大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用转让专利
申请号 : CN201911374340.X
文献号 : CN110923247B
文献日 : 2023-04-11
发明人 : 王化俊 , 侯静静 , 梁倩倩 , 司二静 , 姚立蓉 , 汪军成 , 李葆春 , 孟亚雄 , 马小乐 , 杨轲 , 胡娜
申请人 : 甘肃农业大学
摘要 :
大麦条纹病（Barley leaf stripe）是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生，严重影响到大麦的经济和营养价值。本发明获得了一种大麦条纹病（麦类核腔菌Pyrenophora graminea）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，通过RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因参与调控菌株生长分化，增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性，降低细胞壁强度，加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，调控毒性和致病性中的应用。
权利要求 :
1.大麦条纹病致病性基因Pgmiox在调控麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）菌株生长分化中的应用，其特征在于所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示。
2+
2.大麦条纹病致病性基因Pgmiox在增强麦类核腔菌盐、干旱和重金属Cu 胁迫耐受性中的应用，其特征在于所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示，所述应用通过干扰Pgmiox的表达予以实现。
3. 大麦条纹病致病性基因Pgmiox在降低麦类核腔菌细胞壁强度，加强抑真菌剂敏感性，调控毒性和致病性中的应用，其特征在于，所述Pgmiox的全长序列如SEQ ID NO：1所示，所述应用通过干扰Pgmiox的表达予以实现。
说明书 :
大麦条纹病致病性基因Pgmiox及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及大麦条纹病菌致病性基因Pgmiox的生物信息学分析及其调控菌丝生长速率；增强盐胁迫（0.8mol/L NaCl）、干旱胁迫（15% PEG）、和重金属胁迫（0.05mmol/L CuSO4·5H2O）耐受性；降低细胞壁强度；加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，该基因还有可能为抑真菌剂（戊唑醇和苯并咪唑）的靶位点；以及沉默该基因降低大麦条纹病（麦类核腔菌）的毒性和致病性的应用。
背景技术
[0002] 大麦条纹病（Barley leaf stripe）是大麦的主要病害之一，在大麦种植区普遍发生。近年来，由于耕作制度的变化以及多年的连茬种植，该病害发生日趋严重，研究该病病原菌的致病机制就显得尤为重要。现已得知，该病是由种子带菌引起的系统侵染性真菌病害，其病原菌的无性阶段Drechslera graminea ( Rabenh & Schlecht) Schoemaker为禾内脐蠕孢，半知菌亚门、内脐蠕孢属，有性阶段Pyrenophora graminea为麦类核腔菌，子囊菌亚门、核腔菌属。
[0003] R.W.Medd等通过大量研究发现，大麦条纹病菌侵染植株的发病情况与是否产生植物毒素有关。A.HAEGI等研究该病原菌毒素成分得出，其中一类葡萄糖醛酸（D‑Glucuronate）物质被抑制时，毒素危害能力明显降低。实验室前期分离甘肃大麦产区不同地区的条纹病病原菌，鉴定其致病力，筛选得到强致病力菌株QWC，并运用Illumina Hiseq
2000平台对其进行全基因组测序。经KEGG和PHI基因功能注释得到与葡萄糖醛酸相关的两条通路，分别是抗坏血酸醛酸代谢途径（ascorbate and aldarate metabolism）和戊糖葡糖醛酸转化途径（pentose and glucuronate interconversions），并在此化合物上游分别注释出一个基因。
2000平台对其进行全基因组测序。经KEGG和PHI基因功能注释得到与葡萄糖醛酸相关的两条通路，分别是抗坏血酸醛酸代谢途径（ascorbate and aldarate metabolism）和戊糖葡糖醛酸转化途径（pentose and glucuronate interconversions），并在此化合物上游分别注释出一个基因。
[0004] 本研究运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术研究抗坏血酸醛酸代谢途径上注释的基因Pgmiox，构建Pgmiox的干扰载体，通过PEG介导方法转化QWC菌株，并对干扰突变菌株和野生菌株的生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面进行分析，明确Pgmiox在大麦条纹病菌中致病性的功能机制，以期为大麦条纹病菌的致病机理和调控机理奠定基础，同时也为设计新型杀真菌剂筛选候选靶标基因。
[0005] 现有技术存在的问题：现有技术中未见大麦条纹病（麦类核腔菌）Pgmiox基因及RNA干扰该基因应用的报道。
[0006] 鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，运用RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0008] 一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，该基因全长序列如SEQ ID NO：1所示，具体步骤如下：
[0009] 1、大麦条纹病菌株的培养
[0010] 制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成0.5‑2cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20‑30min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和15‑17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5‑10mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长3‑7d。
[0011] 2、Pgmiox基因的克隆
[0012] 以QWC基因组DNA和cDNA为模板，使用引物miox‑F1/ miox‑R1（附图1）通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19‑T Vector：pMD19‑T Vector（Simple） 1μL、目的片段 4μL、SolutionⅠ 5μL，缓慢混匀，轻离心3‑10sec，
16℃水浴连接12‑16h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X‑gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出‑80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1‑2h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养12‑16h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
16℃水浴连接12‑16h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X‑gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出‑80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1‑2h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于37℃培养箱中黑暗培养12‑16h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
[0013] 3、Pgmiox基因序列及生物信息学分析
[0014] 测序结果表明Pgmiox基因的ORF框全长981bp，且DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子（附图2A）。利用网络在线SMART工具（http://smart.embl‑heidelberg.de/）对Pgmiox进行蛋白结构域分析，该基因有一个Pfam域miox结构域（Myo‑inositol oxygenase；78AA 326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa‑pbil.ibcp.fr/~cgi‑bin ... page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α‑螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici‑repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor‑jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici‑repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
[0015] Pgmiox基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用，包括如下步骤：
[0016] 1、干扰载体pSilent‑1miox的构建
[0017] 以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1‑F1/miox1‑R1和miox2‑F1/miox2‑R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent‑1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent‑1的XhoI‑HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent‑1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent‑1miox1的ApaⅠ‑StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent‑1miox（附图3）。
[0018] 2、遗传转化与筛选
[0019] 将QWC菌株置于酶解液（1%溶壁酶（Lywallzyme）+0.5%蜗牛酶（Snailase），以0.7mol/L NaCl稳渗剂配制）30℃温育4‑6h，过滤未酶解菌丝，制备出原生质体，置于STC缓冲液（0.7mol/L蔗糖，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris‑HCl（pH=7.5））中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100‑200μL STC重悬沉淀与5‑10μg pSilent‑1miox的质粒DNA混合，冰浴
20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入
800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在
15‑20mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10‑15mL含有70‑90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有90‑100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG‑1/HYG‑2（附图
1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入
800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在
15‑20mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10‑15mL含有70‑90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。将这些菌落直接转移到含有90‑100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG‑1/HYG‑2（附图
1）进行PCR鉴定筛选（附图4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
[0020] 3、突变菌株生长分化的鉴定
[0021] 将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基（MM）：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL（母液：H3BO3 0.570g、MnCl2·
4H2O 0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂15‑17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，15‑17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：
V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15‑17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15‑17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：
新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15‑17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；
△miox32：0.80，0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；
△miox35：0.72，0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；
△miox44：0.60，0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
4H2O 0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂15‑17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，15‑17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：
V8果汁100mL、CaCO3 0.2g、琼脂15‑17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂15‑17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：
新鲜马铃薯200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，15‑17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；
△miox32：0.80，0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；
△miox35：0.72，0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；
△miox44：0.60，0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
[0022] 4、突变菌株不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性的鉴定[0023] 将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
[0024] 5、突变菌株毒性和致病性的鉴定
[0025] 将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mg ZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25‑30℃黑暗培养18‑25d后，过滤，得到粗毒素液体（附图9A），取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，2‑3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
[0026] 将含菌丝的琼脂块（直径：d=0.50cm）接种到离体大麦（两叶期）叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，2‑3d后观察叶片的病斑发生状况。如附图10C所示，菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染18‑25d，盆栽播种14‑20d后计算观察发病率及发病状况，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的发病率分别为：63.05%，40.99%，41.20%，43.12%，41.21%，39.87%和41.56%（附图10A），6个干扰菌株的发病率与对照比较显著降低。如附图10B所示，大麦叶片明显萎缩，发病较为严重，干扰株处理的叶片发病较弱。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgmiox基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
附图说明
[0027] 图1为本发明所用引物序列。
[0028] 图2为Pgmiox基因生物信息学分析图。
[0029] 其中A为Pgmiox基因全长DNA（1）和cDNA（2）扩增结果图，B为Pgmiox基因的功能域图，C为Pgmiox基因的蛋白二级结构预测图，D为Pgmiox基因系统发育分析图。
[0030] 图3为Pgmiox基因干扰载体示意图。
[0031] 图4为干扰株的PCR验证。1泳道为阴性对照野生菌株QWC，2泳道为阳性对照干扰载体pSilent‑1miox。3‑8号泳道分别为：△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54，6个干扰突变菌株均含有潮霉素片段。
[0032] 图5为干扰株和野生株在5种营养培养基的生长形态。
[0033] 图6为干扰株和野生株在5种营养培养基的生长曲线。
[0034] 图7为干扰株和野生株在不同环境胁迫、细胞壁抑制剂和抑真菌剂培养基的生长形态。
[0035] 其中A为0.01mol/L H2O2和1mol/L山梨醇胁迫，B为0.8mol/L NaCl、15% PEG和0.5mmol/L CuSO4·5H2O胁迫，C为0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS和0.2mg/mL CFW胁迫，D为
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
[0036] 图8为干扰株和野生株在不同环境胁迫、细胞壁抑制剂和抑真菌剂培养基的生长速率图。
[0037] 其中A为0.01mol/L H2O2和1mol/L山梨醇胁迫，B为0.8mol/L NaCl、15% PEG和0.5mmol/L CuSO4·5H2O胁迫，C为0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS和0.2mg/mL CFW胁迫，D为
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺胁迫。
[0038] 图9为毒素试验图
[0039] 其中A图为菌株粗毒素提取图，B图为菌株粗毒素注射大麦叶片图（标尺为1cm）[0040] 图10为致病性试验图
[0041] 其中A图为菌株发病率图，B图为盆栽大麦叶片致病性图，C图为离体大麦叶片致病性图（标尺为1cm）。
具体实施方式
[0042] 为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0043] 在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例提供一种大麦条纹病致病性基因Pgmiox，该基因全长序列如序列表1所示。
[0046] 实施例2
[0047] 本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgmiox基因克隆及其RNA干扰转化子获得的方法，包括如下步骤：
[0048] 1、Pgmiox基因的克隆及其生物信息学分析分析
[0049] 制备PDA培养基：将新鲜马铃薯削皮去芽眼切成1cm2的小方块，称取重量200g，加1L蒸馏水煮沸20min，过滤去残渣，在滤液中加入20g葡萄糖和17g琼脂，玻璃棒搅拌混匀，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，倒平板；用直径为5mm打孔器，将4℃保存的麦类核腔菌菌株QWC在边缘打取菌饼置于PDA培养基平板上生长7d。
[0050] 以QWC基因组DNA和cDNA为模板，使用引物miox‑F1/ miox‑R1（附图1）通过PCR扩增获得Pgmiox基因的DNA和cDNA序列，PCR产物经切胶、胶回收、连接载体pMD19‑T Vector：pMD19‑T Vector（Simple） 1μL、目的片段 4μL、SolutionⅠ 5μL，缓慢混匀，轻离心5sec，16℃水浴连接14h、转化DH5α感受态细胞：制备含有100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LBA固体培养基平板，将80μL X‑gal和20μL IPTG混匀后均匀地涂布在每个平板上，晾干备用；取出‑80℃保存的DH5α感受态细胞，冰上溶解，每50μL感受态细胞加入5μL过夜连接液，轻弹混匀，冰浴
30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1.5h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于
37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
30min，42℃热激90s，迅速冰浴3min，期间操作需平稳；每1.5mL离心管加入400μL LB液体培养基，37℃ 200rpm振荡培养1.5h；取200μL菌液均匀地涂布在平板上，封口膜密封，倒置于
37℃培养箱中黑暗培养13h、蓝白斑筛选及鉴定后测序。
[0051] 测序结果表明Pgmiox基因的ORF框全长981bp，且DNA序列与cDNA序列一致，得出该基因没有内含子（附图2A）。利用网络在线SMART工具（http://smart.embl‑heidelberg.de/）对Pgmiox进行蛋白结构域分析，该基因有一个Pfam域miox结构域（Myo‑inositol oxygenase；78AA 326AA）（附图2B）。运用网络在线GOR4工具（http://npsa‑~
pbil.ibcp.fr/cgi‑bin ... page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α‑螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图
2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici‑repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为
99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor‑jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici‑repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
pbil.ibcp.fr/cgi‑bin ... page=npsa_gor4.html）对Pgmiox进行蛋白二级结构预测，该基因编码326个氨基酸，其二级结构以α‑螺旋（Alpha helix，Hh）为主（46.93%），其次为无规卷曲（Random coil，Cc）占37.73%，最后为延伸链（Extended strand，Ee）占15.34%，（附图
2C）。根据BLAST程序将麦类核菌（P.graminea）Pgmiox基因的326个氨基酸序列与Pyrenophora tritici‑repentis、Alternaria alternate、Periconia macrospinosa、Aureobasidium namibiae和Aspergillus fumigatus中miox基因比对，得出相似性分别为
99%、94%、79%、81%和73%。利用MEGA6.0软件进行多序列比对，以邻近相接法（Neighbor‑jointing，NJ）构建系统进化树，得出麦类核菌（P.graminea）和小麦褐斑长蠕孢霉菌（Pyrenophora tritici‑repentis）的miox基因蛋白序列组合在一起（附图2D）。
[0052] 2、干扰载体pSilent‑1miox的构建
[0053] 以菌株QWC的DNA为模板，使用引物miox1‑F1/miox1‑R1和miox2‑F1/miox2‑R1（附图1）分别扩增获得片段miox1（334bp）和miox2（334bp）。用XhoⅠ和HindⅢ双酶切片段miox1和载体pSilent‑1，用T4连接酶将片段miox1连接到载体pSilent‑1的XhoI‑HindⅢ位点。然后将片段miox2和pSilent‑1miox1用ApaⅠ和StuⅠ双酶切，用T4连接酶将片段miox2连接到载体pSilent‑1miox1的ApaⅠ‑StuⅠ位点，得到Pgmiox基因的干扰载体pSilent‑1miox（附图3）。
[0054] 3、遗传转化与筛选
[0055] 将QWC菌株置于酶解液（1%溶壁酶（Lywallzyme）+0.5%蜗牛酶（Snailase），以0.7mol/L NaCl稳渗剂配制）30℃温育4h，过滤未酶解菌丝，制备出原生质体，置于STC缓冲液（0.7mol/L蔗糖，50mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris‑HCl（pH=7.5））中保存。通过PEG4000介导进行转化：取100μL STC重悬沉淀与10μg pSilent‑1miox的质粒DNA混合，冰浴20min，加入100μL PTC（60% PEG4000，溶解在STC缓冲液中）混匀，冰浴20min，再逐滴加入800μL PTC，室温静置15min，将原生质体转化混合物（500μL/板）用玻璃涂布器轻轻涂布在15mL再生培养基（rPDA，含有0.7mol/L蔗糖的PDA）平板上，倒置于25℃培养箱中静置培养。观察平板表面形成可见菌落后，加盖10mL含有90μg/mL潮霉素B的PDA培养基，25℃培养至长出单菌落。
将这些菌落直接转移到含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG‑1/HYG‑2（附图1）进行PCR鉴定筛选（附图
4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、
90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
将这些菌落直接转移到含有100μg/mL潮霉素B的PDA培养基平板中。连续培养3代，获得能稳定生长的转化子54株，用潮霉素B特异性引物HYG‑1/HYG‑2（附图1）进行PCR鉴定筛选（附图
4），随机选择6株能扩增出1026bp条带的菌株（△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54）进行荧光定量PCR分析得出干扰率分别为：90.36%、89.87%、88.47%、
90.56%、90.75%和88.03%，所需引物如附图1所示。
[0056] 实施例3
[0057] 本实施例提供一种大麦条纹病致病基因Pgmiox的应用，包括如下步骤：
[0058] 1、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌毒性和致病性方面应用[0059] 将6个干扰菌株和QWC菌株接种到毒素诱导培养基（9g蔗糖、5g酒石酸铵、1g NH4NO3、1g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.13g CaCl2·2H2O、0.1g NaCl、18.3mg FeSO4·7H2O、3.5mg ZnSO4·7H2O、2mg MnCl2·4H2O）中，25℃黑暗培养20d后，过滤，得到粗毒素液体，空白诱导培养基为对照CK，6个干扰菌株的颜色明显比QWC淡，野生株粗毒素液体呈现深褐色，干扰株液体呈淡黄色（附图9A）。取20μl注射接种到离体大麦（两叶期）叶片中脉的一侧上，以毒素诱导培养基溶液作为空白对照，置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下，3d后观察发病状况，如附图9B所示，注射QWC菌株毒素的叶片完全发病，呈深褐色，叶片尖端发黄，注射干扰菌株毒素的叶片明显发病减弱，叶片呈绿色，仅注射部位呈褐色。
[0060] 将含菌丝的琼脂块（直径：d=0.50cm）接种到离体大麦（两叶期）叶片上，将接种的大麦叶片置于温度为25℃，光照时间为12h（昼）/12h（夜）的环境下培养，3d后观察叶片的病斑发生状况。如附图10C所示，菌株侵染离体大麦叶片，野生株QWC菌饼侵染处，叶片明显发病，出现病变，呈黄褐色病斑，干扰株侵染的叶片，发病较弱。采用“夹心法”将大麦种子用QWC和干扰菌株置于6℃感染20d，盆栽播种20d后计算观察发病率及发病状况，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的发病率分别为：63.05%，40.99%，41.20%，43.12%，41.21%，39.87%和41.56%（附图10A），6个干扰菌株的发病率与对照比较显著降低。如附图10B所示，大麦叶片明显萎缩，发病较为严重，干扰株处理的叶片发病较弱。综上所述，大麦条纹病菌菌株Pgmiox基因与致病性相关，参与麦类核菌菌株致病性。
[0061] 2、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌生长分化方面应用[0062] 将6个干扰菌株分别接种以下5种培养基中：基本培养基（MM）：NaNO3 6g、KCl 0.52g、MgSO4 0.152g、KH2PO4 1.52g、VB1 0.01g、微量元素1mL（母液：H3BO3 0.570g、MnCl2·
4H2O 0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖
10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁
100mL、CaCO3 0.2g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯
200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，
0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，
0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，
0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
4H2O 0.360g、ZnSO4·7H2O 0.045g、CuSO4·5H2O 0.016g、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.087g，蒸馏水定容到1L）、葡萄糖10g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；完全培养基（CM）：NaNO3 1.8g、葡萄糖
10g、蛋白胨2g、酵母1g、微量元素1mL，17g的琼脂，蒸馏水定容到1L；V8培养基（V8）：V8果汁
100mL、CaCO3 0.2g、琼脂17g，蒸馏水定容到1L；大麦培养基（BM）：称取大麦50g置于1L蒸馏水中煮沸1小时，纱布过滤残渣，琼脂17g，蒸馏水定容到1L；PDA培养基（PDA）：新鲜马铃薯
200g，加1L蒸馏水煮沸，过滤去残渣，加20g葡萄糖，17g琼脂，混匀，加蒸馏水定容至1L。以野生菌株QWC为对照，25℃黑暗培养，按照十字交叉法每天测量菌落直径，每个菌株重复3皿（附图5）。如附图6所示，菌株均呈现缓慢增长的趋势。CM、V8、BM和PDA培养基中，6个RNA干扰株较对照QWC菌株的增长速度差异较大，MM培养基中，菌株生长速率趋于一致，但6个干扰菌株速率均低于对照QWC，Pgmiox基因的干扰突变显著影响了麦类核菌的生长。在CM、MM、V8、BM和PDA培养基上生长速度分别为：QWC：1.05，0.80，0.93，1.06，1.11cm/d；△miox32：0.80，
0.71，0.68，0.93，0.79cm/d；△miox33：0.76，0.76，0.76，0.91，0.75cm/d；△miox35：0.72，
0.76，0.76，0.93，0.75cm/d；△miox43：0.74，0.76，0.74，0.80，0.78cm/d；△miox44：0.60，
0.73，0.55，0.68，0.77cm/d和△miox54：0.82，0.75，0.76，0.96，0.81cm/d，以上结果表明Pgmiox参与了调节麦类核腔菌的生长发育。
[0063] 3、一种大麦条纹病致病基因Pgmiox参与调控麦类核腔菌在不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性和抑真菌剂敏感性方面应用
[0064] 将6个干扰菌株和QWC菌株分别接种在添加15% PEG、0.01mol/L H2O2、0.8mol/L NaCl、1mol/L山梨醇、0.5mmol/L CuSO4·5H2O、0.2mg/mL刚果红、0.02% SDS、0.2mg/mL CFW、0.75μg/mL异菌脲、1.0μg/mL戊唑醇、5μg/mL苯并咪唑和1μg/mL咪鲜胺不同处理的PDA培养基上，以PDA培养基为对照，25℃黑暗培养7d后，按照十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长速率V=T/P×100%,（T是在处理培养基上,野生株QWC和干扰株菌落的直径，P是在对照PDA培养基上菌落生长的直径），每个菌株处理重3皿（附图7）。如附图8A所示，在H2O2胁迫下，干扰株与QWC生长速率无显著差异。山梨醇胁迫下，野生株QWC和干扰株△miox32、△miox33、△miox35、△miox43、△miox44和△miox54的径向生长速度分别是1.06，0.90，0.89，0.87，
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
0.88，0.80和0.88 cm/d。6个干扰株生长速率显著高于对照QWC，且均大于在PDA培养基的生长速率。如附图8B所示，在NaCl胁迫下，6个干扰菌株的生长速率显著低于野生菌株，QWC和它们的径向生长速度分别是0.58，0.40，0.42，0.42，0.42，0.35和0.43cm/d。PEG胁迫下，菌株的生长速率均大于PDA培养基的速率，6个干扰株较QWC差异显著。重金属CuSO4·5H2O胁迫下，干扰株的生长速率显著低于对照菌株，QWC和6个干扰株的径向生长速度分别是0.65，
0.49，0.48，0.48，0.42，0.43和0.48cm/d。如附图8C所示，3种细胞壁抑制剂中，6个干扰菌株的生长速率与对照QWC菌株差异显著。相比较于刚果红培养基上QWC的生长速率38.02%，干扰株的速率介于39.70%—45.78%，SDS培养基上，QWC的生长速率74.07%，干扰株的速率在
77.78%—81.33%之间。CFW培养基上，QWC和6个干扰株的生长速率分别为69.89%，96.67%，
97.29%，97.60%，88.27%，100.33%和89.94%。这些结果表明，Pgmiox能够调节细胞壁的完整性。如附图8D所示，4种真菌抑制剂培养基上，干扰株较对照QWC菌株均表现显著差异。异菌脲和咪鲜胺胁迫时，干扰株较QWC菌株生长速率显著降低，突变菌株降低了对异菌脲和咪鲜胺的耐受性，Pgmiox基因加强了病菌对真菌抑制剂（异菌脲和咪鲜胺）的敏感性。戊唑醇和苯并咪唑胁迫时，干扰株速率显著升高，Pgmiox基因突变菌株增加了对其耐受性，该基因有可能为戊唑醇和苯并咪唑的靶位点，敲除后，药剂失去靶位点，菌丝不受药剂影响，生长速度快于对照。
[0065] 综上所述：Pgmiox具有促进菌丝生长分化，增强盐、干旱和重金属Cu2+胁迫耐受性，加强抑真菌剂（异菌脲和咪鲜胺）敏感性，调控菌株毒性和致病性的功能。沉默该基因具有降低大麦条纹病（麦类核腔菌）的毒性和致病性的应用，敲除Pgmiox使抑真菌剂（戊唑醇和苯并咪唑）失去靶位点，在灭真菌剂方面具有应用。
[0066] 有益效果：本发明提供了一种大麦条纹病（麦类核腔菌）致病性基因Pgmiox，以应对该病害靶标基因的需求，通过RNA干扰技术获得Pgmiox干扰突变体，进一步提供了该基因在生长分化、不同环境胁迫耐受性、细胞壁完整性、抑真菌剂敏感性、毒性和致病性等方面的应用。
[0067] 以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。