一种岷江百合LrPAL-1基因及其应用

摘要

本发明公开了一种岷江百合LrPAL‑1基因及其应用，所述LrPAL‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明将含有LrPAL‑1基因的过表达载体转入烟草中，获得的转基因烟草植株木质化程度增加，提高了植物的抗倒伏能力，特别是可用于维持百合鲜切花的直立状态；并且转基因植物对病原菌灰葡萄孢和链格孢菌具有明显抑制的作用；同时本发明通过功能基因组学研究证明岷江百合LrPAL‑1基因具有改变植株叶片形态的重要生物学功能。本发明为百合属植物的分子遗传改良提供了一个重要靶点，对于具有观赏价值和景观生态价值的植物新品种的培育及生产均具有重要的价值和意义，也为培育出具有抗倒伏和抗病原菌双重价值的百合新种质提供技术支撑。

权利要求

1.岷江百合LrPAL‑1基因在抑制灰葡萄孢菌和/或链格孢菌生长中的应用，其特征在于，所述岷江百合LrPAL‑1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.岷江百合LrPAL‑1基因在促进植物叶片增生褶皱中的应用，其特征在于，将岷江百合LrPAL‑1基因应用于烟草中；岷江百合LrPAL‑1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.岷江百合LrPAL‑1基因在调控植物抗倒伏性中的应用，其特征在于，将岷江百合LrPAL‑1基因应用于烟草中；所述岷江百合LrPAL‑1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：向受体植物中导入岷江百合LrPAL‑1基因，得到转基因植物；所述岷江百合LrPAL‑1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性增强或抗倒伏性增强或叶片形态发生变化；所述植物为烟草。

说明书

一种岷江百合LrPAL‑1基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种岷江百合LrPAL‑1基因及其应用。

背景技术

[0002] 百合是多年生草本球根类植物，在世界各地均有分布。百合作为世界上重要的观赏花卉之一，具有重要的经济价值。我国是世界百合的分布中心，具有丰富的野生百合资源，约有55种（Flora of China 24: 135–149. 2000.）。岷江百合（Lilium regale Wilson）是百合科百合属中重要的野生种质资源，广泛分布于我国四川岷江流域（杨利平和符勇耀著，中国百合资源利用研究[M]，哈尔滨：东北林业大学出版社, 2018.11）。相对于模式植物，岷江百合的生长发育调控机制具有复杂性和特殊性。前人研究表明，岷江百合对百合真菌病和病毒病具有较强的抗性，目前已经从岷江百合中获得多个逆境胁迫相关基因，如Lr14‑3‑3、LrPR10、LrbZIP1和LrWRKY1等（Li H., et al., Sci. Hort. 2014, 168:9‑16; He H., et al., Genes Genom. 2014, 36:497‑507; Zhang N.N., Genes Genom. et al., 2014, 36:789‑798; Han Q., et al., Sci. Hort. 2016, 198:370‑378；专利号201610001896.4），为了丰富基因库这些抗性基因还远远不够，值得进一步的深入探究岷江百合中更多新的高效抗菌基因。

[0003] 叶片是植物进行光合作用的主要场所，是植物生长发育的关键器官。叶片形态的改变，能调整叶片的透光性，从而改变植株的光合效率，另外在花卉植物叶型等形态上表现出一系列新颖奇特的叶型也具有良好的观赏性。近几年，开展了许多关于植物叶片型态生长发育的分子调控机制的相关研究，据已有的报道表明，miRNA、转录因子、植物激素等在叶片的生长发育中发挥着非常重要的调控作用。同时对于观赏植物的高度控制不好的话，易倒伏，主要是由于茎杆不够粗壮挺拔，直立性弱，作为鲜切花品种不利于管理、采收和运输，并且在进行瓶插时也不方便。因此，通过遗传改良促进叶片生长发育和抗倒伏性，对于具有观赏价值和景观生态价值的植物新品种的培育及生产均具有重要的价值和意义。

[0004] 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia‑lyase, PAL, E.C.4.3.1.5)是一种只存在于植物及微生物细胞内的酶，它是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶。苯丙烷类代谢途径是生物特别是植物代谢中一条很重要的途径，一切含苯丙烷骨架的物质都是由这一途径直接或间接生成。苯丙烷类代谢可生成类黄酮、木质素等多种次生代谢产物，这些次生产物在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用。研究表明，在不同植物中， PAL家族成员数量不同，如拟南芥中含有4个PAL基因（Cochrane FC, Davin LB, Lewis NG. 2014. The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family: kinetic characterization of the four PAL isoforms. Phytochemistry 65(11):1557‑1564），杨树中含有5个PAL基因；其中，杨树PtPAL1和PtPAL3主要参与类黄酮、单宁等物质的合成调控；而PtPAL2、PtPAL4、PtPAL5主要在木质部中高表达，可能参与调控木质素合成途径（Shi R, Shuford CM, Wang JP, et al., 2013. Regulation of phenylalanine ammonia‑lyase (PAL) gene family in wood forming tissue of Populus trichocarpa. Planta 238(3):487‑497）。

[0005] 目前，有关百合PAL基因功能的研究鲜有报道，有研究发现，麝香百合LlPAL1基因在切花茎基部与酚类物质代谢有关（曹锦萍，李红梅，吴志成等，麝香百合LlPAL1基因的克隆及其在切花茎基端的表达分析，中国园艺学会2014年学术年会论文摘要集），而关于岷江百合PAL基因功能的研究未见报道。进一步，在百合属植物中，哪些PAL基因主要参与类黄酮合成途径，哪些百合PAL基因参与木质素合成途径等仍不清楚。另外，有关百合PAL同时参与植物抗病、抗倒伏和叶型发育的研究未见报道。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的空白，本发明的目的在于提供一种岷江百合LrPAL‑1基因，为百合属植物的遗传改良提供一个新的木质素合成调控基因，为植物抗病基因工程提供更多的选择可能性，同时也为通过分子手段改良百合植物或鲜切花抗倒伏能力及叶片特殊形态提供支撑。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种岷江百合LrPAL‑1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008] 本发明还提供了上述岷江百合LrPAL‑1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明还提供了含有上述LrPAL‑1基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

[0010] 所述重组载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1302、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301‑UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。

[0011] 本发明还提供了上述LrPAL‑1基因或所述LrPAL‑1蛋白或所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下(C1)或(C2)或(C3)中的应用：

[0012] (C1)调控植物抗病原真菌性；

[0013] (C2)调控植物叶片发育；

[0014] (C3)调控植物抗倒伏性。

[0015] 进一步，所述植物病原真菌为灰葡萄孢菌和/或链格孢菌。

[0016] 进一步，所述调控植物叶片发育为改变叶片形态，促进植物叶片增生褶皱。

[0017] 本发明还提供了一种提高植物抗病性或提高植物抗倒伏或改变植物叶片形态的方法，包括使受体植物中所述LrPAL‑1蛋白质的表达量和/或活性提高的步骤。

[0018] 本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入所述LrPAL‑1基因，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性增强或抗倒伏性增强或叶片形态发生改变。

[0019] 进一步，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为百合属植物或烟草等。

[0020] 相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

[0021] 1、本发明首次克隆了岷江百合LrPAL‑1基因全长序列，获得其编码的蛋白序列，并将该蛋白在烟草中表达，试验结果表明该蛋白可以增加转基因植物的木质化程度，提高植物的抗倒伏能力，特别是维持百合鲜切花的直立状态。同时，该蛋白可以改变叶片形态，表现出增生褶皱现象。本发明为百合属植物的分子遗传改良提供了一个重要靶点，对于具有观赏价值和景观生态价值的植物新品种的培育及生产均具有重要的价值和意义。

[0022] 2、本发明通过抗菌试验分析证明LrPAL‑1基因具有提高百合属植物抗病原真菌的能力，特别针对灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)和链格孢菌(Alternaria alternate)具有较强的抑制作用，为百合及其它植物抗病基因工程提供了一个有效的抗病基因。通过本发明方法，为今后培育出同时具有抗倒伏和抗病原菌双重功效的百合属新种质奠定了基础。因而，本发明具有着很强的应用前景和推广价值。

附图说明

[0023] 图1为岷江百合LrPAL‑1基因的PCR扩增电泳图；

[0024] 图2为岷江百合LrPAL‑1蛋白与已公布的RNA测序拼接序列（KX842518.1）的氨基酸序列比对图；

[0025] 图3为转基因烟基因组DNA的PCR检测结果电泳图，泳道1‑16为T0代转基因株系，M为DL2000，WT为阴性对照，CK为空白对照，P为阳性对照；

[0026] 图4为转基因烟草阳性植株的鉴定分析，WT为野生型烟草，OX‑L1、OX‑L7、OX‑L9为3个代表转基因烟草阳性株系；其中A图为T1代阳性转基因烟草中LrPAL‑1基因转录水平的定量表达分析图；B图为T1代阳性转基因烟草叶片的PAL酶活检测结果图，数据分析采用邓肯多重比较法（Duncan test），不同字母表示差异显著（P<0.05）；

[0027] 图5为T2代阳性转基因烟草与野生型烟草的表型图；A图为野生型烟草植株（WT），B图为转基因烟草植株（PAL‑1‑OX）；

[0028] 图6为转基因烟草与野生型烟草的叶片表型图；A图为野生型（WT）和转基因（PAL‑1‑OX）烟草第3节叶片，B图为野生型（WT）和转基因（PAL‑1‑OX）烟草第4节叶片；

[0029] 图7为转基因烟草与野生型烟草茎的横切面木质素染色分析；WT为野生型烟草第3节茎横切面的间苯三酚染色图，OX‑L1，OX‑L7和OX‑L9为3个独立的转基因株系第3节茎横切面的间苯三酚染色图；图中标尺代表实际长度200μm；

[0030] 图8为转基因烟草离体叶片抗灰葡萄孢菌效果分析；其中图A为野生型烟草和转基因烟草离体叶片抗灰葡萄孢菌示意图，图B为灰葡萄孢菌侵染烟草离体叶片3天后受侵染的面积比较，数据分析采用邓肯多重比较法（Duncan test），不同字母表示差异显著（P<0.05）；

[0031] 图9为转基因烟草离体叶片抗链格孢菌效果分析；其中图A为野生型烟草和转基因烟草离体叶片抗链格孢菌示意图，图B为链格孢菌侵染烟草离体叶片7天后受侵染的面积比较，数据分析采用邓肯多重比较法（Duncan test），不同字母表示差异显著（P<0.05）；

[0032] 图10为野生型和转基因烟草叶片的总黄酮含量分析；其中WT为野生型烟草，OX‑L1，OX‑L7和OX‑L9为3个独立的转基因烟草株系，数据分析采用邓肯多重比较法（Duncan test），不同字母表示差异显著（P<0.05）。

具体实施方式

[0033] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

[0034] 实施例1 岷江百合LrPAL‑1全长基因克隆及序列分析

[0035] 以含灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的孢子溶液侵染岷江百合（现蕾期）叶片，取不同时间（6h、12、24h和48h）的叶片为实验组，以不含孢子溶液处理叶片为对照组。采用TRIzol™ Plus RNA Purification Kit （12183555，Invitrogen™），按说明书步骤提取总RNA，利用DNase I（18047019，Invitrogen™）去除残余的微量DNA，并用微分分光光度计测定RNA的浓度，将一部分高质量的RNA送往华大基因BIOSEQ500测序平台测序分析；另一部分RNA保存备用。

[0036] 通过转录组测序分析，初步获得3个编码岷江百合苯丙氨酸解氨酶（LrPAL）基因的Unigene（Unigene3248_All, Unigene14345_All, Unigene556_All）。其中，Unigene3248_All响应灰葡萄孢诱导后的表达水平最高，为对照组的4.3倍，命名为 LrPAL‑1。

[0037] 取约2.0μg岷江百合叶片总RNA，按照PrimeScript II first‑strand cDNA synthesis kit (6210A, Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。

[0038] PCR扩增体系：2xfast pfu master Max 10ul，正向引物(LrPAL‑1‑F, 10μM) 1μL，反向引物(LrPAL‑1‑R, 10μM) 1μL，模板（cDNA）1μL，无菌ddH2O补足至20μL。

[0039] 正向引物和反向引物为：

[0040] LrPAL‑1‑F：5’‑ATGGCATCCAAGGACAGCT ‑3’

[0041] LrPAL‑1‑R：5’‑TCAGAGATTCCAGTACCCCCT ‑3’

[0042] PCR反应程序为：预变性94℃，5min；94℃，30s；60℃，40s；72℃，1min45s，38个循环；72℃，10min。

[0043] 获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所示，在紫外光照射下，在2kb与3kb之间可以观察到一条特异性的扩增条带。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（9672，Takara）纯化后备用。

[0044] 利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pMD20‑T vector（6019，Takara）相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有氨苄霉素（100mg/L）的LB培养板上挑取2‑3个阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，岷江百合LrPAL‑1全长基因序列如SEQ ID NO.1所示，含有2274 bp的开放阅读框（含终止密码）。

[0045] 根据SEQ ID NO.1，通过DNAman软件翻译，获得岷江百合LrPAL‑1的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示，含有757个氨基酸（*表示终止信号）。借助蛋白亚细胞定位在线分析（WoLF PSORT）显示，LrPAL‑1在植物细胞中的表达定位可能性依次为 chlo: 6, E.R.: 3, cyto: 1.5, cyto_nucl: 1.5, mito: 1, plas: 1, golg: 1。通过cNLS Mapper在线预测表明，在LrPAL‑1蛋白的C端具有核定位信号序列（VGSRIKKCRTW）。通过ExPASy ProtParam在线分析表明，LrPAL‑1的分子量约为82.4KDa，等电点为6.17。将LrPAL‑1全长核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与经过RNA测序获得的拼接序列岷江百合PAL（GenBank: KX842518.1和ASV46344.1）最接近，相似度分别为95.07% (2162/2274) 和97.36%(737/757)，分别存在112个核苷酸和20个氨基酸序列的区别（氨基酸序列比对如图2所示）。岷江百合LrPAL‑1的氨基酸序列与其他植物PAL氨基酸序列相比，也有不同程度的相似性，比如：与野芭蕉PAL（XP_009417692.1）相似度为82.06%，与海枣PAL（XP_008791889.1）相似度为79.97%，与樟树PAL（RWR79518.1）相似度为73.33%，与麝香百合LlPAL‑1(GQ165724.1)相似度为54.46%等。从比对结果来看LrPAL‑1基因为新基因，未见任何报道。

[0046] 实施例2 植物过表达载体的构建

[0047] （1）构建pART‑CAM::LrPAL‑1过表达载体

[0048] 根据岷江百合LrPAL‑1全长基因序列（SEQ ID NO.1），设计引物LrPAL‑1‑inf‑F和LrPAL‑1‑inf‑R，引物中引入无缝克隆（In‑fusion）载体接头序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，以LrPAL‑1‑inf‑F和LrPAL‑1‑inf‑R为引物进行基因LrPAL‑1的特异性扩增。

[0049] 所述引物序列如下：

[0050] LrPAL‑1‑inf‑F: 5’‑GGAGAGGACACGCTCGAGATGGCATCCAAGGACAGCT‑3’[0051] LrPAL‑1‑inf‑R: 5’‑TTAAAGCAGGACTCTAGATCAGAGATTCCAGTACCCCCT‑3’[0052] 其中，下划线处为In‑fusion克隆载体接头序列。

[0053] PCR扩增体系：2xfast pfu master Max 10ul，正向引物(LrPAL‑1‑F, 10μM) 1μL，反向引物(LrPAL‑1‑R, 10μM) 1μL，模板（DNA）1μL，无菌ddH2O补足至20μL。

[0054] PCR反应程序为：预变性94℃，5min；94℃，30s；60℃，40s；72℃，1min45s，38个循环；72℃，10min。

[0055] 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）的说明书步骤回收纯化，即获得目的基因片段。

[0056] 用XbaI 和XhoI 双酶切植物双元表达载体pART‑CAM 质粒。酶切体系为：pART‑CAM vector 1μg； XbaI 2μL；XhoI 1μL；10xTango buffer 4μL；无菌ddH2O补足至20μL；30℃反应1.5h，37℃反应1.5h，65℃，20min。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体大片段。

[0057] 利用无缝克隆技术（In‑fusion HD Cloning Kit，Takara）构建pART‑CAM::LrPAL‑1过表达载体。

[0058] 重组反应体系为：

[0059] Purifed PCR fragment (回收的LrPAL‑1目的片段) 50ng；Linearized vector (pART‑CAM) 100‑150ng；5x In‑fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH2O补足至10μL。混匀后在37℃放置30 min。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有链霉素（50μg/mL）的LB培养基上，通过阳性克隆筛选和测序，获得正确的含LrPAL‑1基因片段的重组表达载体pART‑CAM::LrPAL‑1。重组表达载体中目的基因LrPAL‑1的5’端位于组成型启动子P35S下游，它能使LrPAL‑1基因过量表达；LrPAL‑1的3’端组装有OCS终止子，可以有效终止融合基因的转录。在重组表达载体上组装有nptII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因nptII整合至植物基因组中。

[0060] 采用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒抽提试剂盒（DP103, TIANGEN）提取并纯化上述大肠杆菌中的pART‑CAM::LrPAL‑1质粒。用液氮冻融法将上述构建的pART‑CAM::LrPAL‑1过表达载体转入农杆菌EHA105（AC1010, 上海唯地）感受态细胞，获得阳性克隆加入20%左右的甘油置于‑80℃保存备用。

[0061] 实施例3 农杆菌介导的烟草转化及转基因阳性系筛选

[0062] 将烟草（Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1）种子经无菌水冲洗干净，75%乙醇消毒1 min，次氯酸钠溶液(有效氯为2%)消毒15min，无菌水冲洗3‑5次，无菌滤纸吸干种子表面的水分，接种于LS培养基（PH 5.8）上。

[0063] 将甘油菌在YEB固体培养基（50μg/mL链霉素+20μg/mL利福平）上划线，28 ℃培养两天后，挑取单克隆接种到5ml的YEB液体培养基（50μg/mL链霉素+20μg/mL利福平）中，28℃，220rpm恒温震荡培养过夜至OD600约为0.6时，5000rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用MS液体培养基重悬至OD600=0.4。

[0064] 1 2个月后取无菌细嫩叶片，去掉边缘及主脉，再剪成0.5*0.5的小块。将剪好的外~植体置于重悬好的农杆菌菌液中，轻柔摇晃5min，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将其置于共培养培养基（MS+6‑BA 1mg/L PH 5.8）上黑暗培养2‑3天。共培养后，将外植体转移到芽诱导分化培养基（MS＋6‑BA 1mg/L＋Timentin 300mg/L＋Kan 100mg/L pH5.8）上。诱导生芽，每两周更换一次培养基。

[0065] 当抗性芽长到2cm时切下，转入生根培养基中（1/2MS＋Timentin 300 mg/L+IAA 0.1mg/L+ Kan 100mg/L PH 5.8），待形成完整小植株时，切取部分叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，用基因特异引物（35S‑F1和LrPAL‑1‑R1）检测阳性植株。

[0066] 35S‑F1：5'‑TGACGCACAATCCCACTATC‑3'

[0067] LrPAL‑1‑R1：5'‑GTGAGAAGTCCGGCGATATAC‑3'

[0068] PCR扩增体系为2×TransDirect PCR SuperMix(+dye) 10ul，正向引物(35S‑F, 10μM) 1μL，反向引物(LrPAL‑1‑R2, 10μM) 1μL，模板（DNA）1μL，无菌ddH2O补足至20μL。

[0069] PCR反应程序为：预变性94℃，5min；94℃，30s；62℃，40s；72℃，45s，38个循环；72℃，10min。

[0070] PCR检测结果显示（图3），在野生型植株（WT）中检测不到目标片段存在，只有在转基因植株及阳性对照中扩增获得目标片段（约776bp），表明外源基因LrPAL‑1已经导入烟草基因组。本试验一共得到T0代阳性植株有9株，分别为T0‑1、T0‑3、T0‑5、T0‑7、T0‑9、T0‑11、T0‑12、T0‑14和T0‑16。

[0071] 实施例4：转基因烟草的表型观察及真菌抗性分析

[0072] 从T0代阳性植株中收取种子，继续播种，获得T1代转基因烟草株系。使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(9769, Takara)试剂盒分别从野生型和转基因烟草TM中提取总RNA，利用PrimeScript  RT reagent Kit with gDNA Eraser(PR047A,TaKaRa) TM
反转录获得cDNA，以烟草Actin基因为内参，并用SYBR Premix Ex Taq  II(PR820A, TaKaRa)试剂进行qRT‑PCR检测，分析转基因阳性株系与野生型烟草中LrPAL‑1基因表达水平。

[0073] 检测Actin基因引物为：

[0074] Actin‑qF: 5'‑ AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC‑3'

[0075] Actin‑qR:5'‑ TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA‑3'

[0076] 检测LrPAL‑1基因引物为：

[0077] LrPAL‑1‑qF：5'‑GTGACTACTACAATGACGGCT‑3'

[0078] LrPAL‑1‑qR：5'‑ TCCATCGCCTGGCACAGACC‑3'

[0079] 结果如图4A所示，与野生型植株（WT）相比，在3个代表转基因株系(OX‑L1、OX‑L7和OX‑L9)中目的基因岷江百合LrPAL‑1均异源上调表达，并且OX‑L7表达水平为最高，而在野生型植株（WT）中检测不到LrPAL‑1的表达，表明LrPAL‑1已经导入烟草基因组并成功转录表达。

[0080] 为进一步确认转基因株系，采用常规苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定方法，取野生型和转基因烟草叶片样品3 g，加入10 ml 0.1 mol/L硼酸缓冲液（PH=8.8，含5 mmol/L 巯基乙醇），以及0.3 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），石英砂少许于研钵中磨成匀浆，匀浆液经10000 r/min 离心15 min，取上清液定容至10 ml供测定酶活使用。取上清液1 ml，苯丙氨酸1 ml，蒸馏水2ml，空白对照不加底物，代之以1 ml含巯基乙醇的硼酸缓冲液。置30℃恒温水浴保温60 min，用对照调零，于分光光度计测量吸光值，波长为290nm。以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位（U）。结果显示（图4B），3个代表转基因株系(OX‑L1、OX‑L7和OX‑L9)中PAL酶活均显著高于野生型烟草，其中OX‑L7的PAL酶活为最高。

[0081] 在温室中正常培养2个月的烟草植株表型观察如图5和图6所示，转基因烟草叶片呈现明显增生褶皱现象，与野生型有显著区别。

[0082] 采用常规生化方法，分别取野生型烟草和转基因烟草的第3节茎横切面，参考李超锋（李超锋，杨树转录因子PtoMYB128和PtoMYB74在次生壁生物合成的功能研究，中国科学院大学博士学位论文，2018年12月）的方法，利用间苯三酚染液做木质素染色分析，结果表明（图7），3个代表转基因株系(OX‑L1、OX‑L7和OX‑L9)的茎中木质化程度相比于野生型植株（WT）显著增加。可见，过表达LrPAL‑1基因促进了烟草茎中木质素合成和积累，进而能增加烟草的抗倒伏作用。

[0083] 采用常规生化方法，分别取相同位置的野生型和转基因烟草离体叶片，均匀放置于培养皿中。用针尖在叶片相同位置刺2 3个微型伤口，利用打孔器从培养1周左右的灰葡~萄孢菌平板上取相同大小病原菌，直接接种于叶片伤口处，保湿，并在25℃常温放置3天左右。结果发现（图8A，图8B），相比于野生型烟草叶片，3个代表转基因株系叶片受灰葡萄孢菌侵染较小，或者说几乎没有受到伤害，而灰葡萄孢菌大面积侵染野生型烟草叶片。同样取相同位置的野生型和转基因烟草离体叶片，均匀放置于培养皿中。用针尖在叶片相同位置刺2
3个微型伤口，利用打孔器从培养1周左右的链格孢菌平板上取相同大小病原菌，直接接种~
于叶片伤口处，保湿，并在25℃常温放置7天左右。结果显示（图9A），3个代表转基因株系的叶片受链格孢菌侵染较小，而野生型烟草叶片中链格孢菌侵染范围较大。链格孢菌在野生型烟草叶片中的侵染面积约为转基因株系叶片的4倍（图9B）。综上，结果表明，过表达LrPAL‑1基因提高了转基因烟草对病原菌灰葡萄孢和链格孢等的抗性。

[0084] 另外，参考滕井通等（滕井通，詹小龙，宫坤等，响应面优化超声‑微波协同提取石榴叶中总黄酮工艺的研究，2015，34（7）：744‑750）的方法，分别取1 g野生型和转基因烟草叶片，液氮充分研磨，75%乙醇定容至10 ml，浸提24 h；取提取液1 ml，分别加入质量分数5% NaNO2溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min后加入质量分数10% Al（NO3）3溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min后加入质量分数4% NaOH溶液4 ml，最后用75%乙醇定容至10 ml，摇匀，静置12 min，在2
508 nm处测定吸光值，根据线性回归方程 A=11.201C‑0.013，R=0.9998换算成样品中的黄酮含量。结果如图10所示，尽管OX‑L9中总黄酮的含量有轻微的增加，总体而言，转基因烟草株系叶片中的总黄酮含量与野生型（WT）并没有显著区别，表明LrPAL‑1不参与类黄酮途径的调控。

[0085] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。