无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法

摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法。该培养基由如下成分组成：非必需氨基酸、谷氨酰胺、氢化可的松、地塞米松、聚乙烯醇、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人Wnt‑3a蛋白、重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白、L‑谷胱甘肽、L‑抗坏血酸、β‑巯基乙醇、乙醇胺、Pluronic F‑68、Tween 80、胆固醇、腺嘌呤、亚硒酸钠、基础培养基。本发明发现聚乙烯醇可替代无血清培养基中血清白蛋白的载体作用，有效提高间充质干细胞的增殖能力，其性能比血清白蛋白更稳定，可有效解决干细胞增殖与传代能力下降的问题。

权利要求

1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，采用无血清培养基培养间充质干细胞；

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；

所述无血清培养基由如下成分组成：非必需氨基酸：                1vt%谷氨酰胺：                    2 mM氢化可的松：                  50 µg/L地塞米松：                    10 µg/L聚乙烯醇：                    2 10g/L~

重组人胰岛素：                10 mg/L重组人转铁蛋白：              5.5 mg/L重组人表皮生长因子：          20 µg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子：20 µg/L重组人Wnt‑3a蛋白：            20 µg/L重组人纤连蛋白：              50 µg/L重组人层黏蛋白：              20 µg/LL‑谷胱甘肽：                  4 mg/LL‑抗坏血酸：                  50 mg/Lβ‑巯基乙醇：                  2.5 mg/L乙醇胺：                      0.2 g/LPluronic F‑68：               500 mg/LTween 80：                    22 mg/L胆固醇：                      2.2 mg/L腺嘌呤：                      10 mg/L亚硒酸钠：                    0.00067 mg/L基础培养基：                  余量。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12、高糖DMEM、a‑MEM中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述无血清培养基的制备方法为：将非必需氨基酸、谷氨酰胺、氢化可的松、地塞米松、聚乙烯醇、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人Wnt‑3a蛋白、重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白、L‑谷胱甘肽、L‑抗坏血酸、β‑巯基乙醇、乙醇胺、Pluronic F‑

68、Tween 80、胆固醇、腺嘌呤、亚硒酸钠溶于基础培养基，过滤除菌。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述过滤除菌所用滤膜的孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养的条件为5%CO2、37℃，密4

度接种为（0.1 10）×10个/mL。

~

说明书

无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法。

背景技术

[0002] 干细胞及其代表的再生医学领域研究近二十年来不断取得重大技术突破，引发了人们对干细胞技术产业化及临床应用的高度重视。截止到2019年，全球已有16款干细胞产
品上市，其中间充干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于具有多种优点而成为产品
最多，发展最为迅猛的干细胞类型。间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，是一类非造血
干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脐带、脐
带血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力、多向分化潜能，可在体外培养扩增，不仅
能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用；不同的诱导条件下，在体外可分化为
骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜
能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，MSCs具有广阔
的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫
疾病治疗的研究热点。目前行业内对规模化、标准化、产业化的，可临床应用的间充质干细
胞相关技术与产品的需求呼声越来越高。

[0003] 在生物医学工程领域的研究中，大量种子细胞的获取往往需要通过干细胞的体外培养和收获来实现。目前间充质干细胞培养使用有血清培养基或无血清培养基。血清培养
基大都含有动物血清，如最为常见的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)。FBS成分复杂且
含有异种蛋白质，容易携带病毒或被支原体感染等。另一方面，FBS批间差异较大，来源不稳
定，对体外大规模扩增MSCs工艺影响较大。目前有研究表明，MSCs在培养过程中会吞噬培养
基中的蛋白质，培养基中含有牛血清白蛋白，可以使受者体内产生抗牛白蛋白抗体引起免
疫反应，从而导致或者尤其是在重复输注MSCs治疗后失效。因此，越来越多研究人员及企业
开始研发FBS的替代物。

[0004] 无血清培养基(Serum‑Free Medium，SFM)，顾名思义是指在细胞培养中不需要添加动物或人源血清。但为了满足细胞生长的要求，通常会向培养基中添加替代血清功能的
原料，主要包括结合蛋白、生长因子、粘附因子、激素、微量元素等加大类别。应用于间充质
干细胞的SFM的研发至今，主要经历了四大阶段。第一代是一般意义上的无血清培养基，采
用各种可替代血清功能的生物材料，含大量动物来源蛋白和不明成分，如动物或人源血小
板裂解物等；其优点是相较于含血清培养基，实验准确性、可重复性、稳定性高一些；但由于
添加物质的化学成分不明确，大部分含大量动物源蛋白，不利于目标蛋白的分离纯化，而且
成本较高。第二代是无血清无动物源蛋白培养基，其添加成分完全不用动物来源蛋白，取而
代之的是各种重组蛋白或动植物蛋白水解物；其优势是稳定性较第一代有所提高，降低了
成本，效果也相应提高；但由于成本极高，仅适合需求量少的科研用户，难于被开展大规模
生产的企业所使用。目前市面上性能稳定，科研用户使用的大多是第二代SFM产品。第三代
是成分限定培养基，又称双无培养基；添加成分完全不含血清、无蛋白或蛋白含量极低，且
所含蛋白是成分明确的；第三代SFM优势十分明显，细胞培养与生产易做到恒定，目标蛋白
的分离纯化更为容易，成本大为下降；但目前阶段此类产品均具有细胞传代及扩增能力不
足的缺点，这也是目前SFM研发企业急需突破的瓶颈；而且对培养的细胞具有很高的特异
性，所以适于培养的细胞系较少，产品开发难度极大。第四代是化学组分限定培养基，添加
成分不含血清、不含任何蛋白，主要由化合物代替不稳定的蛋白类物质，可高温消毒，适合
多种不同细胞生长的全能型培养基；目前暂无此类产品上市，仍处于研发阶段。目前市面上
的无血清培养基，其中牛血清白蛋白或人血清白蛋白几乎是基础成分中必须的原料。血清
白蛋白在无血清培养基中的添加比例较大，其作用不仅是作为一种转运蛋白，还可以增加
培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。有研究表明牛或人血清白蛋白有可能会促进干细
胞分化，导致干细胞增殖与传代能力的下降。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明提供了无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法。该无血清培养基可有效解决干细胞增殖与传代能力下降的问题。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种无血清培养基，该培养基由如下成分组成：

[0008]

[0009] 本发明选用一种高分子有机化合物——聚乙烯醇(polyvinylalcohol,vinylalcohol polymer，PVA)，可以替代血清白蛋白在培养基的载体作用，有效提高间充质
干细胞的增殖能力，而且其性能比血清白蛋白更稳定。工业级PVA是重要的化工原料，用于
制造聚乙烯醇缩醛、耐汽油管道和维尼纶合成纤维、织物处理剂、乳化剂、纸张涂层、粘合
剂、胶水等。医药级PVA，不同于化工级别聚乙烯醇，它是一种极安全的高分子有机物，对人
体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，尤其在医疗中的如其水性凝胶在眼科、伤口敷
料和人工关节方面的有广泛应用，同时在聚乙烯醇薄膜在药用膜，人工肾膜等方面也有使
用。其安全性可以从用于伤口皮肤修复，和眼部滴眼液产品可见一斑。其中一些型号也常被
用在化妆品中的面膜、洁面膏、化妆水及乳液中，是一种常用的安全性成膜剂。最新国际研
究发现，普通胶水中含有的聚乙烯醇可以用于造血干细胞的培养液，在此基础上有望大幅
降低造血干细胞的培养成本，帮助治疗白血病等疾病。

[0010] 本发明提供一种高分子有机化合物聚乙烯醇替代现有无血清培养基产品中常用的血清白蛋白，可有效改善间充质干细胞传代及扩增能力不足的缺点。

[0011] 作为优选，该培养基中各成分用量如下：

[0012]

[0013]

[0014] 优选地，该培养基中各成分用量如下：

[0015]

[0016] 更优选地，该培养基中各成分用量如下：

[0017]

[0018] 作为优选，基础培养基为DMEM/F12、高糖DMEM、a‑MEM中的一种。

[0019] 作为优选，该无血清培养基中还可以加入青霉素和链霉素。

[0020] 本发明还提供了该无血清培养基的制备方法，将非必需氨基酸、谷氨酰胺、氢化可的松、地塞米松、聚乙烯醇、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人
碱性成纤维细胞生长因子、重组人Wnt‑3a蛋白、重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白、L‑谷胱
甘肽、L‑抗坏血酸、β‑巯基乙醇、乙醇胺、Pluronic F‑68、Tween 80、胆固醇、腺嘌呤、亚硒酸
钠溶于基础培养基，过滤除菌。

[0021] 作为优选，过滤除菌所用滤膜的孔径为不大于0.22μm。

[0022] 优选地，过滤除菌所用滤膜的孔径为0.22μm。

[0023] 本发明还提供了一种间充质干细胞的培养方法，采用本发明的无血清培养基培养间充质干细胞。

[0024] 作为优选，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、羊水间充质干细胞、胎盘间充质干细胞中的一种。

[0025] 作为优选，培养的条件为5％CO2、37℃，密度接种为(0.1～10)×104个/mL。

[0026] 本发明提供了无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法。该培养基由如下成分组成：非必需氨基酸、谷氨酰胺、氢化可的松、地塞米松、聚乙烯醇、重组人胰岛
素、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人Wnt‑
3a蛋白、重组人纤连蛋白、重组人层黏蛋白、L‑谷胱甘肽、L‑抗坏血酸、β‑巯基乙醇、乙醇胺、
Pluronic F‑68、Tween 80、胆固醇、腺嘌呤、亚硒酸钠、基础培养基。本发明具有的技术效果
为：

[0027] 本发明将聚乙烯醇加入无血清培养基，聚乙烯醇可以替代血清白蛋白在培养基的载体作用，有效提高间充质干细胞的增殖能力，而且其性能比血清白蛋白更稳定。

[0028] 本发明提供的无血清培养基可有效解决干细胞增殖与传代能力下降的问题。

附图说明

[0029] 图1示各组UC‑MSCs形态图(100×)；

[0030] 图2示各组UC‑MSCs生长曲线；

[0031] 图3示各组UC‑MSCs成脂分化效果图(400×)；

[0032] 图4示各组UC‑MSCs成骨分化效果图(40×)。

具体实施方式

[0033] 本发明公开了无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和
改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及
应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围
内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0034] 本发明中，所涉及的组分、试剂均为常规市售产品。如DMEM/F12基础培养基(货号11330)、非必须氨基酸溶液(货号11140‑050)购自Gibco公司。其他组分均可从sigma、MP、
Gibco等公司购得。

[0035] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0036] 实施例1无血清培养基配制:

[0037] 本实施例无血清培养基成分包括：

[0038] 非必需氨基酸：体积比1％

[0039] 谷氨酰胺：2mM

[0040] 氢化可的松：50μg/L

[0041] 地塞米松：10μg/L

[0042] 聚乙烯醇：2g/L

[0043] 重组人胰岛素：10mg/L

[0044] 重组人转铁蛋白：5.5mg/L

[0045] 重组人表皮生长因子：20μg/L

[0046] 重组人碱性成纤维细胞生长因子：20μg/L

[0047] 重组人Wnt‑3a蛋白：20μg/L

[0048] 重组人纤连蛋白：50μg/L

[0049] 重组人层黏蛋白：20μg/L

[0050] L‑谷胱甘肽：4mg/L

[0051] L‑抗坏血酸：50mg/L

[0052] β巯基乙醇：2.5mg/L

[0053] 乙醇胺：0.2g/L

[0054] Pluronic F‑68：500mg/L

[0055] Tween 22mg/L

[0056] 胆固醇：2.2mg/L

[0057] 腺嘌呤：10mg/L

[0058] 亚硒酸钠：0.00067mg/L

[0059] DMEM/F12基础培养基：余量。

[0060] 各组分按其各自溶解特性溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，加入到基础培养基中混匀。

[0061] 实施例2无血清培养基配制:

[0062] 本实施例无血清培养基成分包括：

[0063] 非必需氨基酸：体积比1％

[0064] 谷氨酰胺：2mM

[0065] 氢化可的松：50μg/L

[0066] 地塞米松：10μg/L

[0067] 聚乙烯醇：4g/L

[0068] 重组人胰岛素：10mg/L

[0069] 重组人转铁蛋白：5.5mg/L

[0070] 重组人表皮生长因子：20μg/L

[0071] 重组人碱性成纤维细胞生长因子：20μg/L

[0072] 重组人Wnt‑3a蛋白：20μg/L

[0073] 重组人纤连蛋白：50μg/L

[0074] 重组人层黏蛋白：20μg/L

[0075] L‑谷胱甘肽：4mg/L

[0076] L‑抗坏血酸：50mg/L

[0077] β巯基乙醇：2.5mg/L

[0078] 乙醇胺：0.2g/L

[0079] Pluronic F‑68：500mg/L

[0080] Tween 22mg/L

[0081] 胆固醇：2.2mg/L

[0082] 腺嘌呤：10mg/L

[0083] 亚硒酸钠：0.00067mg/L

[0084] DMEM/F12基础培养基：余量。

[0085] 各组分按其各自溶解特性溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，加入到基础培养基中混匀。

[0086] 实施例3无血清培养基配制:

[0087] 本实施例无血清培养基成分包括：

[0088] 非必需氨基酸：体积比1％

[0089] 谷氨酰胺：2mM

[0090] 氢化可的松：50μg/L

[0091] 地塞米松：10μg/L

[0092] 聚乙烯醇：10g/L

[0093] 重组人胰岛素：10mg/L

[0094] 重组人转铁蛋白：5.5mg/L

[0095] 重组人表皮生长因子：20μg/L

[0096] 重组人碱性成纤维细胞生长因子：20μg/L

[0097] 重组人Wnt‑3a蛋白：20μg/L

[0098] 重组人纤连蛋白：50μg/L

[0099] 重组人层黏蛋白：20μg/L

[0100] L‑谷胱甘肽：4mg/L

[0101] L‑抗坏血酸：50mg/L

[0102] β巯基乙醇：2.5mg/L

[0103] 乙醇胺：0.2g/L

[0104] Pluronic F‑68：500mg/L

[0105] Tween 22mg/L

[0106] 胆固醇：2.2mg/L

[0107] 腺嘌呤：10mg/L

[0108] 亚硒酸钠：0.00067mg/L

[0109] DMEM/F12基础培养基：余量。

[0110] 各组分按其各自溶解特性溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，加入到基础培养基中混匀。

[0111] 对比例1无血清培养基配制:

[0112] 与实施例1相比，本对比例采用重组人血白蛋白替代聚乙烯醇，本对比例无血清培养基成分包括：

[0113] 非必需氨基酸：体积比1％

[0114] 谷氨酰胺：2mM

[0115] 氢化可的松：50μg/L

[0116] 地塞米松：10μg/L

[0117] 重组人血白蛋白：2g/L

[0118] 重组人胰岛素：10mg/L

[0119] 重组人转铁蛋白：5.5mg/L

[0120] 重组人表皮生长因子：20μg/L

[0121] 重组人碱性成纤维细胞生长因子：20μg/L

[0122] 重组人Wnt‑3a蛋白：20μg/L

[0123] 重组人纤连蛋白：50μg/L

[0124] 重组人层黏蛋白：20μg/L

[0125] L‑谷胱甘肽：4mg/L

[0126] L‑抗坏血酸：50mg/L

[0127] β巯基乙醇：2.5mg/L

[0128] 乙醇胺：0.2g/L

[0129] Pluronic F‑68：500mg/L

[0130] Tween 22mg/L

[0131] 胆固醇：2.2mg/L

[0132] 腺嘌呤：10mg/L

[0133] 亚硒酸钠：0.00067mg/L

[0134] DMEM/F12基础培养基：余量。

[0135] 各组分按其各自溶解特性溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，加入到基础培养基中混匀。

[0136] 对比例2无血清培养基配制:

[0137] 与对比例1和实施例相比，本对比例不添加重组人血白蛋白或者聚乙烯醇，本对比例无血清培养基成分包括：

[0138] 非必需氨基酸：体积比1％

[0139] 谷氨酰胺：2mM

[0140] 氢化可的松：50μg/L

[0141] 地塞米松：10μg/L

[0142] 重组人胰岛素：10mg/L

[0143] 重组人转铁蛋白：5.5mg/L

[0144] 重组人表皮生长因子：20μg/L

[0145] 重组人碱性成纤维细胞生长因子：20μg/L

[0146] 重组人Wnt‑3a蛋白：20μg/L

[0147] 重组人纤连蛋白：50μg/L

[0148] 重组人层黏蛋白：20μg/L

[0149] L‑谷胱甘肽：4mg/L

[0150] L‑抗坏血酸：50mg/L

[0151] β巯基乙醇：2.5mg/L

[0152] 乙醇胺：0.2g/L

[0153] Pluronic F‑68：500mg/L

[0154] Tween 22mg/L

[0155] 胆固醇：2.2mg/L

[0156] 腺嘌呤：10mg/L

[0157] 亚硒酸钠：0.00067mg/L

[0158] DMEM/F12基础培养基：余量。

[0159] 各组分按其各自溶解特性溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，加入到基础培养基中混匀。

[0160] 试验例效果检测

[0161] 本发明实施例1‑3无血清培养基设为实验组1‑3，含10％FBS的完全培养基设为对照组1，对比例1培养基设为对照组2，对比例2培养基设为对照组3，开展以下实验。

[0162] (一)UC‑MSCs形态观察及活性检测

[0163] 选择P3代UC‑MSCs开展实验，UC‑MSCs按1×104/cm2密度接种于T25培养瓶中，每组设置3个重复。置于5％CO2培养箱37℃培养。培养48h后采集UC‑MSCs图像，结果如图1所示。
各组UC‑MSCs均呈单层贴壁生长，大部分细胞呈长梭形，形态不规则。

[0164] 培养72h后，0.05％胰蛋白酶溶液消化收集各组UC‑MSCs，计算各组细胞数量及细胞活率，结果显示实验组UC‑MSCs活性高于三对照组(表1)。

[0165] 表1各组UC‑MSCs活性检测结果

[0166]

[0167] (二)UC‑MSCs增殖速率检测

[0168] 选择P3代UC‑MSCs开展实验，UC‑MSCs按1×104个/mL密度接种于24孔板中，放入5％CO2培养箱37℃培养。每天收集细胞进行细胞计数，每次随机收集计算3个孔，连续7天，
绘制细胞生长曲线，结果如表2‑3，图2。由表2‑3及图2结果可见，与对照组1(含血清组)、对
照组2和对照组3相比，采用本发明所述人无血清培养基培养UC‑MSCs增殖活性更高。培养三
天后，各实验组增殖倍数显著高于对照组1、对照组2和对照组3。

[0169] 根据倍增时间计算公式：DT＝t*[lg2/(lgNt‑lgNo)]，其中t为培养时间；No为首次记下的细胞数；Nt为t时间后的细胞数。

[0170] 结果表明实验组UC‑MSCs的倍增时间少于对照组1、对照组2和对照组3，说明采用本发明所述无血清培养基培养UC‑MSCs增殖速率更高。

[0171] 表2各组UC‑MSCs 7天细胞计数结果

[0172]

[0173] 表3各组UC‑MSCs倍增时间结果

[0174]实验组别 对照组1 对照组2 对照组3 实验组1 实验组2 实验组3
倍增时间(h) 29.18 32.79 34.27 27.12 22.72 26.24

[0175] (三)UC‑MSCs表面标志物检测

[0176] 选择P3代UC‑MSCs开展实验，UC‑MSCs按1×104/cm2密度接种于10cm培养皿中，置于5％CO2培养箱37℃培养。3天后，0.05％胰蛋白酶溶液消化收集各组UC‑MSCs，流式细胞仪检
测其表面marker如CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、HLA‑DR等的表达情况。结果如表4。检测结
果表明，实验组与对照组1、对照组2的UC‑MSCs表面markerCD105、CD73、CD90阳性表达(表达
率≥95％)，而CD34、CD45、HLA‑DR阴性表达(表达率≤2％)，各组之间无显著性差异。对照组
3的CD105、CD34表达率不符合标准。结果表明采用本发明无血清培养基培养UC‑MSCs不影响
其表面标记物的表达。

[0177] 表4各组UC‑MSCs表面marker检测结果

[0178]

[0179]

[0180] (四)UC‑MSCs多向分化潜能检测

[0181] 选择P3代UC‑MSCs开展实验，实验组2、对照组1和对照组2的UC‑MSCs分别常规培养5
传代至P5代，按1×10/mL密度接种于6孔板中，放入5％CO2培养箱37℃培养。待各组UC‑MSCs
融合度达80％以上，分别设置对照孔和诱导孔，诱导UC‑MSCs成骨和成脂分化。14天后对成
脂分化实验组细胞进行油红O染色，21天后对成骨分化实验组细胞进行茜素红染色。实验结
果表明采用本发明无血清培养基培养UC‑MSCs不会影响其成脂成骨分化潜能，维持其干性
(图3、图4)。

[0182] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。