DOX、HA‑CHO和PDA‑HA‑imine‑DOX的紫外图。图中显示：透明质酸只在200nm附近有吸收，且在481nm附近无吸收，而阿霉素在481nm有最大吸收，
PDA‑HA‑CHO在450‑600nm之间有强吸收，表明阿霉素成功接枝到PDA‑HA‑CHO。
PDA‑HA‑CHO在450‑600nm之间有强吸收，表明阿霉素成功接枝到PDA‑HA‑CHO。
[0056] 图4和图5分别为本发明实施例1中制备得到的PDA‑HA‑imine‑DOX、PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX和交联后PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX的TEM图和粒径分布图。由图4可知，PDA‑HA‑
imine‑DOX、PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX和交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳米粒呈规则的球
形并均匀分散在水介质；由图5可知交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX与PDA‑HA‑imine‑DOX‑
MTX纳米粒相比，粒径缩小。
imine‑DOX、PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX和交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳米粒呈规则的球
形并均匀分散在水介质；由图5可知交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX与PDA‑HA‑imine‑DOX‑
MTX纳米粒相比，粒径缩小。
[0057] 图6为本发明实施例1中制备得到的交联PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX在不同pH和GSH介质中的释药曲线图。选择GSH＝10mM和pH＝5.0，GSH＝2mM和pH＝6.5，GSH＝20μM和pH＝7.4
的PBS缓冲液分别模拟肿瘤细胞内液、肿瘤细胞外基质、正常组织体液的环境，验证高分子
前药的酸敏感和氧化还原敏感性，将它们作为释放介质来考察实施例1制备得到的交联后
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳米颗粒对pH和GSH响应的体外释药行为，结果如图6所示。由图可
知，在60h之内，在pH＝5.0、GSH＝10mM(模拟肿瘤细胞内液环境)的释放介质中纳米粒中阿
霉素和甲氨喋呤的累计释放百分率为57.18％和61.02％；pH＝7.4、GSH＝20μM(模拟正常组
织体液环境)的释放介质中，交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳米粒纳米粒中阿霉素和甲
氨喋呤的累积释放百分率分别为11.61％和14.67％。即交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳
米粒在肿瘤细胞内液环境下释药速度明显高于纳米粒在正常组织体液环境中的释药速度。
说明实施例1所得纳米传递系统具有明显的pH和GSH敏感性，在微酸和高GSH的肿瘤微环境
中才会大量释放阿霉素和甲氨喋呤，可增强阿霉素和甲氨喋呤在体循环中的稳定性，降低
药物对正常细胞正常组织的毒性，提高生物利用度以及治疗指数。
的PBS缓冲液分别模拟肿瘤细胞内液、肿瘤细胞外基质、正常组织体液的环境，验证高分子
前药的酸敏感和氧化还原敏感性，将它们作为释放介质来考察实施例1制备得到的交联后
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳米颗粒对pH和GSH响应的体外释药行为，结果如图6所示。由图可
知，在60h之内，在pH＝5.0、GSH＝10mM(模拟肿瘤细胞内液环境)的释放介质中纳米粒中阿
霉素和甲氨喋呤的累计释放百分率为57.18％和61.02％；pH＝7.4、GSH＝20μM(模拟正常组
织体液环境)的释放介质中，交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳米粒纳米粒中阿霉素和甲
氨喋呤的累积释放百分率分别为11.61％和14.67％。即交联后的PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX纳
米粒在肿瘤细胞内液环境下释药速度明显高于纳米粒在正常组织体液环境中的释药速度。
说明实施例1所得纳米传递系统具有明显的pH和GSH敏感性，在微酸和高GSH的肿瘤微环境
中才会大量释放阿霉素和甲氨喋呤，可增强阿霉素和甲氨喋呤在体循环中的稳定性，降低
药物对正常细胞正常组织的毒性，提高生物利用度以及治疗指数。
[0058] 实施例2
[0059] (1)将882mg(4mmol)2,2‑二硫二吡啶溶于含有160μL冰醋酸的甲醇(4.16mL)中，注入充满氮气的茄形瓶中，然后将228mg(2mmol)巯基乙胺盐酸盐溶于1.75mL甲醇后缓慢滴加
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
[0060] (2)将100mg(0.263mmol)透明质酸(HA，MW＝5300Da)溶于5mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入100mg(0.526mmol)EDC·HCl，1h后加60.53mg(0.526mmol)NHS，常
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
[0061] (3)将450mg(1mmol)步骤(2)得到的HA‑CHO溶于10mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入382mg(2mmol)EDC·HCl，1h后加238mg(2mmol)NHS，常温下活化1h，将
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9，在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9，在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
[0062] (4)将278mg(0.48mmol)盐酸阿霉素溶于带有194μL(1.92mmol)三乙胺的甲酰胺(10mL)中，随后注入充满氮气的茄形瓶中，并在35℃下避光搅拌4h除去盐酸。随后加入溶于
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
[0063] (5)将50mg(0.011mmol)步骤(4)得到的PDA‑HA‑imine‑DOX和2.5mg(0.0055mmol)MTX溶于2mL甲酰胺，缓慢(2s/滴)滴入转速范围在1800‑2000rpm搅拌的10mL蒸馏水中，室温
缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
[0064] (6)将步骤(5)所得25mg PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX溶于5mL蒸馏水中，加入3mg DTT，在空气中常温搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，冷冻干燥即可得到最终产物交联
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
[0065] 实施例3
[0066] (1)将882mg(4mmol)2,2‑二硫二吡啶溶于含有160μL冰醋酸的甲醇(4.16mL)中，注入充满氮气的茄形瓶中，然后将228mg(2mmol)巯基乙胺盐酸盐溶于1.75mL甲醇后缓慢滴加
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
[0067] (2)将100mg(0.263mmol)透明质酸(HA，MW＝9800Da)溶于5mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入100mg(0.526mmol)EDC·HCl，1h后加60.53mg(0.526mmol)NHS，常
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
[0068] (3)将450mg(1mmol)步骤(2)得到的HA‑CHO溶于10mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入382mg(2mmol)EDC·HCl，1h后加238mg(2mmol)NHS，常温下活化1h，将
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9，在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9，在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
[0069] (4)将139mg(0.24mmol)盐酸阿霉素溶于带有97μL(0.96mmol)三乙胺的甲酰胺(10mL)中，随后注入充满氮气的茄形瓶中，并在35℃下避光搅拌4h除去盐酸。随后加入溶于
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
[0070] (5)将50mg(0.011mmol)步骤(4)得到的PDA‑HA‑imine‑DOX和2.5mg(0.0055mmol)MTX溶于2mL甲酰胺，缓慢(2s/滴)滴入转速范围在1800‑2000rpm搅拌的10mL蒸馏水中，室温
缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
[0071] (6)将步骤(5)所得25mg PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX溶于5mL蒸馏水中，加入3mg DTT，在空气中常温搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，冷冻干燥即可得到最终产物交联
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
[0072] 实施例4
[0073] (1)将882mg(4mmol)2,2‑二硫二吡啶溶于含有160μL冰醋酸的甲醇(4.16mL)中，注入充满氮气的茄形瓶中，然后将228mg(2mmol)巯基乙胺盐酸盐溶于1.75mL甲醇后缓慢滴加
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
到上述溶液中，35℃搅拌48h。反应完成后减压浓缩，得到3‑5mL黄色油状物，加20mL冷乙醚
得沉淀，然后在溶解于5mL的甲醇中，继续用20mL冷乙醚沉淀，直到无油性物质，真空干燥得
到白色粉末，即为PDA·HCl。
[0074] (2)将100mg(0.263mmol)透明质酸(HA，MW＝9800Da)溶于5mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入100mg(0.526mmol)EDC·HCl，1h后加60.53mg(0.526mmol)NHS，常
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
温下活化1h，另将318.59mg(2.63mmol)对羟基苯甲醛溶于3mL甲酰胺中，将活化好的透明质
酸滴入到对羟基苯甲醛溶液中，在氮气下35℃搅拌48h，反应结束。转移到分子量3500Da的
透析袋中，先用DMF溶液透析两天，再用蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥获得产品HA‑CHO。
[0075] (3)将450mg(1mmol)的步骤(2)得到的HA‑CHO溶于10mL的甲酰胺中，然后在上述溶液中边搅拌边加入382mg(2mmol)EDC·HCl，1h后加238mg(2mmol)NHS，常温下活化1h，将
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl的甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
222.8mg(1mmol)步骤(1)得到的PDA·HCl溶于甲酰胺(10mL)中，将活化好的HA‑CHO滴入
PDA·HCl的甲酰胺溶液中，加200μL三乙胺调节pH至8‑9在氮气下35℃反应48h，使用与步骤
(2)相同方法进行后处理，最后冷冻干燥得到PDA‑HA‑CHO。
[0076] (4)将278mg(0.48mmol)盐酸阿霉素溶于带有194μL(1.92mmol)三乙胺的甲酰胺(10mL)中，随后注入充满氮气的茄形瓶中，并在35℃下避光搅拌4h除去盐酸。随后加入溶于
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
5mL甲酰胺的100mg(0.24mmol)步骤(3)得到的PDA‑HA‑CHO，35℃下避光反应48小时。使用与
步骤(2)相同方法进行后处理，最后得到产物PDA‑HA‑imine‑DOX。
[0077] (5)将50mg(0.011mmol)步骤(4)得到的PDA‑HA‑imine‑DOX和2.5mg(0.0055mmol)MTX溶于2mL甲酰胺，缓慢(2s/滴)滴入转速范围在1800‑2000rpm搅拌的10mL蒸馏水中，室温
缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
缓慢搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，离心得上清液，冷冻干燥得到产物PDA‑HA‑
imine‑DOX‑MTX。
[0078] (6)将步骤(5)所得25mg PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX溶于5mL蒸馏水中，加入3mg DTT，在空气中常温搅拌过夜，经蒸馏水透析(MW＝3500Da)，冷冻干燥即可得到最终产物交联
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。
PDA‑HA‑imine‑DOX‑MTX。