莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。本发明中发现莪术醇可直接与NQO2蛋白结合，抑制NQO2酶活，且发现NQO2蛋白的第126位、128位、161位或178位氨基酸突变丙氨酸后，NQO2与莪术醇不再结合且NQO2酶活性受到影响。因此，莪术醇可作为NQO2蛋白抑制剂，用于解决NQO2高表达所引起的肿瘤药物耐受方面的治疗。另外，本发明还提供了一种NQO2蛋白突变体，为NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸突变丙氨酸，为后续NQO2蛋白抑制剂或抗肿瘤药物方面的研究提供有效途径。

权利要求

1.莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：所述的NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：所述的莪术醇通过结合到NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸上，实现抑制NQO2蛋白表达的目的。

3.根据权利要求1所述的莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：编码所述NQO2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用，其特征在于：所述的莪术醇的使用浓度为100～200μM。

5.莪术醇作为NQO2蛋白抑制剂的应用，其特征在于：所述应用的环境为体外环境；

所述的NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

说明书

莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，特别涉及莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。

背景技术

[0002] 莪术醇(Curcumol)是莪术提取物中主要的活性成分之一[1]，其结构式如式I所示：

[0003]

[0004] 早先有相关报道莪术醇具有抑制肿瘤血管生成、诱导细胞凋亡、抗病毒、抗血栓、抗菌等功效[1]。在肿瘤相关的研究领域中，高浓度莪术醇对乳腺癌[2]、结直肠癌[3]、胃癌[4]、肝癌[5]、肺癌[6]等都有一定的抑制效果。但到目前为止，尚未有莪术醇靶标蛋白的相关报道。

[0005] 醌氧化还原酶2(NQO2)可以利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，将醌还原为氢醌，NQO2常被认为具有代谢还原与解毒的作用[7]，当NQO2与一些特定的小分子抑制剂相相结合时会导致ROS产生[8,9]。在肿瘤研究中已有报道指出NQO2在肝癌和肾癌中高表达，在我们的前期研究中发现，NQO2在肺腺癌病人癌组织中高表达，高表达NQO2的病人生存预后差。因此，开发在体内外均能发挥效应的NQO2蛋白的抑制剂，是很有必要的。

发明内容

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供莪术醇在制备NQO2蛋白抑制剂中的应用。

[0007] 本发明的另一目的在于提供一种NQO2蛋白突变体。

[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：莪术醇在制备NQO2(醌氧化还原酶2)蛋白抑制剂中的应用。

[0009] 所述的莪术醇通过结合到NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸位点上，实现抑制NQO2蛋白表达的目的。

[0010] 所述的NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 编码所述NQO2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

[0012] 所述的莪术醇的使用浓度为100～200μM。

[0013] 莪术醇作为NQO2蛋白抑制剂的应用(所述的应用为非疾病治疗目的，如体外环境下进行应用)。

[0014] 所述的NQO2蛋白抑制剂包括治疗有效量的莪术醇和药学上可接受的载体。

[0015] 所述NQO2蛋白抑制剂可制成各种形式的口服或注射制剂，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、滴丸剂、缓控释制剂、口服液、合剂、糖浆剂、液体注射剂、注射用粉剂和注射用片剂等。

[0016] 一种NQO2蛋白突变体，为NQO2蛋白的第126位，128位，161位和178位氨基酸中的至少一个氨基酸突变丙氨酸(即NQO2蛋白的第126位苯丙氨酸突变为丙氨酸，NQO2蛋白的第128位异亮氨酸突变为丙氨酸，NQO2蛋白的第161位天冬氨酸突变为丙氨酸，NQO2蛋白的第
178位苯丙氨酸突变为丙氨酸)；其中，NQO2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0017] 一种NQO2蛋白突变体的基因，其编码上述NQO2蛋白突变体。

[0018] 一种重组表达载体，含有所述的NQO2蛋白突变体的基因。

[0019] 所述的重组表达载体为重组pGEX-4T-1。

[0020] 一种重组宿主细胞，含有所述的重组表达载体。

[0021] 所述的重组宿主细胞为重组大肠杆菌；优选为重组大肠杆菌BL-21。

[0022] 所述的NQO2蛋白突变体在筛选或制备NQO2蛋白抑制剂和/或抗肿瘤药物中的应用。

[0023] 所述的肿瘤包括肺癌等；优选为肺腺癌。

[0024] 一种筛选NQO2蛋白抑制剂和/或抗肿瘤药物的方法，包括使用上述NQO2蛋白突变体的步骤。

[0025] 本发明的技术原理：

[0026] 选取肺腺癌细胞株A549与H1299，采用蛋白热稳定(CETSA)、等温量效反应(ITDRECETSA)、荧光滴定实验、表面等离子共振(SPR)及分子对接来确定莪术醇与NQO2是否结合；通过体内与体外NQO2酶活性检测实验，证明莪术醇对NQO2功能的影响情况。

[0027] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0028] (1)NQO2蛋白在肺腺癌中高表达，可能与临床化疗耐受有关，本发明中发现莪术醇可直接与NQO2蛋白结合，抑制NQO2酶活；且发现了氨基酸F126、I128、N161以及F178位点是莪术醇与NQO2的结合的关键位点，分别突变上述位点，NQO2与莪术醇不再结合且NQO2酶活性受到影响。因此，莪术醇可作为NQO2抑制剂，可用于解决NQO2高表达所引起的肿瘤药物耐受的治疗。

[0029] (2)本发明利用天然中药提取物莪术醇作为NQO2蛋白的抑制剂，进而达到解决肿瘤药物耐受的问题。本发明主要具备如下优点：①莪术醇直接作用于NQO2蛋白抑制该蛋白活性，且相互作用位点已经研究清楚；②莪术醇存在于传统中草药中，提取制备方便，安全性高，价格低廉，开发利用的前景好。

附图说明

[0030] 图1是免疫组织化学方法检测NQO2在肺腺癌组织样品中的表达情况图；其中，A为NQO2在肺腺癌组织中染色强度的评分标准；B与C代表性图片显示NQO2在肺腺癌病人癌旁与癌组织中的表达强度及统计；D为NQO2在肺腺癌不同分期中的表达强度统计；E为KM法生存分析NQO2在肺腺癌病人中的预后潜力。

[0031] 图2是热稳定实验验证莪术醇与NQO2蛋白结合情况图；其中，A为CETSA实验验证NQO2蛋白在莪术醇处理下蛋白热稳定性变化情况；B为ITDRECETSA实验验证在温度为67℃情况下不同浓度莪术醇处理下NQO2稳定性变化情况。

[0032] 图3是荧光滴定实验表明莪术醇与NQO2之间存在直接相互作用图；其中，A为滴定荧光淬灭曲线；B荧光淬灭程度累积曲线。

[0033] 图4是SPR实验表明莪术醇与NQO2之间存在直接相互作用图；其中，A为SPR曲线；B为SPR信号累积曲线。

[0034] 图5是NQO2酶活性分析图；其中，A为人肺腺癌细胞A549；B为人肺腺癌细胞H1299。

[0035] 图6是分子对接模拟莪术醇与NQO2结合模式图；其中，A分子对接示意图；B莪术醇与NQO2结合位点预测。

[0036] 图7是NQO2各重组蛋白的纯化效果与荧光滴定曲线图；其中，A为NQO2各重组蛋白的纯化效果图；B为荧光滴定曲线。

[0037] 图8是不同突变形式NQO2酶活性分析图；其中，A体外重组蛋白水平；B细胞水平。

具体实施方式

[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的方法和设备为本技术领域常规方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

[0039] 本发明中涉及到NQO2(Homo sapiens N-ribosyldihydronicotinamide:quinone reductase 2)蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，编码NQO2蛋白的基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_001290221.1)如SEQ ID NO.3所示：

[0040] NQO2蛋白序列(SEQ ID NO.1)

[0041] AGKKVLIVYAHQEPKSFNGSLKNVAVDELSRQGCTVTVSDLYAMNLEPRATDKDITGTLSNPEVFNYGVETHEAYKQRSLASDITDEQKKVREADLVIFQFPLYWFSVPAILKGWMDRVLCQGFAFDIPGFYDSGLLQGKLALLSVTTGGTAEMYTKTGVNGDSRYFLWPLQHGTLHFCGFKVLAPQISFAPEIASEEERKGMVAAWSQRLQTIWKEEPIPCTAHWHFGQ。

[0042] NQO2基因序列(SEQ ID NO.2)

[0043] GCAGGTAAGAAAGTACTCATTGTCTATGCACACCAGGAACCCAAGTCTTTCAACGGATCCTTGAAGAATGTGGCTGTAGATGAACTGAGCAGGCAGGGCTGCACCGTCACAGTGTCTGATTTGTATGCCATGAACCTTGAGCCGAGGGCCACAGACAAAGATATCACTGGTACTCTTTCTAATCCTGAGGTTTTCAATTATGGAGTGGAAACCCACGAAGCCTACAAGCAAAGGTCTCTGGCTAGCGACATCACTGATGAGCAGAAAAAGGTTCGGGAGGCTGACCTAGTGATATTTCAGTTCCCGCTGTACTGGTTCAGCGTGCCAGCCATCCTGAAGGGCTGGATGGATAGGGTGCTGTGCCAGGGCTTTGCCTTTGACATCCCAGGATTCTACGATTCCGGTTTGCTCCAGGGTAAACTAGCGCTCCTTTCCGTAACCACGGGAGGCACGGCCGAGATGTACACGAAGACAGGAGTCAATGGAGATTCTCGATACTTCCTGTGGCCACTCCAGCATGGCACATTACACTTCTGTGGATTTAAAGTCCTTGCCCCTCAGATCAGCTTTGCTCCTGAAATTGCATCCGAAGAAGAAAGAAAGGGGATGGTGGCTGCGTGGTCCCAGAGGCTGCAGACCATCTGGAAGGAAGAGCCCATCCCCTGCACAGCCCACTGGCACTTCGGGCAA。

[0044] 实施例1:莪术醇与NQO2蛋白结合抑制NQO2酶活性，莪术醇与NQO2结合位点为F126、I128、N161以及F178氨基酸

[0045] (1)首先确定NQO2在肺腺癌中的临床表现情况，我们利用免疫组化IHC检测NQO2在94例肺腺癌组织及癌旁组织(肺腺癌组织及癌旁组织来源于医院)的表达情况。具体步骤如下：

[0046] 免疫组化实验所用抗体为NQO2(武汉Proteintech公司)，稀释比例为1：3000，所用芯片为肺腺癌180点组织芯片(HLugA180Su06，上海芯超生物)。IHC染色结果判读：染色比例分别用0，1，2，3，4表示<10％；10–30％；30–50％；50–80％；80–100％；染色强度用0，1，2，3分别表示没有染色、弱染、中度染色、强染色4种程度；染色比例*染色强度即为免疫组化得分。最终得分>6表示NQO2高表达，≤6表示NQO2低表达；统计结果比较采用Pearson’schi-square检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存分析。

[0047] 结果如图1所示，图1A为NQO2在肺腺癌组织中染色强度的评分标准(染色强度用0，1，2，3分别表示没有染色、弱染、中度染色、强染色4种程度)；图1B与代表性图片显示NQO2在肺腺癌病人癌旁与癌组织中的表达强度差异；图1C为1B的统计结果，说明NQO2在癌组织中高表达；图1D为NQO2在肺腺癌不同分期中的表达强度统计，说明肿瘤恶性程度越高NQO2的表达量也越高；图1E为KM法生存分析NQO2在肺腺癌病人中的预后潜力，说明高表达NQO2的病人预后差。

[0048] 结果表明NQO2高表达于肺腺癌组织，而低表达于癌旁组织中，且癌症恶性程度越高，NQO2表达量也越高。根据染色评分结果与病人存活时间分析该蛋白临床预后情况，结果表明NQO2高表达的病人预差。以上分析提示NQO2有重要的临床意义，寻找针对NQO2的靶向药物，具有重要的临床应用价值。

[0049] (2)本研究的另一对象莪术醇购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度为99.76％。为了确定莪术醇与NQO2是否结合，我们在细胞水平上采用蛋白热稳定(CETSA)及等温量效反应(ITDRECETSA)实验。

[0050] CETSA的具体过程如下：用终浓度200μM的莪术醇处理人肺腺癌细胞系A549与H1299(购自购于美国标准生物品收藏中心细胞库)1h后收集细胞用PBS缓冲液重悬，以DMSO(二甲基亚砜)为对照，从加药组和对照组组分别取4份等量的细胞进行不同温度(40℃、60℃、64℃、67℃、70℃、72℃、75℃)的刺激，反复冻融3次裂蛋白，离心去除变性沉淀，将收集的蛋白进行后续免疫印迹分析。结果如图2A所示：相对于对照组莪术醇能够显著提高NQO2蛋白的热稳定性。

[0051] ITDRECETSA的具体过程如下：将浓度梯度为100、150、200μM的莪术醇和对照DMSO分别处理A549与H1299细胞1h后收集细胞用PBS缓冲液重悬，在温度为67℃的刺激下反复冻融3次裂蛋白，离心去除变性沉淀，将收集的蛋白进行后续免疫印迹分析。结果如图2B所示：在恒定温度下，随着莪术醇的浓度增加，NQO2蛋白稳定性相应提高。

[0052] 另外我们纯化出NQO2蛋白，具体过程为：以A549细胞RNA逆转录而成的cDNA为模板，进行PCR扩增(表1中第二对引物)，获得NQO2基因，然后将其构建至pGEX-4T-1表达载体(Addgene)中，并将构建好的载体(NQO2-WT载体)转化于BL-21表达菌中，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以终浓度为0.5mM的条件诱导表达4～6h后收集菌体。采用GE公司的GST亲和层析纯化柱对重组蛋白进行纯化，采用GE公司的Thrombin酶切除GST标签。通过相应的免疫印迹分析及考染分析，获得NQO2蛋白。其中，

[0053] A549细胞总的mRNA序列如下(SEQ ID NO.3)：

[0054] GGGCGGGGCGGGTGAGTGGGCGGGGCCTCGGCGTGGTAGGCGCGCTGCGTAAAGAGGCCTGCAGTCCCGCGGCGCGGGGCAGGTTCCGGGCTGCTTAGGTTGGCACCGGTCCGTGGTCCCCGGGGGCGCAGTCGCAGCGCTCCCGCCCTCCAGGCGTCAGCGAGTGCGCGGTCCAGTGCGGCCGGAACCTGGCGCAACTCCTAGAGCGGTCCTTGGGGAGACGCGGGTCCCAGTCCTGCGGCTCCTACTGGGGAGTGCGCTGGTCGGAAGGGGGATGGAGACAGAAGTCACAAACTCACATGCCACCAGCCATATGATGTAAACATGTAAACTGGGCCAAGGAATACAAAAGGGAGTGGTGAGCTGGGGACACTGAAGAATGGATGCCCTGTCTAGAGGAGTGAAAATGAAGCATTTCATACAAACAACATGATTTCGGGCAATCACTTTGGGAATCAGGATAAGGTGTTCCCCCAGTCTGCAGAAACACTGGCAACATTTACAAAGCTTTAGGTTCATTCTTGTAAGTGTTGCTGGTGTCAGAATAGGAACCTCCCTGCGCTTTGAAGGGATGAATGTGACCTCTCCCACATTCTCCGGTGCTGTGATGTACCTTAAACACAGCAAGGGCACCTGGCCTGGGTGGAGCCCACTCCTCAGCACCCACCTCACTTCTTGCAGTATTCTGCAGACCCCAGCCCTGTGCCTGTGCTCCTGGACAGCTGGAGATAAGGAGTGGGCCCTGGAAGATGCTCATTCAGGCCCTGCTCAAGATTCCAGTCCTGATTGCTGGACTCGCTGAAGAGAGACTACGCAGGAAAGCCCCAGCCACCCATCAAATCAGAGAGAAGGAATCCACCTTCTTACGCTATGGCAGGTAAGAAAGTACTCATTGTCTATGCACACCAGGAACCCAAGTCTTTCAACGGATCCTTGAAGAATGTGGCTGTAGATGAACTGAGCAGGCAGGGCTGCACCGTCACAGTGTCTGATTTGTATGCCATGAACCTTGAGCCGAGGGCCACAGACAAAGATATCACTGGTACTCTTTCTAATCCTGAGGTTTTCAATTATGGAGTGGAAACCCACGAAGCCTACAAGCAAAGGTCTCTGGCTAGCGACATCACTGATGAGCAGAAAAAGGTTCGGGAGGCTGACCTAGTGATATTTCAGTTCCCGCTGTACTGGTTCAGCGTGCCAGCCATCCTGAAGGGCTGGATGGATAGGGTGCTGTGCCAGGGCTTTGCCTTTGACATCCCAGGATTCTACGATTCCGGTTTGCTCCAGGGTAAACTAGCGCTCCTTTCCGTAACCACGGGAGGCACGGCCGAGATGTACACGAAGACAGGAGTCAATGGAGATTCTCGATACTTCCTGTGGCCACTCCAGCATGGCACATTACACTTCTGTGGATTTAAAGTCCTTGCCCCTCAGATCAGCTTTGCTCCTGAAATTGCATCCGAAGAAGAAAGAAAGGGGATGGTGGCTGCGTGGTCCCAGAGGCTGCAGACCATCTGGAAGGAAGAGCCCATCCCCTGCACAGCCCACTGGCACTTCGGGCAATAACTCTGTGGCACGTGGGCATCACGTAAGCAGCACACTAGGAGGCCCAGGCGCAGGCAAAGAGAAGATGGTGCTGTCATGAAATAAAATTACAACATAGCTACCTGGGGATACTTTTTTCTTTCTGTTTTTTGTTTGTTTTTAATTTTAGCTTTAAGGAGCACATGGCCAGTACTGTTTCAGGGGAATATTGGGTGGCGCTGGGGTTTGGGCTTCTATTGATC。

[0055] 注:字体加粗部分为NQO2 cDNA序列：ATG为起始密码子。

[0056] 获得重组的NQO2蛋白后，采用荧光滴定实验[参考文献：L.Zhang et al.,Crucial residue Trp158 of lipoprotein PiaA stabilizes the ferrichrome-PiaA complex in Streptococcus pneumoniae.Journal of inorganic biochemistry 167,150(Feb,2017)]，表面等离子共振(SPR)[参考文献：T.Yang et al.,Novel compounds TAD-1822-7-F2 and F5 inhibited HeLa cells growth through the JAK/Stat signaling pathway,Biomedicine&Pharmacotherapy 103(2018)118–126]等实验手段进行分析，结果如图3和4所示。

[0057] (3)检测莪术醇处理下NQO2酶活性的变化，将人肺腺癌细胞系A549与H1299分别进行DMSO或莪术醇(终浓度200μM)处理后，以150μM的menadione(甲萘醌)与150μM的BNAH(二胺基己烷)为共同底物，560nm处吸光值，每隔5分钟检测一次，连续监测30min。

[0058] 结果如图5所示，莪术醇处理后NQO2酶活性显著降低，说明莪术醇的确能够抑制NQO2酶活，是NQO2蛋白有效的抑制剂。

[0059] (4)为了进一步研究莪术醇与NQO2的结合模式，使用Discovery Studio软件对莪术醇和NQO2的相互作用情况进行计算模拟，并得出潜在作用位点(图6)。采用分子生物学手段对潜在作用位点进行突变并进行原核表达纯化，和未突变的NQO2一起分别与Curcumol进行体外共孵育，随后采用荧光滴定实验检测两者结合能力的变化，确认预测的F126、I128、N161以及F178氨基酸位点对药物结合的重要意义。其中，定点突变的方法如下：

[0060] 在NQO2-WT质粒(构建于pGEX-4T-1质粒上)的基础上设计表达F126(即NQO2蛋白的第126位苯丙氨酸)、I128(NQO2蛋白的第128位异亮氨酸)、N161(NQO2蛋白的第161位天冬氨酸)以及F178(NQO2蛋白的第178位苯丙氨酸)氨基酸位点突变成丙氨酸的NQO2突变质粒(表1)。选择Mut II Fast Mutagenesis Kit V2定点突变系统(深圳康体生命科
技有限公司)构建所需突变质粒(NQO2-F126A，NQO2-I128A，NQO2-N161A，NQO2-F178A)。设计引物向质粒引入单碱基突变，引物序列见表1。表达纯化：将构建好的突变质粒转化于BL-21表达菌中，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)以终浓度为0.5mM的条件诱导表达4～6h后收集菌体。采用GE公司的GST亲和层析纯化柱对重组蛋白进行纯化，采用GE公司的Thrombin酶切除GST标签，获得重组的突变NQO2蛋白。

[0061] 突变后序列：(注：本实验涉及的突变均是单突变)

[0062] AGKKVLIVYAHQEPKSFNGSLKNVAVDELSRQGCTVTVSDLYAMNLEPRATDKDITGTLSNPEVFNYGVETHEAYKQRSLASDITDEQKKVREADLVIFQFPLYWFSVPAILKGWMDRVLCQGFAADAPGFYDSGLLQGKLALLSVTTGGTAEMYTKTGVAGDSRYFLWPLQHGTLHACGFKVLAPQISFAPEIASEEERKGMVAAWSQRLQTIWKEEPIPCTAHWHFGQ。

[0063] 结果如图7所示，该荧光滴定实验表明突变NQO2上氨基酸F126、I128、N161以及F178位点后莪术醇与NQO2不再结合。

[0064] 表1.重组野生型及突变型NQO2质粒的引物序列

[0065]

[0066] (5)将上述步骤(4)纯化的各突变形式NQO2蛋白100ng，以menadione(150μM)与BNAH(150μM)为共同底物，560nm处吸光值，连续监测10min(每隔2分钟检测一次)。

[0067] 另外，在细胞水平检测突变NQO2对NQO2酶活性影响。首先构建清除内源NQO2蛋白的KO细胞株，所用细胞系为A549细胞。构建KO-NQO2质粒的引物见表1，质粒为Crisper(购自Addgene)，采用ClonExpressTM II(诺唯赞科技有限公司)快速克隆技术进行构建。KO-NQO2质粒构建成功后进行慢病毒包装及稳定细胞株构建：取对数期的293T(ATCC)细胞以50％的密度接种到中皿中，培养12h；将KO-NQO2质粒与包装质粒PSPAX2(Addgene)及PMD2G(Addgene)分别混合，加入Lipo3000(Life science)在Opti-MEM培养基(Thermo)中混匀，静置20min；将293T细胞的培养基换成Opti-MEM培养基，并加入上述混合好的Opti-MEM培养基，置于培养箱中培养6h；换新鲜的完全培养基培养48h，后收上清离心去除细胞碎片，并用
0.45μm滤器过滤彻底去除碎片。将过滤后的上清加入到提前1d以30％的密度接种好A549细胞的6孔板中。感染24h，去除含病毒培养基换成新鲜培养基。48h后加入嘌呤霉素(1μg/mL)进行筛选，每两天换一次液，筛选一周后换成正常培养基培养，扩大，检测NQO2蛋白敲除情况，保种备用。

[0068] 在清除内源NQO2蛋白的KO细胞株的基础上，恢复过表达野生型及突变型NQO2。构建稳定细胞株所用的NQO2相关质粒，将其分别构建在pLenti-CMV(Addgene)载体上(引物见表1)，构建质粒采用ClonExpressTM II系统。然后将构建的重组质粒(NQO2-WT，NQO2-F126A，NQO2-I128A，NQO2-N161A，NQO2-F178A)通过上述构建稳转细胞株的方式过表达于KO细胞株中，获得NQO2-WT、F126A、I128A、N161A及F178过表达细胞株。

[0069] 接下来，收集NQO2-WT、F126A、I128A、N161A及F178过表达细胞株的蛋白裂解液。取3μg的上述细胞蛋白裂解液，以menadione(150μM)与BNAH(150μM)为共同底物，560nm处吸光值，每隔5分钟检测一次，连续监测30min，结果如图8所示。

[0070] 以上结果确定了莪术醇可作为NQO2的抑制剂。预示着莪术醇通过抑制NQO2酶活是一个有效的肺癌治疗手段，在肺癌临床治疗方面具有广阔的应用价值。

[0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0072] 参考文献

[0073] [1]Guo P,Wang YW,Weng BX,Li XK,Yang SL,Ye FQ.Synthesis,anti-tumor activity,and structure-activity relationships of curcumol derivatives.Journal of Asian natural products research.2014；16:53-8.

[0074] [2]Huang L,Li A,Liao G,Yang F,Yang J,Chen X,et al.Curcumol triggers apoptosis of p53mutant triple-negative human breast cancer MDA-MB 231 cells via activation of p73 and PUMA.Oncology letters.2017；14:1080-8.

[0075] [3]Wang J,Li XM,Bai Z,Chi BX,Wei Y,Chen X.Curcumol induces cell cycle arrest in colon cancer cells via reactive oxygen species and Akt/GSK3beta/cyclin D1 pathway.Journal of ethnopharmacology.2018；210:1-9.

[0076] [4]Zang S,Tang Q,Dong F,Liu H,Li L,Guo F,et al.Curcumol inhibits the proliferation of gastric adenocarcinoma MGC-803 cells via downregulation of IDH1.Oncology reports.2017；38:3583-91.

[0077] [5]Huang LZ,Wang J,Lu FT,Yang FC,Chen X,Hong X,et al.[Mechanism study on anti-proliferative effects of curcumol in human hepatocarcinoma HepG2 cells].Zhongguo Zhong yao za zhi＝Zhongguo zhongyao zazhi＝China journal of Chinese materia medica.2013；38:1812-5.

[0078] [6]Zhang W,Wang Z,Chen T.Curcumol induces apoptosis via caspases-independent mitochondrial pathway in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 
cells.Medical oncology.2011；28:307-14.

[0079] [7]Janda E,Parafati M,Aprigliano S,Carresi C,Visalli V,Sacco I,et al.The antidote effect of quinone oxidoreductase 2 inhibitor against paraquat-induced  toxicity in  vitro  and in vivo.British journal of 
pharmacology.2013；168:46-59.

[0080] [8]Gross CJ,Mishra R,Schneider KS,Medard G,Wettmarshausen J,Dittlein DC,et al.K(+)Efflux-Independent NLRP3 Inflammasome Activation by Small Molecules Targeting Mitochondria.Immunity.2016；45:761-73.

[0081] [9]Miettinen TP,Bjorklund M.NQO2 is a reactive oxygen species generating off-target for acetaminophen.Molecular pharmaceutics.2014；11:4395-
404.