巴西木素作为α-突触核蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品或食品中的用途

摘要

本发明属于医药、保健品或食品技术领域。本发明提供了巴西木素在制备α‑突触核蛋白聚集抑制剂中的用途，以及巴西木素作为α‑突触核蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品或食品中的用途。本发明中巴西木素可有效抑制α‑Syn聚集体对细胞产生的毒性，减缓α‑Syn的二级结构向β‑折叠的转变，抑制α‑Syn的聚集及其构象变化过程，是α‑Syn聚集的抑制剂。

权利要求

1.巴西木素在制备用于预防和/或治疗以α-突触核蛋白的聚集沉淀为特征的疾病的药物中的用途，其特征在于：所述疾病为帕金森综合症。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述巴西木素以水分散体系存在。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述巴西木素以浓度为2.5-100μM的巴西木素水分散体系存在。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述巴西木素以浓度为5-50μM的巴西木素水分散体系存在。

说明书

巴西木素作为α-突触核蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品

或食品中的用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药、保健品或食品技术领域，尤其是涉及巴西木素在制备α-突触核蛋白聚集抑制剂中的用途，具体涉及巴西木素作为α-突触核蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品或食品中的用途。

背景技术

[0002] 帕金森综合症(Parkinson’s disease，PD)为一种常见的中老年人神经系统变性疾病。主要临床特征为肌肉震颤、肌强直及运动迟缓。研究发现，大部分帕金森综合症患者主要病变发生在中脑黑质和纹状体中，其内存在路易小体(Lewy)。

[0003] 至今人们共发现三种突触核蛋白分别命名为α-突触核蛋白、β-突触核蛋白、γ-突触核蛋白，其中只有α-突触核蛋白(α-synuclein，简称α-Syn)含有NAC结构域并参与Lewy 小体的形成，而α-Syn的聚集导致的基因点突变和扩增都可以造成家族性帕金森病的发生。α-Syn是一种丰富的突触前蛋白，它由高度可溶性的140个氨基酸构成，分子量为 19kDa，通常定位于神经元突触前端，在中枢神经系统(CNS)中表达，它包含一个保守的脂质结合结构域，参与突触囊泡运输。

[0004] 越来越多的研究表明α-Syn单体没有毒性，但其聚集体通过多种作用方式产生细胞毒性，引起神经元变性甚至凋亡，脑内胶质细胞活性增高，从而激发体内炎症反应。有研究表明，这些症状的出现均先于淀粉样斑块的形成，与病人体内的可溶性寡聚体的浓度密切相关。因此，目前将α-Syn聚集以及可溶性寡聚体的形成视为研究重点。

[0005] 由于α-Syn的聚集沉淀与PD密切相关，因此，如何阻止α-Syn的聚集沉淀就成为当前研究者关注的热点问题。从α-Syn的生成和构象转换角度可以采用以下三种方法和手段来治疗PD：1)稳定淀粉样蛋白的天然单体状态；2)靶向淀粉样蛋白通路上的不同中间体并阻断其转化为原纤维；3)改变聚集途径，促进非淀粉样蛋白聚集体的生成。由于α-Syn自身具有生物体所必需的生理功能，所以目前最安全和可靠的治疗PD的方法就是稳定α-Syn初始结构及抑制其聚集。

[0006] 现有的聚集抑制剂主要分为有机小分子类、多肽类、蛋白及酶类、抗体类、纳米颗粒类和金属鳌合剂类等。如Jody Mason等验证了通过构建多肽类抗α-Syn聚集抑制剂治疗PD，研究发现抑制剂导致与α-Syn聚集相关的毒性大幅度降低，为其提供了一种很有前途的肽序列(Jody Mason et al,Intracellular Screening of a Peptide Library to Derive a Potent Peptide Inhibitor of a-Synuclein Aggregation,Journal of Biological Chemistry,2015, 290(12),7426–7435)。

[0007] 近年来，随着PD研究的发展，中草药小分子由于具有来源丰富，副作用小，成本低廉，适合长期服用的特点，逐渐得到研究人员关注。从中草药中筛选有效的α-Syn聚集抑制剂，成为开发PD新药的有效途径。

发明内容

[0008] 本发明提出巴西木素在制备α-突触核蛋白聚集抑制剂中的用途，并将其用于制备药物、保健品或食品，有效防止PD的发生。

[0009] 本发明提出巴西木素在制备α-突触核蛋白聚集抑制剂中的用途。

[0010] 进一步地，巴西木素在制备用于预防和/或治疗以α-突触核蛋白的聚集沉淀为特征的疾病的药物、保健品或食品中的用途。

[0011] 进一步地，疾病为帕金森综合症。

[0012] 进一步地，巴西木素以水分散体系存在。

[0013] 进一步地，巴西木素以浓度为2.5-100μM的巴西木素水分散体系存在。

[0014] 进一步地，巴西木素以浓度为5-50μM的巴西木素水分散体系存在。

[0015] 本发明的巴西木素在制备α-突触核蛋白聚集抑制剂中的用途具有以下优势：

[0016] 本发明提出的巴西木素在抑制α-突触核蛋白(α-Syn)聚集中的用途，可有效抑制α-Syn 聚集，并将其用于制备药物、保健品或食品，有效防止PD的发生。巴西木素可有效抑制α-Syn聚集体对细胞产生的毒性，减缓α-Syn的二级结构向β-折叠结构的转变，抑制α-Syn的聚集及其构象变化过程。巴西木素是α-Syn聚集的抑制剂，作为一种潜在的新药、保健品或食品分子，用于预防或治疗以α-Syn的聚集及其构象异常为特征的疾病。

附图说明

[0017] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0018] 图1为本发明实施例1中不同浓度巴西木素与α-Syn共培养不同时间后培养物的ThT 荧光图。

[0019] 图2为本发明实施例2中不同浓度巴西木素与α-Syn共培养24h后培养物对PC12的细胞毒性图。

[0020] 图3为本发明实施例3中不同浓度巴西木素与α-Syn共培养0天时和6天时培养物的二级结构变化图。

具体实施方式

[0021] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

[0022] 本发明实施例提出巴西木素在制备α-突触核蛋白聚集抑制剂中的用途。

[0023] 巴西木素结构式如下：

[0024]

[0025] 本发明实施例中，巴西木素是从中草药中提取出来的小分子化合物。α-Syn是一种丰富的突触前蛋白，它由高度可溶性的140个氨基酸构成，分子量为19kDa，通常定位于神经元突触前端，在中枢神经系统(CNS)中表达，它包含一个保守的脂质结合结构域，参与突触囊泡运输。本发明提出巴西木素能够有效抑制α-突触核蛋白的聚集，为α-突触核蛋白抑制剂的研究提供了新思路。

[0026] 本发明实施例还提出巴西木素作为α-突触核蛋白聚集抑制剂在制备药物、保健品或食品中的用途。本发明充分利用巴西木素作为中草药类小分子，毒副作用小、患者顺应性良好的特性，将其用于药物、保健品或食品的新开发。

[0027] 本发明实施例提出巴西木素在制备用于预防和/或治疗以α-突触核蛋白的聚集沉淀为特征的疾病的药物中的用途。优选的，本发明实施例还提出巴西木素作为α-突触核蛋白聚集抑制剂用于制备预防和/或治疗帕金森综合症的药物。帕金森综合症(PD)为一种常见的中老年人神经系统变性疾病，大部分PD患者主要病变发生在中脑黑质和纹状体中，其内存在路易小体(Lewy)。α-Syn含有NAC结构域并参与Lewy小体的形成，α-Syn 的聚集导致的基因点突变和扩增都可造成家族性帕金森病的发生。可见，本发明实施例提供的用途进一步促进了治疗帕金森综合症的研究进展。

[0028] 具体而言，巴西木素可以以水分散体系存在。换言之，巴西木素可以以水分散体系的形式服用，如针剂、注射液、软胶囊、饮料、口服液等形式。

[0029] 具体而言，巴西木素以浓度为2.5-100μM的巴西木素水分散体系存在。优选的，巴西木素以浓度为5-50μM的巴西木素水分散体系存在。具体可以为2.5μM、5μM、20μM、25μM、40μM，50μM，80μM、100μM等。

[0030] 本发明实施例还提出巴西木素作为α-突触核蛋白聚集抑制剂在制备保健品或食品中的用途。保健品和食品对人体的毒副作用相对较小，将其用于预防PD具有良好效果。

[0031] 下面参照具体实施例进一步阐述巴西木素在抑制α-突触核蛋白聚集中的用途。

[0032] 实施例1：不同浓度巴西木素与α-Syn共培养不同时间后培养物的硫黄素(ThT)荧光强度变化

[0033] 首先，重组α-Syn蛋白大肠杆菌菌株由课题组前期构建，经诱导表达、纯化，最终获得纯度达95％以上的α-Syn蛋白，冻干后置于-20℃储存，得纯化冻干的α-Syn。向纯化冻干的α-Syn中加入TBS缓冲溶液，超声10min使之充分溶解，以16000xg的速度离心20min去除已经发生聚集的多肽，然后取上清液体积的75％，测定蛋白浓度。将上述α-Syn蛋白用TBS稀释，得浓度为50μM的α-Syn母液。

[0034] 其次，称取40mgThT溶于500mL Tris-HCl缓冲液(TBS，tris buffered saline，三乙醇胺缓冲盐水溶液，其中三羟甲基氨基甲烷(Tris buffer)浓度为20mM，NaCl浓度为 150mM，PH＝5.0)配制，得浓度为250μM的ThT母液。

[0035] 再次，称取0.3mg巴西木素溶于1mL过膜水中，得浓度为1mM的巴西木素母液。

[0036] 将上述所得α-Syn母液与巴西木素按梯度稀释，获得巴西木素终浓度分别为5μM， 10μM，50μM的α-Syn溶液(其中α-Syn的终浓度为50μM)，加入1.5mL灭菌的EP管中，37℃震荡培养得培养液，不同时间(0h，24h，48h，72h，96h，120h)分别吸取等份10μLα-Syn培养液加入
90μL ThT母液。

[0037] 测定其在440nm处激发波长和480nm处发射波长下的荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图，结果如图1所示。

[0038] 参阅图1，α-Syn的ThT荧光图为“S”形曲线，存在滞后期(0～20h)，快速增长期(20h～92h)和稳定平台期(92h～120h)，加入巴西木素后α-Syn的ThT荧光强度明显下降，且ThT荧光下降程度与加入的巴西木素的浓度呈正比，加入巴西木素的浓度越大，荧光抑制效果越强，说明巴西木素有效抑制了α-Syn的聚集。

[0039] 实施例2：用MTT比色法检测不同浓度的巴西木素与α-Syn共培养24h后培养物对 PC12的细胞毒性

[0040] 细胞毒性实验中使用的细胞为鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株(PC12)。

[0041] 首先，取低分化细胞，用含有10％胎牛血清和1％青霉素一链霉素的培养基进行培养，并向培养基中加入神经细胞生长因子(nerve growth ractor，NGF)，使其终浓度为50ng/mL， 5％CO2，37℃培养3天。观察到PC12细胞在NGF诱导下长出较长的突起，成为高分化细胞后向培养瓶中加入含有0.25％胰酶的溶液对高分化细胞进行消化，再用含有10％胎
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牛血清和1％青霉素一链霉素的DMEM培养基以适当浓度稀释细胞，以5×10cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔90μL。5％CO2，37℃培养24h。

[0042] 其次，配制巴西木素终浓度分别为5μM，10μM，50μM的α-Syn溶液(其中α-Syn 的浓度均为50μM)，其中α-Syn的处理方法与实施例1相同，37℃培养90h。

[0043] 将上述老化好的α-Syn和加入不同浓度的巴西木素的α-Syn溶液加入到已经培养 24h的含有PC12的96孔板中，10μL/孔。空白对照孔中为不加巴西木素和α-Syn溶液，而加入PBS缓冲液10μL/孔。最终使加药孔每孔中巴西木素终浓度为2.5μM，5μM，10μM，α-Syn的终浓度为5μM，即α-Syn：巴西木素分别为2:1、1:1、1:2。细胞在培养箱中以 5％CO2，37℃培养48h后，加入10μL/孔的MTT溶液，使得培养基中的MTT终浓度为 0.5mg/mL。5％CO2，37℃条件继续培养4h。

[0044] 移除96孔板中溶液，每孔加入100μL的DMSO 37℃培养10min，检测570nm处吸光值。将培养基中不含α-Syn和巴西木素孔的试验组作为空白对照组，记为细胞活性为 100％，然后将其作为对照计算加药组的细胞存活率(图2)。实验中每个巴西木素浓度梯度设置6个复孔。参阅图2，当只有α-Syn单独存在时，细胞存活率为74.8％。而加入不同浓度的巴西木素(2.5μM，5μM，10μM)后细胞存活率提高到81.3％、88.1％、95.9％，加入的巴西木素的浓度越大，毒性缓解作用越强，说明巴西木素能够有效抑制α-Syn产生的细胞毒性。

[0045] 实施例3：不同浓度巴西木素与α-Syn共培养不同时间后培养物的二级结构变化[0046] 首先，配制巴西木素终浓度分别为0μM，25μM，50μM，100μM的α-Syn溶液500μL (其中α-Syn的浓度均为50μM)，其中α-Syn的处理方法与实施例1相同，37℃培养90h。

[0047] 其次，配制含有不同浓度巴西木素的α-Syn溶液。取500μL培养液加入光程0.1mm 的CD检测池中进行检测，波长扫描范围是190～260nm，带宽2nm，扫描速度是100nm/min，实验结果为三次扫描平均值，参阅图3。

[0048] 由图3(a)可得，培养0天时，在仅存在α-Syn的对照组，溶解后未培养的药物在222nm 左右有一负峰，说明培养0h时，存在少量的β-折叠结构。

[0049] 由图3(b)可得，培养6天时，随着培养时间的延长，不加巴西木素的培养液中，α-Syn 的结构由α-螺旋转变为典型的β-折叠结构；但当向α-Syn中加入不同浓度的巴西木素以后，在220nm左右存在一个负峰同时在200nm以下出现一个正峰，说明二级结构向β- 折叠结构转化，但与只有α-Syn的培养液来说β-折叠结构程度较轻，而且随着加入巴西木素的浓度越大，缓解程度越强，可以说明巴西木素可以缓解α-Syn结构的转变。

[0050] 实施例4：巴西木素用于保健品的制备

[0051] 重量份组成为(每份为0.01g)：巴西木素1份、维生素A 10份、维生素B1 10份、维生素B2 10份、维生素C 10份、维生素H 10份、硫酸亚铁5份、氧化锌1份。

[0052] 引用时加水1L冲服。

[0053] 使用该保健品与α-Syn的制得的混合溶液进行荧光强度测试，与对照组(未添加巴西木素的保健品与α-Syn形成的溶液)进行比较，加入巴西木素后α-Syn的荧光强度明显下降，说明巴西木素有效抑制了α-Syn的聚集。

[0054] 实施例5：巴西木素用于饮料的制备

[0055] 重量份数为：巴西木素0.01份、柠檬酸50份、低聚糖25份、水1000份。

[0056] 通过溶解活性组分，混合，在85℃下搅拌1h，过滤，然后将所有组分填装进瓶中进行灭菌制得健康饮料。

[0057] 使用该饮品与α-Syn的混合溶液进行荧光强度测试，与对照组(未添加巴西木素的饮品与α-Syn形成的溶液)进行比较，加入巴西木素后α-Syn溶液的荧光强度明显下降，说明巴西木素有效抑制了α-Syn的聚集。

[0058] α-Syn聚集抑制剂是PD治疗新药开发的主要热点，通过抑制α-Syn聚集，从而预防或治疗PD的产生，并且相关文献中(Entacapone and Tolcapone,Two CatecholO-Methyltransferase Inhibitors,Block Fibril Formation of-Synuclein andβ-Amyloid and Protect against Amyloid-induced Toxicity,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，VOL.285,NO.20,pp.14941–14954,May 14,2010)中也曾报道α-Syn聚集抑制剂对治疗或预防PD有重要影响。本发明提出了巴西木素在制备抑制α-突触核蛋白聚集的药物的用途，并将其应用于α-Syn聚集和细胞毒性抑制实验，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

[0059] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。