一种植物免疫诱抗菌剂及其应用

摘要

本发明公开了一种植物免疫诱抗菌剂及其应用。该植物免疫诱抗菌剂具体可为预防和/或治疗烟草野火病的菌剂，该菌剂含有皱纹假单胞菌S58，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17043。该菌剂对烟草野火病病菌、西瓜噬酸菌、密执安棒形杆菌和稻黄单胞菌的菌剂等植物病原菌具有抑制作用。皱纹假单胞菌S58能够通过激发免疫抗性显著控制烟草野火病的发生，能够水解有机磷，可用于土壤改良。

权利要求

1.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)，所述皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)的菌株号为S58，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17043。

2.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述任一种菌剂：A3、预防烟草野火病的菌剂，

A5、水解有机磷的菌剂，

A6、抑制烟草野火病病菌的菌剂，A11、抑制西瓜噬酸菌的菌剂，A12、抑制密执安棒形杆菌密执安亚种的菌剂，A13、抑制稻黄单胞菌水稻致病变种的菌剂。

3.权利要求1所述菌剂在预防烟草野火病中的应用。

4.权利要求1所述菌剂在抑制烟草野火病病菌中的应用。

5.权利要求1所述菌剂在抑制西瓜噬酸菌中的应用。

6.权利要求1所述菌剂在抑制密执安棒形杆菌密执安亚种中的应用。

7.权利要求1所述菌剂在抑制稻黄单胞菌水稻致病变种中的应用。

8.权利要求1所述菌剂的下述任一种应用：C5、所述的菌剂在水解有机磷中的应用，C15、所述的菌剂在产生IAA中的应用，C16、所述的菌剂在抑制植物主根伸长中的应用，C17、所述的菌剂在促进植物侧根生长中的应用。

9.下述任一种应用：

U3、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)在预防烟草野火病中的应用，U5、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)在水解有机磷中的应用，U6、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)在抑制烟草野火病病菌中的应用，U11、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)在抑制西瓜噬酸菌中的应用，U12、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)在抑制密执安棒形杆菌密执安亚种中的应用，

U13、皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)在抑制稻黄单胞菌水稻致病变种中的应用；

所述皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)的菌株号为S58，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17043。

说明书

一种植物免疫诱抗菌剂及其应用

[0001] 本申请是申请号为201910911436.9、申请日为2019年09月25日、发明创造名称为“一株皱纹假单胞菌及其应用”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种植物免疫诱抗菌剂及其应用。

背景技术

[0003] 烟草是中国的一种经济植物。随着烟草生产的发展，连作面积的增加，病害发生日趋严重，已成为为害烟草生产的主要限制因素之一。烟草黑胫病和青枯病是烟草主要和常
见的土传病害，从苗期到成株都可以侵染，该类病害是烟草的毁灭性病害。近年来由于连作
烟田面积扩大以及连作年限的增长，不少地方烟草黑胫病和青枯病均有加重流行的趋势。
由于生产上缺乏理想的抗病烟草栽培品种，目前，烟草黑胫病和青枯病的防治仍依赖于化
学药剂，但效果均不太理想，且存在诸多弊端。如目前使用的化学杀菌剂对土壤微生物、植
物、水源和大气层带来污染或破坏，同时抗药性问题也日益突出，而且药物在植物体内残留
会间接对人类造成危害。因此需要开发对环境友好，对人畜无毒的微生物制剂。

[0004] 利用植株上附生的拮抗细菌来防治植物病虫害是有效途径，而筛选效果好和活性稳定的拮抗菌株则是保证生物防治获得成功的先决条件。目前主要研究的生防细菌有植物
根围促生细菌（PGPR）、生防假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）、芽孢杆菌（Bacillus spp.）
等。植物根围细菌大量存在于植物根系周围，这些细菌能够定殖在植物表层，生存环境稳
定，有些可以拮抗病原菌，有些可以诱导植物抗病性。这类微生物对人畜无毒害，对环境友
好，可开发为植物病害生防细菌资源。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何抑制烟草黑胫病，和/或如何抑制烟草青枯病，和/或如何抑制烟草野火病，和/或如何抑制植物病原真菌，和/或如何抑制植物病原细菌，
和/或如何提高植物的生物量，和/或如何改良土壤。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株皱纹假单胞菌。

[0007] 本发明所提供的皱纹假单胞菌是皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）S58，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17043。该
菌株已于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称
CGMCC）。下文简称皱纹假单胞菌S58。

[0008] 皱纹假单胞菌S58菌体形状为杆状，菌体平均大小为0.5‑1.5μm×1.6‑2.5μm，革兰氏染色为阴性，单极单或多鞭毛，无荧光特性。皱纹假单胞菌S58在NA培养基上菌落呈白色，
褶皱凸起，边缘不整齐。皱纹假单胞菌S58的生长温度范围在8‑45℃，最适宜生长温度为28‑
32℃，生长pH值在6.5‑8，最适宜pH值为7。皱纹假单胞菌S58的生理生化特征如表1所示。皱
纹假单胞菌S58具有序列表中序列1所示的16S rDNA。

[0009] 皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

[0010] U1、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在预防和/或治疗烟草黑胫病中的应用，

[0011] U2、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在预防和/或治疗烟草青枯病中的应用，

[0012] U3、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在预防和/或治疗烟草野火病中的应用，

[0013] U4、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在改良土壤中的应用，

[0014] U5、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在水解有机磷中的应用，

[0015] U6、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制烟草野火病病菌中的应用，

[0016] U7、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制烟草疫霉中的应用，

[0017] U8、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制大豆疫霉中的应用，

[0018] U9、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制立枯丝核菌中的应用，

[0019] U10、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制稻瘟病菌中的应用，

[0020] U11、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制西瓜噬酸菌中的应用，

[0021] U12、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制密执安棒形杆菌中的应用，

[0022] U13、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制稻黄单胞菌中的应用，

[0023] U14、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制青枯劳尔氏菌中的应用，

[0024] U15、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在产生植物生长素（IAA）中的应用，

[0025] U16、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在抑制植物主根伸长中的应用，

[0026] U17、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在促进植物侧根生长中的应用，

[0027] U18、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在提高植物生物量中的应用，

[0028] U19、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在产淀粉酶中的应用，

[0029] U20、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在产氨中的应用，

[0030] U21、皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物在产嗜铁素中的应用。

[0031] 为了解决以上技术问题，本发明还提供了菌剂。

[0032] 本发明所提供的菌剂含有皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物。

[0033] 所述菌剂具体可为下述任一种菌剂：

[0034] A1、预防和/或治疗烟草黑胫病的菌剂，

[0035] A2、预防和/或治疗烟草青枯病的菌剂，

[0036] A3、预防和/或治疗烟草野火病的菌剂，

[0037] A4、改良土壤的菌剂，

[0038] A5、水解有机磷的菌剂，

[0039] A6、抑制烟草野火病病菌的菌剂，

[0040] A7、抑制烟草疫霉的菌剂，

[0041] A8、抑制大豆疫霉的菌剂，

[0042] A9、抑制立枯丝核菌的菌剂，

[0043] A10、抑制稻瘟病菌的菌剂，

[0044] A11、抑制西瓜噬酸菌的菌剂，

[0045] A12、抑制密执安棒形杆菌的菌剂，

[0046] A13、抑制稻黄单胞菌的菌剂，

[0047] A14、抑制青枯劳尔氏菌的菌剂，

[0048] A15、产生植物生长素（IAA）的菌剂，

[0049] A16、抑制植物主根伸长的菌剂，

[0050] A17、促进植物侧根生长的菌剂，

[0051] A18、提高植物生物量的菌剂，

[0052] A19、产淀粉酶的菌剂，

[0053] A20、产氨的菌剂，

[0054] A21、产嗜铁素的菌剂。

[0055] 上述菌剂的活性成分可为皱纹假单胞菌S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域
技术人员可根据菌剂的效果确定。

[0056] 所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和
硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、
淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，皱纹假单胞菌
S58或/和皱纹假单胞菌S58的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物
的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、
悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

[0057] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。

[0058] 上文中，所述皱纹假单胞菌S58的代谢物可为皱纹假单胞菌S58的发酵液。皱纹假单胞菌S58的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养皱纹假单胞菌S58，收
集发酵液（含有皱纹假单胞菌S58和分泌到液体培养基内的物质），该发酵液即为皱纹假单
胞菌S58的代谢物。

[0059] 上述应用中，所述产品可为菌剂、微生态制剂或生物肥料。

[0060] 皱纹假单胞菌S58的培养物也属于本发明的保护范围。皱纹假单胞菌S58的培养物是将皱纹假单胞菌S58在微生物培养基中培养得到的物质（如含有皱纹假单胞菌S58和分泌
到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有皱纹假单胞菌S58和分泌到固体培养基内的物
质）。

[0061] 上述皱纹假单胞菌S58的培养物具有下述B1‑B21的至少一种功能：

[0062] B1、预防和/或治疗烟草黑胫病，

[0063] B2、预防和/或治疗烟草青枯病，

[0064] B3、预防和/或治疗烟草野火病，

[0065] B4、改良土壤，

[0066] B5、水解有机磷，

[0067] B6、抑制烟草野火病病菌，

[0068] B7、抑制烟草疫霉，

[0069] B8、抑制大豆疫霉，

[0070] B9、抑制立枯丝核菌，

[0071] B10、抑制稻瘟病菌，

[0072] B11、抑制西瓜噬酸菌，

[0073] B12、抑制密执安棒形杆菌，

[0074] B13、抑制稻黄单胞菌，

[0075] B14、抑制青枯劳尔氏菌，

[0076] B15、产生植物生长素（IAA），

[0077] B16、抑制植物主根伸长，

[0078] B17、促进植物侧根生长，

[0079] B18、提高植物生物量，

[0080] B19、产淀粉酶，

[0081] B20、产氨，

[0082] B21、产嗜铁素。

[0083] 上述菌剂的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

[0084] C1、所述的菌剂在预防和/或治疗烟草黑胫病中的应用，

[0085] C2、所述的菌剂在预防和/或治疗烟草青枯病中的应用，

[0086] C3、所述的菌剂在预防和/或治疗烟草野火病中的应用，

[0087] C4、所述的菌剂在改良土壤中的应用，

[0088] C5、所述的菌剂在水解有机磷中的应用，

[0089] C6、所述的菌剂在抑制烟草野火病病菌中的应用，

[0090] C7、所述的菌剂在抑制烟草疫霉中的应用，

[0091] C8、所述的菌剂在抑制大豆疫霉中的应用，

[0092] C9、所述的菌剂在抑制立枯丝核菌中的应用，

[0093] C10、所述的菌剂在抑制稻瘟病菌中的应用，

[0094] C11、所述的菌剂在抑制西瓜噬酸菌中的应用，

[0095] C12、所述的菌剂在抑制密执安棒形杆菌中的应用，

[0096] C13、所述的菌剂在抑制稻黄单胞菌中的应用，

[0097] C14、所述的菌剂在抑制青枯劳尔氏菌中的应用，

[0098] C15、所述的菌剂在产生植物生长素中的应用，

[0099] C16、所述的菌剂在抑制植物主根伸长中的应用，

[0100] C17、所述的菌剂在促进植物侧根生长中的应用，

[0101] C18、所述的菌剂在提高植物生物量中的应用，

[0102] C19、所述的菌剂在产淀粉酶中的应用，

[0103] C20、所述的菌剂在产氨中的应用，

[0104] C21、所述的菌剂在产嗜铁素中的应用。

[0105] 本申请中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为管状花目植物。所述管状花目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为烟草属植物。所述烟草属植物
可为烟草。

[0106] 本申请中，所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。

[0107] 培养所述的皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）的方法也属于本发明的保护范围。

[0108] 本发明所提供的培养所述的皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）的方法包括将所述皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）在用于培养假单胞菌的培养基中培养的步
骤。

[0109] 制备所述菌剂的方法也属于本发明的保护范围。

[0110] 本发明所提供的制备所述菌剂的方法，包括将所述皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）和/或所述皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）的代谢物作为菌剂的成分，
得到所述菌剂的步骤。

[0111] 上述方法中，所述菌剂可为液体菌剂。上述方法中，所述皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）可在发酵培养基中培养，得到发酵液，将发酵液与载体混合，得
到所述液体菌剂。所述发酵培养基的组成可为：豆饼粉1%‑2%、可溶性淀粉1%‑2%、牛肉浸膏
0.5%‑0.8%、NaCNO3 0.02%‑0.04%、CaCO3 0.1%‑0.3%，其余为水，上述百分含量均为质量百分
含量。所述载体可选自腐殖酸钠、壳聚糖和几丁质中的至少一种。所述菌剂中，所述载体的
体积含量可为0.16%‑0.6%。当所述载体由腐殖酸钠、壳聚糖和几丁质组成时，所述菌剂中，
腐殖酸钠的体积含量可为0.05%‑0.2%、壳聚糖的体积含量可为0.01%‑0.1%和几丁质的体积
含量可为0.1%‑0.3%。

[0112] 实验证明，本发明的皱纹假单胞菌S58具有稳定、高效、广谱的抗菌性能，对烟草疫霉、大豆疫霉、立枯丝核菌和稻瘟病菌等植物病原真菌和西瓜噬酸菌、密执安棒形杆菌、稻
黄单胞菌水稻致病变种和青枯劳尔氏菌等植物病原细菌具有抑制作用。皱纹假单胞菌S58
对烟草青枯病的防效达76.2%，对烟草黑胫病的防效达60.5%。皱纹假单胞菌S58能够产生嗜
铁素和淀粉酶，能够引起植物表层免疫反应细胞程序性死亡，能够通过激发免疫抗性控制
烟草野火病的发生。皱纹假单胞菌S58能够水解有机磷，可用于土壤改良。皱纹假单胞菌S58
能产生植物生长素（IAA），能够显著抑制植物主根伸长，促进侧根生长，提高植物生物量。皱
纹假单胞菌S58对人、畜安全，没有环境污染问题，培养条件简单、容易保存，适于工业化生
产。

[0113] 生物材料保藏说明。

[0114] 生物材料的分类命名：皱纹假单胞菌。

[0115] 生物材料的拉丁文学名：Pseudomonas corrugata。

[0116] 生物材料的菌株编号：S58。

[0117] 保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0118] 保藏单位简称：CGMCC。

[0119] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0120] 保藏日期：2018年12月27日。

[0121] 保藏编号：CGMCC No.17043。

附图说明

[0122] 图1为皱纹假单胞菌S58的抑菌谱。其中，A为烟草疫霉，B为立枯丝核菌，C为稻瘟病菌，D为大豆疫霉，E为西瓜噬酸菌，F为密执安棒形杆菌密执安亚种，G为稻黄单胞菌水稻致
病变种，H为青枯劳尔氏菌。

[0123] 图2为接种烟草野火病菌7天后各个处理的烟草叶片照片。

[0124] 图3为皱纹假单胞菌S58能够激发免疫相关基因的强烈表达。

[0125] 图4为接种培养10 d后的拟南芥照片。A为接种LB培养基，B为接种皱纹假单胞菌S58发酵液。

[0126] 图5为Salkowski比色法测定结果照片。上排左一为植物生长素纯品，上排左二为培养基阴性对照，上排左三为不产IAA的阴性对照，下排三个为皱纹假单胞菌S58处理的三
个重复。

[0127] 图6为皱纹假单胞菌S58在蒙金娜有机磷培养基中培养的照片。

[0128] 图7为皱纹假单胞菌S58具有显著的产氨能力的照片。上排左一为CK，上排左二和左三为未加任何物质的对照，下排三个为皱纹假单胞菌S58处理的三次重复。

[0129] 图8为皱纹假单胞菌S58能产生嗜铁素的照片。

[0130] 图9为皱纹假单胞菌S58菌株具有显著的产淀粉酶能力。

具体实施方式

[0131] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0132] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0133] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0134] 下述实施例中所用到的病原菌公众可从野外采集，也可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得，以重复本申请实验：

[0135] 烟草黑胫病病菌‑烟草疫霉（Phytophthora parasitica  var.nicotianae）（王万能, 全学军, 肖崇刚. 烟草疫霉的产孢和接种方法研究. 植物保护学报, 20005, 32(1):
18‑22），以下简称烟草疫霉。

[0136] 烟草青枯病病菌‑青枯劳尔氏菌 (Rastonia solanacearum)（魏海雷, 王烨, 张力群, 唐文华.生防菌株2P24与CPF‑10的鉴定及其生防相关性状的初步分析. 植物病理学
报, 2004, 34:80‑85），以下简称青枯劳尔氏菌。

[0137] 烟草野火病病菌‑丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）（阚光锋，张广民，房保海，刘萍. 烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）对烟草细胞内5
种防御酶系统的影响. 山东农业大学学报（自然科学版）, 2002, 33(1):28‑31），以下简称
丁香假单胞菌。

[0138] 大豆疫霉(Phytophtora sojae)（陈秋明, 肖彩霞, 孙欠欠, 文景芝. 大豆疫霉Phytophtora sojae卵孢子在黑龙江省土壤中的越冬存活率. 植物保护学报, 2015, 42
(1):72‑78），以下简称大豆疫霉。

[0139] 立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）（魏海雷, 王烨, 张力群, 唐文华.生防菌株2P24与CPF‑10的鉴定及其生防相关性状的初步分析. 植物病理学报, 2004, 34:80‑85），
以下简称立枯丝核菌。

[0140] 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)（厉晓东，卢建平，刘小红，林福呈. 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的凋亡诱导和检测. 植物病理学报. 2011, 41(4):361‑370），以下
简称稻瘟病菌。

[0141] 西瓜噬酸菌 (Acidovorax citrulli)（阚玉敏，云晓敏，李玉文，李健强，罗来鑫. Bio‑PCR方法检测葫芦科作物种子携带西瓜嗜酸菌的特异性引物筛选. 植物病理学报
.2018, 48(2): 263‑270），以下简称西瓜噬酸菌。

[0142] 密执安棒形杆菌密执安亚种（Clavibacter  michiganensis subsp.michiganensis）（夏明星，赵文军，马青，朱水芳. 番茄细菌性溃疡病菌的实时荧光
PCR检测. 植物病理学报, 2006, 6(2):152‑157），以下简称密执安棒形杆菌密执安亚种。

[0143] 稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)（杨雅云，张敦宇，陈玲，陈越，殷富有，蒋春苗，肖素勤，柯学，余腾琼，王波，付坚，钟巧芳，陈功友，程在全. 
云南药用野生稻对四种水稻主要病害的抗性鉴定. 植物病理学报. 2019, 1:101‑112），以
下简称稻黄单胞菌水稻致病变种。

[0144] 下述实施例中相关培养基的配置：

[0145] PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，用蒸馏水定容至 1000mL。

[0146] LB液体培养基：酵母提取物 5g，胰蛋白胨 10g，NaCl 10g,用蒸馏水定容至 1000mL，pH 7.0‑7.2。

[0147] LB固体培养基：酵母提取物 5g，胰蛋白胨 10g，NaCl 10g, 琼脂 15g，用蒸馏水定容至 1000mL，pH 7.0‑7.2。

[0148] 营养琼脂培养基（NA培养基）：牛肉浸膏 3g，蛋白胨 5g，葡糖糖 2.5g，琼脂15g，pH 7.0，用蒸馏水定容至 1000mL。

[0149] 营养肉汤培养基(NB培养基) ：牛肉浸膏 3g，蛋白胨 5g，葡糖糖 2.5g，pH 7.0，用蒸馏水定容至 1000mL。

[0150] CA培养基：蛋白胨 23g，玉米粉 1g，氯化钠5g，琼脂15g，pH 7.3，用蒸馏水定容至 1000mL。

[0151] 燕麦培养液：燕麦粉 60g，用蒸馏水定容至 1000mL。

[0152] 燕麦培养基：燕麦粉 60g，琼脂15g，用蒸馏水定容至 1000mL。

[0153] 实施例1、皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）S58 CGMCC No.17043的分离及鉴定

[0154] 一、皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）S58 CGMCC No.17043的分离

[0155] 皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）S58 CGMCC No.17043是从烟草根围中分离得到。烟草根围样品采自云南省玉溪市研和镇，根围土样带回实验室低温保存，取1g土样
悬浮于9ml无菌水，充分震荡后系列稀释涂于NA培养基平板，在28℃下培养48h。挑取单菌
落，重新于平板上划线纯化保存，其中长势旺盛者，定名为S58菌株，即为本申请的皱纹假单
胞菌（Pseudomonas corrugata）S58 CGMCC No.17043。

[0156] 二、皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）S58 CGMCC No.17043的鉴定

[0157] 对上述分离的S58菌株通过生物学特性和形态观察，进行种类鉴定，方法如下：

[0158] 观察菌落的形态、大小、凹凸度、边缘，革兰氏染色，生理生化特征测试具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。该菌全基因组测序委托金唯智生物科技有限公司进行。采用
美国Biolog微生物自动分析系统，以水为阴性对照，对图1的不同碳源进行了分析。

[0159] 结果表明，S58菌株菌体形状为杆状，菌体平均大小为0.5‑1.5μm×1.6‑2.5μm，革兰氏染色为阴性，单极单或多鞭毛，无荧光特性。S58菌株在NA培养基上菌落呈白色，褶皱凸
起，边缘不整齐。S58菌株的生长温度范围在8‑45℃，最适宜生长温度为28‑32℃，生长pH值
在6.5‑8，最适宜pH值为7，能在1%的NaCl溶液中生长，能在1%的乳酸钠溶液中生长。S58菌株
的生理生化特征如表1所示。对S58菌株全基因组测序，基因组全长6481050 bp，G+C含量
61.06%，无质粒存在。S58菌株具有序列表中序列1所示的16S rDNA，S58菌株16S rDNA序列
与皱纹假单胞菌属的菌株相似性达到99％。S58菌株能够利用如下碳源：D‑海藻糖，蔗糖，α‑
D‑葡萄糖，D‑甘露糖，D‑果糖，D‑半乳糖，1%乳酸钠，D‑甘露醇，醋竹桃霉素，利福霉素 SV， 
L‑丙氨酸，L‑谷氨酸，L‑焦谷氨酸，洁霉素，盐酸胍，硫酸四癸钠，果胶，D‑葡萄糖酸，粘液酸，
奎尼酸，D‑糖二酸，万古霉素，四唑紫，四唑蓝，对羟基‑苯乙酸，L‑乳酸，柠檬酸，α‑酮戊二
酸，L‑苹果酸，萘啶酮酸，亚碲酸钾，γ‑氨基丁酸，醋酸，氨曲南。S58菌株不能够利用如下碳
源：葡聚糖，D‑麦芽糖，D‑纤维二糖，龙胆二糖，D‑松二糖，水苏糖，D‑棉子糖，α‑D‑乳糖，D‑蜜
二糖，β‑甲基‑D‑葡萄糖苷，D‑水杨苷，N‑乙酰基‑D‑葡萄糖胺，N‑乙酰基‑β‑D‑甘露糖胺，N‑
乙酰基‑D‑半乳糖胺，N‑乙酰基甘露糖胺丙酮酸，3‑甲基葡萄糖，L‑岩藻糖，L‑鼠李糖，肌苷，
梭链孢酸，D‑丝氨酸，D‑山梨醇，D‑阿拉伯醇，丙三醇，D‑葡萄糖‑6‑PO4，二甲胺四环素，明
胶，甘氨酰基‑L‑脯氨酸，L‑精氨酸，L‑组氨酸，L‑丝氨酸，L‑半乳糖酸内酯，葡糖醛酰胺，D‑
乳酸甲酯，D‑羟基丁二酸，溴代琥铂酸，氯化锂，吐温‑40，α‑羟基‑丁酸，β‑羟基‑D, L‑丁酸，
α‑酮基‑丁酸，乙酰乙酸，甲酸，丁酸钠，溴酸钠。S58菌株可疑利用如下碳源：D‑岩藻糖，肌
醇，D‑果糖‑6‑PO4，D‑天冬氨酸，L‑天冬氨酸，半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸，丙酮酸甲酯，丙酸。

[0160] 通过菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性、Biolog微生物自动分析系统分析将S58菌株坚定为皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）。皱纹假单胞菌（Pseudomonas 
corrugata）S58已于2018年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中
心（简称CGMCC），其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为
CGMCC No.17043。下文简称皱纹假单胞菌S58。

[0161] 实施例2、皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）S58 CGMCC No.17043的抑菌谱的测定

[0162] 供试植物病原真菌：烟草疫霉、大豆疫霉、立枯丝核菌、稻瘟病菌。

[0163] 供试植物病原细菌：西瓜噬酸菌、密执安棒形杆菌密执安亚种、稻黄单胞菌水稻致病变种、青枯劳尔氏菌。

[0164] 采用平板对峙培养法对上述供试植物病原真菌分别进行抑菌实验。具体操作如下：将皱纹假单胞菌S58在LB固体培养基上28℃恒温培养48h。上述供试植物病原真菌分别
在PDA平板上25℃‑28℃恒温培养3‑4天，自菌落边缘用直径0.7cm的无菌不锈钢打孔器打制
带病原菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片，菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时
在距病原真菌菌片两侧均约3.00cm处用无菌接种环划线皱纹假单胞菌S58，以仅接病原菌
的平板为对照，每个处理三次重复，25℃‑28℃恒温培养5‑7天，测量病原真菌边缘与皱纹假
单胞菌S58的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。

[0165] 采用双层培养法对上述供试植物病原细菌分别进行抑菌实验。具体操作如下：将含1%琼脂的LB固体培养基（酵母提取物 5g，胰蛋白胨 10g，NaCl 10g, 琼脂 10g，用蒸馏水
8 
定容至 1000mL，pH 7.0‑7.2）融化，放于50℃保温。将活化好的靶标病原细菌制备成10
cfu/mL菌悬液，吸取1ml加入保温的含1%琼脂的LB固体培养基中，倒平板。晾干后，取10μl 
LB液体培养基活化的皱纹假单胞菌S58点种在LB培养基平板的中心处，28℃培养48h，观察
抑菌效果并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

[0166] 结果表明，当培养4‑5天时，仅接各种病原真菌的平板上菌丝近乎长满整个平板时，皱纹假单胞菌S58对烟草疫霉、大豆疫霉、立枯丝核菌、稻瘟病菌的抑菌带宽分别为
7.1mm、3.2mm、10.9mm和4.8mm，所选择的4种植物病原真菌的抑菌带宽均在3‑11mm之间，具
有较强的抑制真菌的效果。皱纹假单胞菌S58对西瓜噬酸菌、密执安棒形杆菌密执安亚种、
稻黄单胞菌水稻致病变种、青枯劳尔氏菌的抑菌圈直径分别为35.5mm、56.6 mm、63.7 mm和
24.7mm（图1）。多次重复该试验均得到同样的稳定抑菌效果，因此表明皱纹假单胞菌S58具
有稳定、高效、广谱的抗菌性能。

[0167] 实施例3、含有皱纹假单胞菌S58的菌剂对烟草青枯病的防治实验

[0168] 1、病原接种体的制备：将烟草青枯病菌—青枯劳尔氏菌划线接种于NA培养基上，28℃倒置培养3d，备用。

[0169] 2、含有皱纹假单胞菌S58的液体菌剂的制备：

[0170] 含有皱纹假单胞菌S58的液体菌剂的制备包括斜面培养、种子培养、发酵和菌剂制备步骤，具体包括：

[0171] A、斜面培养：将皱纹假单胞菌S58接种到斜面培养基—营养琼脂培养基上，在温度为28‑30℃下培养48h，得斜面菌种；

[0172] B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为29‑33℃下培养18‑24h，得液体发酵种子；该液体培养基为质量百分比的牛肉浸膏2‑4%、蛋白胨0.4‑0.6%、氯化钠
0.4‑0.6%，其余为水，pH值为6.5‑8.0。

[0173] C、发酵：将液体发酵种子按发酵培养基体积4%的量接种入装有发酵培养基的发酵罐，在29‑33℃下培养42h，搅拌速度为120‑150rpm，通气量8%，得到皱纹假单胞菌S58发酵
液；该发酵培养基的组成为：豆饼粉1%、可溶性淀粉1%、牛肉浸膏0.5%、NaCNO3 0.02%、CaCO3 
0.1%，其余为水，上述百分含量均为质量百分含量。

[0174] D、菌剂制备：在发酵液中添加0.2%的腐殖酸钠（载体）充分混匀，得到含有皱纹假单胞菌S58的液体菌剂。含有皱纹假单胞菌S58的液体菌剂中，皱纹假单胞菌S58的含量为
9
10cfu/ml。

[0175] 3、防治实验：烤烟品种为红花大金元，烟苗移栽还苗5天后，选择试验地。本试验采用随机区组设计，随机设置2个处理区，每个处理区设三个重复（三个小区）。2个处理区分别
为空白对照处理区（CK处理区）和S58处理区。将试验地划分为6个小区，每个小区15株烤烟。
并采用随机抽签的方式分布各个处理。

[0176] S58处理区：烟苗移栽还苗5天后，采用灌根法接种生防细菌。灌根前用少量清水湿9
润土壤，用步骤2的含有皱纹假单胞菌S58的液体菌剂（皱纹假单胞菌S58的含量为10 cfu/
ml）灌根，每株灌根10ml，接种生防细菌。每三天灌根1次，共灌根3次。在第3次灌根7天后接
7
种烟草青枯病菌，先用手术刀划伤烟株茎基部，然后每株接种10ml 10cfu/ml烟草青枯病
菌悬液，接种后立即覆土保湿，每天早晚各浇一次水。接种烟草青枯病菌10d后调查发病情
况。烟草青枯病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T 23222‑2008)规定执行。

[0177] 空白对照处理区（CK处理区）：烟苗移栽还苗5天后，用NB培养基灌根。灌根前用少量清水湿润土壤，每株灌根10ml NB培养基。每三天灌根1次，共灌根3次。每三天灌根1次，共
灌根3次。在第3次灌根7天后接种烟草青枯病菌，先用手术刀划伤烟株茎基部，然后每株接
7
种10ml 10 cfu/ml烟草青枯病菌悬液，接种后立即覆土保湿，每天早晚各浇一次水。接种烟
草青枯病菌10d后调查发病情况。烟草青枯病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准
(GB/T 23222‑2008)规定执行。

[0178] 在接种生防细菌7天后接种青枯病菌，先用手术刀划伤烟株茎基部，然后每株接种7
10ml 10 cfu/ml青枯病菌悬液，接种后立即覆土保湿，每天早晚各浇一次水。每处理15株，
接种10d后调查发病情况。烟草青枯病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T 
23222‑2008)规定执行。

[0179] 病情指数=Σ（各级病株数×相应级别）／(调查总株数×最大级数) ×100。

[0180] 防治效果（％）=（CK处理区病情指数‑S58处理区病情指数）/CK处理区病情指数×100％。

[0181] 病情调查结果表明，在接种烟草青枯病菌后第10天，各处理均不同程度地发病，皱纹假单胞菌S58菌剂灌根处理的S58处理区显示出很强防病效果，病情指数为20.3，低于对
照NB培养液灌根的CK处理区，防效为76.2%（表1），具有较好的应用价值。

[0182] 表1.皱纹假单胞菌S58对烟草青枯病的防治效果

[0183]处理区 病情指数 防治效果（％）
CK 85.2±5.9 －
S58 20.3±3.5 76.2

[0184] 实施例4、含有皱纹假单胞菌S58的菌剂对烟草黑胫病的防治实验

[0185] 1、病原接种体的制备：将烟草疫霉移植于CA平板（CA培养基），28℃倒置培养7d。取一块菌丝块接种到燕麦培养液中，28℃，180r/min培养7d后转入燕麦培养基上培养21d，得
到烟草疫霉菌谷备用。

[0186] 2、防治实验：烤烟品种为红花大金元，烟苗移栽还苗5天后，选择试验地。本试验采用随机区组设计，随机设置2个处理区，每个处理区设三个重复（三个小区）。2个处理区分别
为空白对照处理区（CK处理区）和S58处理区。将试验地划分为6个小区，每个小区15株烤烟。
并采用随机抽签的方式分布各个处理。

[0187] S58处理区：烟苗移栽还苗5天后，采用灌根法接种生防细菌。灌根前用少量清水湿9
润土壤，用步骤2的含有皱纹假单胞菌S58的液体菌剂（皱纹假单胞菌S58的含量为10 cfu/
ml）灌根，每株灌根10ml，接种生防细菌。每三天灌根1次，共灌根3次。在第3次灌根7天后接
种烟草黑胫病菌，先用手术刀划伤烟株茎基部，然后接种烟草疫霉菌谷，接种量为2g/株，接
种后立即覆土保湿，每天早晚各浇一次水。接种青枯病菌14d后调查发病情况。烟草黑胫病
分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T 23222‑2008)规定执行。

[0188] 空白对照处理区（CK处理区）：烟苗移栽还苗5天后，用NB培养基灌根。灌根前用少量清水湿润土壤，每株灌根10ml NB培养基。每三天灌根1次，共灌根3次。每三天灌根1次，共
灌根3次。在第3次灌根7天后接种烟草黑胫病菌，先用手术刀划伤烟株茎基部，然后接种烟
草疫霉菌谷，接种量为2g/株，接种后立即覆土保湿，每天早晚各浇一次水。接种青枯病菌
14d后调查发病情况。烟草黑胫病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T 
23222‑2008)规定执行。

[0189] 病情指数=Σ（各级病株数×相应级别）／(调查总株数×最大级数) ×100。

[0190] 防治效果（％）=（CK处理区病情指数‑S58处理区病情指数）/CK处理区病情指数×100％。

[0191] 实验结果：病情调查结果表明，在接种烟草疫霉后第14天，各处理均不同程度地发病，皱纹假单胞菌S58菌液浇灌处理的S58处理区显示出很强防病效果，病情指数为31.7，低
于对照NB培养液灌根的CK处理区，防效为60.5%（表2），具有较好的应用价值。

[0192] 表2.皱纹假单胞菌S58对烟草黑胫病防治效果

[0193]处理区 病情指数 防治效果（％）
CK 80.2±6.4 －
S58 31.7±5.8 60.5

[0194] 实施例5、皱纹假单胞菌S58能够通过激发免疫抗性控制烟草野火病的发生

[0195] 将皱纹假单胞菌S58于LB平板划线培养48 h，刮取表面菌落，重悬浮于10 mM 8
MgCl2溶液中，得到皱纹假单胞菌S58的含量为5 ×10cfu/ml的菌悬液。在13000 rpm，4℃条
件下离心10 min，将上清与菌体沉淀分离。菌体重悬浮于10 mM MgCl2溶液中，调整其浓度
8 8
为5 ×10 cfu/ml，加入Silwet L‑77（表面活性剂）至其含量为0.05% ，得到5 ×10cfu/ml
菌体悬浮液。离心上清经0.45 μm滤膜过滤深度除菌，加入Silwet L‑77（表面活性剂）至其
含量为0.05%，得到代谢上清液。本实验重复3次，每次重复取4周大小本氏烟（Nicotiana 
benthamiana）设置4个处理：10 mM MgCl2+Pta处理、S58 supernatant+Pta处理、S58 
pellets+Pta处理、S58 pellets处理,每个处理5株烟草。

[0196] 10 mM MgCl2+Pta处理：每个烟草植株各喷洒10ml MgCl2溶液，25℃培养箱，保湿24 7
h；然后每个烟草植株各喷施10ml 10cfu/ml烟草野火病菌—丁香假单胞菌悬浮液，于25℃
培养箱，观察7天并拍照记录。

[0197] S58 supernatant+Pta处理：每个烟草植株各喷洒10ml 上述代谢上清液，25℃培7
养箱，保湿24 h；然后每个烟草植株各喷施10ml 10cfu/ml烟草野火病菌—丁香假单胞菌
悬浮液，于25℃培养箱，观察7天并拍照记录。

[0198] S58 pellets+Pta处理：每个烟草植株喷洒10ml 上述5 ×108cfu/ml菌体悬浮液，7
25℃培养箱，保湿24 h；然后每个烟草植株各喷施10ml 10cfu/ml烟草野火病菌—丁香假
单胞菌悬浮液，于25℃培养箱，观察7天并拍照记录。

[0199] S58 pellets处理（未接种病原菌对照）：每个烟草植株喷洒10ml 上述5 ×8
10cfu/ml菌体悬浮液，25℃培养箱，保湿24 h；然后每个烟草植株各喷施10 ml MgCl2溶液，
于25℃培养箱，观察7天并拍照记录。

[0200] 结果表明10 mM MgCl2+Pta处理接种烟草野火病菌7天后，野火病发生严重，病斑连成片，边缘灼烧状，并向中间扩展，病斑面积占叶片面积的21%以上，病害严重度达到GB/T 
23222‑2008的9级；S58 supernatant+Pta处理接种烟草野火病菌7天后的野火病症状较轻，
无灼伤症状，隐约见侵染斑，病斑面积占叶片面积的1%以下，病害严重度达到GB/T 23222‑
2008的1级，S58 pellets+Pta处理接种烟草野火病菌7天后，叶片边缘轻微灼烧状，病斑面
积占叶片面积的2‑5%，病害严重度达到GB/T 23222‑2008的3级；S58 pellets处理未见病害
发生（图2）。说明皱纹假单胞菌S58能够通过激发免疫抗性显著控制烟草野火病的发生。

[0201] 实施例6、皱纹假单胞菌S58能够激发免疫相关基因的强烈表达

[0202] 将皱纹假单胞菌S58于LB平板划线培养48 h，刮取表面菌落，重悬浮于10 mM 8
MgCl2溶液，使皱纹假单胞菌S58的含量为5 ×10 cfu/ml，得到皱纹假单胞菌S58悬浮液；10 
mM MgCl2溶液为对照，接种本氏烟叶片，每个处理3个重复。6h后用0.5cm直径的打孔器各取
3个叶片组织，迅速用液氮速冻。用植物RNA提取试剂盒（Plant RNA Kit （R6827‑01），
OMEGA）提取RNA，经DNA酶（Dnase I Rnase‑Free （M0303S），NEB）消化后进行cDNA反转录
（ProtoScript II first strand cDNA synthesis Kit （E6560S），NEB）。利用SYBR Green
（Universal qPCR Master Mix（M3003L），NEB）进行定量PCR检测,以Actin基因为参考基因，
并与10 mM MgCl2溶液接种植株对比，结果显示皱纹假单胞菌S58可以激发PR1基因、WRKY7
基因、Acre31基因、NPR1基因、ICS1基因和WRKY40基因这些免疫相关基因上调表达（图3）。仪
器使用ABI QuantStudioTM 6 Flex实时荧光定量PCR系统。引物设计如下：PR1基因的引物
为NbPR1‑F和NbPR1‑R，WRKY7基因的引物为NBWRKY7‑F和NBWRKY7‑R，Acre31基因的引物为
NbAcre31‑F和NbAcre31‑R，NPR1基因的引物为NbNPR1‑F和NbNPR1‑R，ICS1基因的引物为
NbICS1‑F和NbICS1‑R，WRKY40基因的引物为NbWRKY40‑93F和NbWRKY40‑93R，Actin基因的引
物为NbActin‑80F和NbActin‑80R。

[0203] NbPR1‑F：5′‑GTAATATCCCACTCTTGCCG‑3′，

[0204] NbPR1‑R：5′‑ATGAAATCGCCACTTCCCTC‑3′，

[0205] NBWRKY7‑F：5′‑CACAAGGGTACAAACAACACAG‑3′，

[0206] NBWRKY7‑R：5′‑GGTTGCATTTGGTTCATGTAAG‑3′，

[0207] NbAcre31‑F：5′‑AATTCGGCCATCGTGATCTTGGTC‑3′，

[0208] NbAcre31‑R：5′‑GAGAAACTGGGATTGCCTGAAGGA‑3′，

[0209] NbNPR1‑F：5′‑AGGACCGGTTATGCATTGAG‑3′，

[0210] NbNPR1‑R：5′‑GCTTCTCCTAGCAGTGGATCTC‑3′，

[0211] NbICS1‑F：5′‑TTAAACTCATCATCTTCAG‑3′，

[0212] NbICS1‑R：5′‑GGCTTCGCCGGCATTCATT‑3′，

[0213] NbWRKY40‑93F：5′‑gtgcccagtcaaaaagaagg‑3′，

[0214] NbWRKY40‑93R：5′‑gatgggagaggatggttgtg‑3′，

[0215] NbActin‑80F：5′‑gtcctggattctggtgatgg‑3′，

[0216] NbActin‑80R：5′‑agacggaggatagcatgtgg‑3′。

[0217] 实施例7、皱纹假单胞菌S58能够显著抑制拟南芥主根伸长，促进侧根生长，提高拟南芥生物量

[0218] 拟南芥种子经75%乙醇消毒5 min，用无菌水冲洗3遍。均匀点接于MS平板一侧，每板约8‑10颗种子，然后用锡箔纸包裹置于4℃，春化2 d。取出后，于22℃培养箱（光暗时长
2
16/8 h，光照强度100 μmol/m•s ，湿度65%左右）培养5 d。接种皱纹假单胞菌S58发酵液，
接种位置如图4所示。接种菌液浓度OD600=1.0，接种量5 μL × 8 滴。接种相同量的LB培养
基为对照（CK），每个处理重复3次。置于相同培养条件下培养10 d，此时CK长至接近平板底
部。测量各处理拟南芥的根系长度以及各植株鲜重。结果表明，接种皱纹假单胞菌S58处理
的拟南芥主根长度为26.9±2.9mm，CK的拟南芥主根长度为47.6±6.0mm；接种皱纹假单胞
菌S58处理的拟南芥侧根数量是11.0±1.5根/株，CK的拟南芥侧根数量是1.4±0.7根/株；
接种皱纹假单胞菌S58处理的鲜重是12.1±2.4mg/株，CK的拟南芥侧的鲜重是3.9±0.5mg/
株。说明皱纹假单胞菌S58能够显著抑制拟南芥主根伸长，促进侧根生长，提高拟南芥生物
量。

[0219] 采用Salkowski比色法测定内生细菌分泌植物生长激素（IAA），将供试菌株（皱纹假单胞菌S58和不产IAA的阴性对照菌株）分别接种于LB/KB液体培养基（培养基中需加入色
氨酸）的三角瓶中，每瓶盛有50mL培养基，每菌株重复3次，置于28℃摇床，180rpm震荡培养
4d。取100μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加100μL Salkowski比色液。对照只在比色液中
加入100μL 100mg/L的IAA。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够
分泌IAA（图5）。结果表明皱纹假单胞菌S58使比色液变红，能产生植物生长素（IAA）。

[0220] 实施例8、皱纹假单胞菌S58能够水解有机磷

[0221] 将活化的皱纹假单胞菌S58点接到蒙金娜有机磷培养基上，每个培养皿3个接菌点，每菌3个重复。30℃培养一周左右，溶磷圈直径越大溶磷能力越强。结果表明皱纹假单胞
菌S58在蒙金娜有机磷培养基上能产生溶磷圈（图6）。说明皱纹假单胞菌S58能够水解有机
磷，可用于土壤改良。

[0222] 其中，蒙金娜有机磷培养基：10g 葡萄糖，0.5g (NH4)2SO4，0.3g NaCl，0.3g KCl，0.03g FeSO4•7H2O， 0.03g MnSO4•4H2O，0.2g 蛋黄卵磷脂，5g CaCO3，0.4g 酵母膏，20g 琼
脂，蒸馏水定容至l000mL，pH7.0。121℃灭菌30分钟。

[0223] 实施例9、皱纹假单胞菌S58具有显著的产氨能力。

[0224] 将活化的皱纹假单胞菌S58转接到蛋白胨氨化培养基中，30 ℃培养48 h后。以不接种的蛋白胨氨化培养基作对照（CK）。在培养液中加入3−5滴纳氏试剂， 出现黄色或棕红
色沉淀则表明菌株具备产NH3的能力。结果表明CK加入纳氏试剂后无黄色或棕红色沉淀出
现，皱纹假单胞菌S58的处理加入纳氏试剂后有黄色或棕红色沉淀出现（图7）。说明皱纹假
单胞菌S58具有显著的产氨能力。

[0225] 实施例10、皱纹假单胞菌S58菌株具有显著的产嗜铁素能力。

[0226] 嗜铁素检测用培养基（CAS培养基）（Schwyn B. and Neilands J.B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. 
Analytical Biochemistry,1987,160: 47‑56）：由4种溶液组成（溶液1‑3及casamimo 
acid），4种溶液混合前单独灭菌。

[0227] 溶液1（CAS/HDTMA）：①CAS溶液：60.5mg CAS(铬天青)溶解在50mL水中；②铁溶液：1mM FeCl3·6H2O溶解于浓度为10mM的HCl水溶液中, pH为2.0；③HDTMA溶液：72.9mg溴化十
六碳烷基三甲氨溶解于40mL水中。把溶液①与10mL溶液②混合后加入溶液③中并搅拌均
匀，把得到的蓝黑色液体灭菌，该液体即CAS/HDTMA溶液。

[0228] 溶液2（ Salts/Buffer溶液）：①Salts 溶液(750mL)：KH2PO4 0.3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，溶解在750mL去离子水中；②PIPES：哌嗪‑1,4‑二乙磺酸30.24g，溶解于①
Salts溶液中，以50% (W/V)的KOH溶液调节pH 至6.8，加入15.0g琼脂定容至800mL，高压灭
菌冷却至50℃，即得到Salts/Buffer溶液。

[0229] 溶液3 (750mL)：葡萄糖 2g，甘露醇 2g，MgSO4·7H2O 493mg，CaCl2 11mg，H3BO3 1.4mg，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·2H2O 1.17mg，Na2MoO4·2H2O 1mg，CuSO4 40µg，溶解在
750mL去离子水中，高压灭菌。

[0230] 溶液3冷却至50℃后加入溶液2与30 mL过滤除菌的10% (W/V) casamimo acid混合，再加入溶液1，缓慢搅拌（避免产生泡沫），铺平板，该平板即为嗜铁素检测平板。将活化
好的皱纹假单胞菌S58接种于嗜铁素检测平板上,28℃培养24、48、60、72 h观察菌落外围是
否产生黄色晕圈。由于嗜铁素竞争培养基中EDTA螯合的铁离子，使培养基由蓝色变成黄色，
因此菌落周围黄色晕圈出现表明嗜铁素的产生。

[0231] 结果表明皱纹假单胞菌S58菌落周围黄色晕圈出现，表明皱纹假单胞菌S58能产生嗜铁素（图8）。

[0232] 实施例11、皱纹假单胞菌S58具有显著的产淀粉酶能力。

[0233] 将活化的皱纹假单胞菌S58接种于淀粉酶鉴别培养基平板上培养2‑4d后倒入革兰氏碘液覆盖培养基，2min后倒掉革兰氏碘液观察菌落周围是否有透明圈产生，有透明圈者
说明具有分泌淀粉酶的能力。结果表明皱纹假单胞菌S58的菌落周围有透明圈产生（图9）。
说明皱纹假单胞菌S58具有分泌淀粉酶的能力。

[0234] 其中，淀粉酶鉴别培养基：可溶性淀粉 1g；蛋白胨 5g；葡萄糖 5g；NaCl 5g；牛肉膏 5g；琼脂 15g；蒸馏水 1000ml。