烟草ATP合酶γ链NtATPG及其应用

摘要

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草ATP合酶γ链NtATPG及其应用专利申请。NtATPG基因由1134个碱基构成，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示。NtATPG蛋白由377个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本申请中，发明人通过对特定烟草ATP合酶γ链NtATPG的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

权利要求

1.烟草ATP合酶γ链NtATPG的编码基因NtATPG在烟草叶片甘油酸物质含量调控中的应用，其特征在于，所述调控是利用基因沉默技术，通过下调烟草ATP合酶γ链NtATPG表达量，来下调烟叶中甘油酸物质含量；

所述烟草ATP合酶γ链NtATPG的编码基因NtATPG，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.烟草ATP合酶γ链NtATPG在烟草叶片甘油酸物质含量调控中的应用，其特征在于，烟草ATP合酶γ链NtATPG与烟草叶片中甘油酸物质含量相关，所述调控是降低烟草ATP合酶γ链NtATPG表达后，烟草叶片中甘油酸物质含量明显降低；

所述烟草ATP合酶γ链NtATPG，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.利用烟草ATP合酶γ链NtATPG的编码基因NtATPG的烟草品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术，构建含有编码基因NtATPG的病毒诱导沉默载体，转化烟草，筛选获得甘油酸含量下调的烟草品种；

所述烟草ATP合酶γ链NtATPG的编码基因NtATPG，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

烟草ATP合酶γ链NtATPG及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草ATP合酶γ链NtATPG及其应用专利申请。

背景技术

[0002] 人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana) 有60 多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotiana rustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。

[0003] 作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。也因此，为满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须不断提高烟叶品质和安全性。

[0004] 有机酸是烟草化学组成中一个重要的组成部分。烟草中的有机酸主要是指除氨基酸以外的有机酸, 其种类繁多,含量差异大, 总含量一般为12% 16%，且大部分以与碱金属~或有机碱合成盐或以酯类的形式存在。烟草中有机酸通常分为挥发酸、半挥发酸和非挥发酸。已有研究，普遍认为有机酸不仅在烟草生长发育过程中起着重要的作用,而且对烟叶和卷烟的质量有着重要的影响。一般而言，有机酸可以增加烟气酸性, 醇和烟气,并使烟味变得甜润舒适。尤其是挥发性有机酸, 尽管其含量很低（最多达0.1% 0.2%, 有的甚至只有~
0.01% 0.05%）, 但其对烟叶感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸。
~

[0005] 总之，随着烟草基因工程深入，结合有机酸类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中有机酸类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控奠定良好的技术基础。

发明内容

[0006] 基于烟草甘油酸物质含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草ATP合酶γ链NtATPG基因及其在烟草甘油酸物质含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定基础。

[0007] 本申请所采取的技术方案详述如下。

[0008] 烟草ATP合酶γ链NtATPG的编码基因NtATPG，含有1134个碱基，碱基序列具体如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 所述编码基因NtATPG在叶片甘油酸物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草ATP合酶γ链NtATPG表达量，来调节控制烟叶中甘油酸物质含量情况。

[0010] 所述编码基因NtATPG的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：

[0011] （1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；

[0012] （2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：

[0013] NtATPG‑F：5’‑ GGGTAATTCTTATTTCCTCC ‑ 3’，

[0014] NtATPG‑R：5’‑ TCAGTTTCCCTTCCTTTGTT ‑ 3’。

[0015]  烟草ATP合酶γ链NtATPG，由377个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0016] 所述烟草ATP合酶γ链NtATPG在叶片甘油酸物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中甘油酸物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中甘油酸物质含量明显降低。

[0017] 利用所述编码基因NtATPG的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtATPG基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得甘油酸含量变化的烟草新品种；

[0018] 具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtATPG基因的表达使其沉默，NtATPG基因沉默植株中甘油酸物质含量显著下降，进而获得甘油酸含量下降的植物新品种。

[0019] 换言之，一种培育低甘油酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtATPG基因的表达使其沉默，NtATPG基因沉默的新烟草品种植株中甘油酸物质含量显著下降。

[0020] 一般而言，挥发性酸由于其挥发性在卷烟抽吸过程中可直接进入烟气, 对吃味和香气有良好的作用，因此作为挥发性的脂肪酸甘油酸对烟草的品质有重要影响。基于甘油酸的重要作用，对烟草甘油酸物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。本申请中，发明人通过对特定烟草ATP合酶γ链NtATPG的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育一定的应用基础和参考借鉴。

附图说明

[0021] 图1 为与对照植株相比，NtATPG基因沉默植株中该基因的相对表达量；

[0022] 图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的甘油酸含量比较。

具体实施方式

[0023] 下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

[0024] 生物材料：

[0025] 本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理；

[0026] 下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobacco rattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体）带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

[0027] 实验试剂：

[0028] LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10 g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；

[0029] YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL 1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；

[0030] 1M 2‑(N‑吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，‑20℃储存备用；

[0031] 200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，‑20℃储存备用。

[0032] 实施例1

[0033] 本实施例就烟草NtATPG基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

[0034] （1）烟草NtATPG基因克隆

[0035] 根据前期对于烟草基因组及相关NtATPG基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：

[0036] NtATPG‑F：5’‑ GGGTAATTCTTATTTCCTCC ‑ 3’，

[0037] NtATPG‑R：5’‑ TCAGTTTCCCTTCCTTTGTT ‑ 3’；

[0038] 以烟草K326叶片（先提取基因组，再反转录为cDNA）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtATPG基因；

[0039] PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；

[0040] 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

[0041] （2）构建重组TRV2‑ NtATPG载体

[0042] 将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；

[0043] 将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过培养夜；

[0044] 挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2‑ NtATPG。

[0045] 需要说明的是，

[0046] 烟草NtATPG基因，包括1134个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：

[0047] ATGTCTTGCTCAAATTTGACAATGTTGGTATCCTCAAAACCATCTCTTTCTGACTCCTCTGCACTTTCTTTCCGCTCTTCTGTCAACCCTTTTCAGCTTCCTAACCATAACTCATCAGGCCCTTCAAACCCCTCAAGATCATCATCAGTCACCCCTGTTCACTGTGGTCTCCGTGATCTACGTGATCGGATTGAATCAGTCAAGAACACCCAGAAAATTACTGAGGCTATGAAGCTTGTGGCTGCTGCTAAAGTCAGAAGAGCTCAAGAAGCTGTTGTGGGTGCTAGGCCTTTCTCTGAGACTTTGGTTGAGGTCCTTTACAACATCAATGAACAGCTTCAAACTGATGACATTGATGTTCCCCTCACCAAAGTTAGACCTGTCAAGAAAGTGGCTTTGGTTGTTGTCACTGGTGATCGTGGTCTATGTGGTGGTTTTAACAATTACCTCATCAAAAAAGCTGAGGCCAGGATTAGAGATTTGAAAGCTCTTGGCATTGAATACACTATTATCAGTGTTGGCAAAAAGGGTAATTCTTATTTCCTCCGTAGGCCTTACATTCCTGTAGATAAGTTCCTTGAAGGAAGCAATTTGCCCACTGCTAAAGATGCTCAGGCCATTGCTGATGATGTTTTTTCGCTTTTCGTGAGTGAAGAGGTTGACAAAGTTGAGCTTTTGTACACAAAGTTTGTGTCTTTAGTGAAATCTGAACCAGTGATTCACACCCTTCTTCCATTGTCACCAAAGGGAGAGATTTGTGACATCAATGGGAACTGTGTTGATGCAGCAGAAGATGAGTTCTTTAGGTTGACAACAAAGGAAGGGAAACTGACAGTGGAAAGAGATATTATGAGGACTAAGACAACTGATTTTTCGCCAATCTTGCAATTTGAGCAGGACCCTGTTCAGATTCTTGATGCCTTGCTTCCACTTTACTTGAACAGTCAAATCTTGAGGGCATTGCAGGAGTCATTAGCCAGTGAGCTTGCTGCTAGGATGAGTGCCATGAGCGCTGCAACAGATAATGCAACTGAGTTGAAGAAGAACCTTTCTAGAGCGTACAACAGACAGCGTCAGGCAAAGATTACAGGAGAAATATTGGAGATTGTTGCTGGTGCAGATGCCTTGGTTTAA。

[0048] 烟草ATP合酶γ链蛋白NtATPG，包括377个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：

[0049] MSCSNLTMLVSSKPSLSDSSALSFRSSVNPFQLPNHNSSGPSNPSRSSSVTPVHCGLRDLRDRIESVKNTQKITEAMKLVAAAKVRRAQEAVVGARPFSETLVEVLYNINEQLQTDDIDVPLTKVRPVKKVALVVVTGDRGLCGGFNNYLIKKAEARIRDLKALGIEYTIISVGKKGNSYFLRRPYIPVDKFLEGSNLPTAKDAQAIADDVFSLFVSEEVDKVELLYTKFVSLVKSEPVIHTLLPLSPKGEICDINGNCVDAAEDEFFRLTTKEGKLTVERDIMRTKTTDFSPILQFEQDPVQILDALLPLYLNSQILRALQESLASELAARMSAMSAATDNATELKKNLSRAYNRQRQAKITGEILEIVAGADALV。

[0050] 实施例2

[0051] 在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2‑ NtATPG载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

[0052] （1）转化农杆菌

[0053] 需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2‑GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：

[0054] 将TRV2‑GFP（载体对照）及TRV2‑ NtATPG的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。

[0055] （2）制备转染用菌液

[0056] 将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan 和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；

[0057] 取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD600 =1.0 ~ 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA重悬，调节OD600 =1.0 左右；

[0058] 最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。

[0059] （3）瞬时转化

[0060] 以3 4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）~中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

[0061] 进一步通过qRT‑PCR对NtATPG基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2‑ NtATPG的侵染植株中，NtATPG的表达量显著降低。

[0062] 进一步地，发明人对实验组（TRV2‑ NtATPG浸染植株）和对照组（TRV2‑GFP浸染植株）中的植物甘油酸含量情况进行了检测（检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019）），结果如图2所示。

[0063] 从图2结果可以看出，实验组中甘油酸含量与对照组相比均有显著下降，下降百分比可达86.45%。这进一步表明，通过沉默NtATPG基因，可对烟草叶片中植物甘油酸的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。