突变型单链人凝血因子VIII融合蛋白及其制备方法与用途

摘要

本发明公开了一种突变型重组单链人凝血因子VIII(FVIII)融合蛋白、其制备方法及用途。该融合蛋白从N端到C端依次包含缺失部分B‑结构域的突变型单链人FVIII、柔性肽接头、至少1个人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽刚性单元和延长半衰期部分(优选人IgG Fc变体)。该融合蛋白具有与重组FVIII类似的生物学活性及延长的体内活性半衰期，以及更好的体外和体内稳定性，从而改善融合蛋白的药代动力学和药效。

权利要求

1.一种人凝血因子VIII的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的代码是SS‑F8，而且其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.编码如权利要求1所述的融合蛋白的DNA。

3.如权利要求2所述的DNA，其序列如SEQ ID NO：10所示。

4.一种载体，其特征在于，包含如权利要求2或3所述的DNA。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求2或3所述的DNA，或者转染了权利要求4所述的载体。

6.一种药物组合物，其特征在于，包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的如权利要求1所述的融合蛋白。

7.一种如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，所述方法包括：(a)将权利要求2或3所述的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；

6

(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过1IU/10个细胞的高产细胞株；

(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；

(d)收获步骤(c)得到的发酵液，并分离纯化融合蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中融合蛋白纯化过程包含亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析。

9.一种如权利要求1所述的融合蛋白在制备用于预防或治疗出血性疾病的药物中应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中，用于预防或治疗出血性疾病是用于FVIII先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的预防或治疗、血友病A患者的自发或手术性出血的预防或治疗。

说明书

突变型单链人凝血因子VIII融合蛋白及其制备方法与用途

技术领域

[0001] 本发明涉及融合蛋白领域，更具体地，涉及一种突变型人凝血因子VIII(FVIII)的融合蛋白及其制备方法和用途，特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。

背景技术

[0002] 凝血因子VIII(FVIII)，又称抗血友病因子，在内源性凝血体系中具有十分重要的作用。FVIII分子遗传学的大量研究结果表明性染色体X‑连锁基因中缺乏FVIII会导致A型
血友病。据统计，血友病A在男性人群中患病率为1/5000，占血友病总数的80％以上。血友病
A目前常用的治疗方法为替代治疗，即补充血友病患者所缺乏的FVIII。

[0003] 成熟的FVIII由大约分子量为280kDa的轻链和重链组成，具有A1‑A2‑B‑A3‑C1‑C2的结构域。在细胞内，对B结构域中Arg‑1648残基进行的蛋白酶解产生90‑200kDa的大小不
均一的重链(A1‑A2‑B)和80kDa的轻链(结构域A3‑C1‑C2)。重链和轻链通过二价金属离子依
赖性的链接结合为异源二聚体。在血浆中，重链和轻链的二聚体再以高亲和力结合冯.维勒
布兰德因子(von Willebrand，vWF)，保护其免于成熟前降解。血浆中非活化FVIII结合vWF
的半衰期约为12小时。FVIII在重链内的Arg372和Arg740位置，和在轻链内的Arg1689位置
被活化的凝血因子FX(FXa)及凝血酶FII(FIIa)水解切割而活化，导致vWF因子释放并产生
2+
活化的FVIII二聚体(FVIIIa)，在Ca 存在下，它与磷脂表面上活化的凝血因子FIX(FIXa)和
FX形成紧密复合物，FX接着被FIXa激活，活化的FX从复合物中解离出来，转而将凝血酶原转
化为凝血酶，后者能将纤维蛋白原直接转化成纤维蛋白。作为一种凝血系统的辅助因子，
FVIII能使FIXa对FX的活化催化效率增强几个数量级。

[0004] 由于FVIII蛋白质结构复杂，分子量大，致使FVIII很不稳定，在原料血浆收集及重组纯化制备等过程中容易失活。FVIII的有效期相对短暂，特别在水溶液中，保存温度、无机
盐离子、微量蛋白酶以及参与凝血的其他蛋白质(特别是vWF和白蛋白)等因素都会对FVIII
分子的稳定性产生影响。FVIII冻干品复溶后注射给药的过程中，必须确保安全、无菌，且要
在规定时间内输液完毕，一般不超过4h。另一方面，冻干复溶过程中的剧烈振荡也会导致蛋
白结构受损从而使FVIII失活。因此，研发具有更好稳定性的FVIII分子，能够提高FVIII制
品在临床应用中的灵活性，对大幅提高患者的用药安全和生活质量而言至关重要。

[0005] FVIII的B结构域含有18个N糖基化位点，在凝血中没有已知功能且与其他蛋白质没有同源性，B‑结构域缺失的FVIII分子仍具有良好的促凝血活性。Eaton等公开了一种从
中心B结构域区域缺失766个氨基酸(797到1562)的FVIII分子保持了其生物活性，此外，缺
失B结构域区域的FVIII在哺乳动物细胞中的表达量是高于全长分子的，并且表现出比全长
分子更快和更高的激活率(Eaton等，Biochemistry,1986,25:8343‑8347)。其它研究也表
明，大部分B结构域缺失(Ser743到Gln1638)对FVIII的功能活性没有影响，且显著降低了分
子量(减少38％)，增加了真核细胞中的表达水平(Peters R T等,J Thromb Haemost,2013,
11(1):132‑141；Sandberg H等,Semin Hematol,2001,38:4‑12)。

[0006] Afstyla是一种新型重组单链人FVIII产品，是目前唯一获批治疗A型血友病的轻重链融合在一起的单链凝血因子产品。由于其对血管假性血友病因子(VWF)具有极强的亲
和性，因而具有更高的分子稳定性和更长的疗效持续时间。在临床研究中，Afstyla在预防
性治疗(prophylaxis)和按需治疗(on‑demand treatment)均表现出优秀的止血和预防出
血功效，在2种给药方案中，Afstyla的用药剂量均较低，同时也具有非常好的安全性。相较
于标准护理药物Octocog alfa，Afstyla的蛋白构型更为稳定，疗效也相对持久，但仍需每
周注射2‑3次。

[0007] 为了延长FVIII的体内功能半衰期，现有技术将FVIII与PEG、人血清白蛋白(HSA)、转铁蛋白或IgG Fc等延长半衰期部分连接。目前Novo Nordisk(N8‑GP)，Bayer(BAY94‑
9027)和Baxter(BAX 855)公司均开发了PEG化的长效FVIII产品，并已进入临床研究，然而，
在该蛋白制备工艺中增加了PEG与FVIII化学缀合的额外步骤，降低了最终产率、加大了制
备成本。另一方面，药代动力学研究数据显示，PEG化的FVIII并未获得显著延长的半衰期
(Tiede A等,J Thromb Haemost,2013,11:670‑678；Turecek PL等,Hamostaseologie,
2012,32 Suppl 1:S29‑38)。WO2013106789公开了一种包含FVIII部分和Fc部分的嵌合多肽
(FVIIIFc)，所述嵌合FVIII多肽的终末半衰期相较于rFVIII延长了两倍，预防性治疗的给
药频次为每周两次，以维持FVIII活性的水平在1‑3％。

[0008] CTP是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β‑亚基羧基末端的短肽，含有多个O‑糖基化位点。这种带负电、高度唾液酸化的的肽段与其它蛋白的C末端共价连接，能够抵抗
肾脏对其的清除作用，从而延长与之连接的目标蛋白在体内的半衰期。一些专利文献公开
CTP可以作为融合蛋白中包含的延长半衰期部分。本发明创造性地将具有多个O‑糖基位点
的CTP多肽作为连接肽的一部分，用于连接单链FVIII和Fc片段，而不是放在C末端作为融合
配体发挥作用，因它具有的天然糖基化位点，不仅能使融合蛋白的半衰期进一步延长，生物
利用度提高，同时与常规的柔性GS柔性连接肽相互配合，形成稳定的立体构象，促使单链
FVIII和Fc段独立折叠形成正确三维构象，大大降低了融合配体Fc对单链FVIII的位阻效
应，使其保持了较高的生物学活性。另外，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白
酶的敏感性。

[0009] 综上，虽然目前有许多研究提供了有效的重组FVIII蛋白制备方案，然而相比全长FVIII而言，FVIII衍生物的异源数目、结构和凝血酶活化的不稳定仍然是一个严峻的问题。
此外，由于许多B‑结构域缺失的FVIII作为融合蛋白表达，非天然的氨基酸序列给药后可能
出现新的免疫原性。FVIII分子的稳定性对于储存和临床应用而言也至关重要。在这种情况
下，希望开发活化、稳定、安全的FVIII衍生物，能够具有同样的凝血酶活性、提高的产量和
更长的半衰期，可以通过降低注射频率来维持预防性治疗，有助于改善治疗效果。

发明内容

[0010] 本发明提供一种重组突变型单链凝血因子VIII的Fc融合蛋白，具有延长的体内活性半衰期且与重组FVIII相似的生物学活性。此外，本发明提供了一种高效、稳定表达所述
融合蛋白的方法，该方法表达的融合蛋白具有产量高、在制备和存储过程中稳定性好，并且
其生物活性和已上市的重组FVIII因子相似的优点。本申请的发明人令人惊讶的发现构建
的重组突变型单链FVIII融合蛋白的稳定性实质地增强，融合蛋白在细胞内可以阻止蛋白
酶剪切，得到的融合蛋白在纯化后显示出更好的稳定性，皮下施用时显示出良好的生物利
用率。

[0011] 本发明的第一方面，本发明涉及一种重组突变型单链凝血因子VIII融合蛋白，所述融合蛋白从N端至C端依次含有缺失部分B‑结构域的单链人FVIII(scFVIII)、柔性肽接头
(Linker，L)、至少一个人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽刚性单元(以下简称CTP刚
性单元，表示为(CTP)n，较优地，n为1,2,3,4,或5)和延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc段、
白蛋白、转铁蛋白或PEG，优选人IgG Fc变体(表示为vFc))。本发明的一些优选实施例中，所
述融合蛋白表示为scFVIII‑L‑CTP‑vFc。

[0012] 其中，所述scFVIII其和SEQ ID NO：1所示全长人野生型FVIII氨基酸序列相比缺失了765至1651位氨基酸；具体地，所述scFVIII具有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。

[0013] 其中，所述柔性肽接头优选非免疫原性的，并且在scFVIII和Fc之间产生足够的空间距离，使相互之间的位阻效应降至最低。较佳地，使用含有2个或更多个氨基酸残基组成
的柔性肽接头，且选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。

[0014] 更优选地，所述柔性肽接头包含G和S残基。连接肽的长度对融合蛋白的活性非常重要。对本发明而言，所述肽接头可优选地包含以(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d循环单元组
合形成的氨基酸序列通式，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。

[0015] 具体地，本发明的实施例中，所述肽接头可优选地包含如下序列：

[0016] (i)L1：GSGGGSGGGGSGGGGS；

[0017] (ii)L2：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

[0018] (iii)L3：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

[0019] (iv)L4：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

[0020] (v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS。

[0021] 其中，所述CTP刚性单元选自人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第113至145位氨基酸所组成的全长序列或其片段，具体地，所述CTP刚性单元包含如SEQ ID NO：3所示氨基
酸序列或其截短的序列。首先，这种人体内天然存在的含有多个糖基化位点的CTP多肽是非
免疫原性的。其次，含有多个糖基化位点的CTP刚性连接肽相对于柔性连接肽的无规则卷
曲，它可以形成稳定的立体构象，促使scFVIII和Fc段独立折叠形成正确三维构象而互不影
响各自生物活性。另外，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性。

[0022] 优选地，所述CTP刚性单元包含至少2个糖基化位点；例如，本发明的一优选实施例中，所述CTP刚性单元包含2个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3N
端的10个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*；或所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3C端的14个氨基
酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含3个糖基化位点，示例
性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3N端的16个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再
如，另一些实施例中，所述CTP刚性单元包含4个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包
含28、29、30、31、32或33个氨基酸并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第113、114、115、
116、117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：3N端的28个氨
基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都
代表本发明的独立实施方式。

[0023] 在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在
另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一
些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少95％同源。

[0024] 本发明具体实施例中所述CTP刚性单元可优选地包含如下序列：

[0025] (i)CTP1：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

[0026] (ii)CTP2：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

[0027] (iii)CTP3：SSSSKAPPPS；

[0028] (iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ。

[0029] 本发明一些实施例中，所述融合蛋白包含1个上述CTP刚性单元。本发明另一些实施例中，所述融合蛋白包含2个或2个以上的上述CTP刚性单元，优选地，包含2，3，4或5个上
述CTP刚性单元。

[0030] 其中，延长半衰期部分优选自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA Fc片段；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体的Fc片段；进一步地，所述人IgG Fc变体包含位于野生型人IgG 
Fc中的至少一种氨基酸修饰，且变体具有降低的效应子功能(ADCC和/或CDC效应)和/或与
新生儿受体FcRn的结合亲和力增强。进一步地，人IgG Fc变体可选自下组：

[0031] (i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列)；

[0032] (ii)vFcγ2‑1：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列)；

[0033] (iii)vFcγ2‑2：含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列)；

[0034] (iv)vFcγ2‑3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列)；

[0035] (v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列)。

[0036] 本发明所提供的IgG Fc变体包含但不限于(i)～(v)中所述5种变体，还可以是IgG同种亚型间两类功能变体突变位点的组合或叠加，如上述(iv)中所述变体即是由(ii)和
(iii)中的突变位点相叠加所获得的新的IgG2Fc的组合变体。

[0037] 本发明所述融合蛋白中的Fc变体(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数系统确定)含有氨基酸
突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的
补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低，而且依旧是Fc
γR非结合子。IgG4 Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比IgG1低约一
个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功
能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1降低的效应
子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备FVIII融合蛋白。而250和428位(由EU编
号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc区与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而
进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能变体的
相互组合或叠加，获得新的组合变体，使其效应子功能降低的同时且延长了其半衰期。本发
明所述Fc变体包含却不局限于上述几个位点的突变，也可引入其它位点的替换使得Fc具有
降低的效应子功能和/或与FcRn受体的结合力增强，同时还不会致使Fc变体功能/活性降低
或引起不良的构象变化，常见的突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276
(9):6591‑604。

[0038] 本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

[0039] 根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述融合蛋白的DNA。

[0040] 本发明的一优选实施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：10所示。

[0041] 根据本发明的再一个方面，提供一种载体，该载体包含上述DNA。

[0042] 根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述载体，或者转染了上述的载体。

[0043] 在本发明的具体实施方式中，宿主细胞是CHO的衍生细胞株DXB‑11。

[0044] 根据本发明的第五方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述融合蛋白。

[0045] 根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细胞系制备或生产所述融合蛋白的方法，包括以下步骤：

[0046] (a)将编码所述融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；

[0047] (b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过1IU/106个细胞的高产量细胞株；

[0048] (c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达融合蛋白；

[0049] (d)收获步骤(c)得到的发酵液，并分离纯化融合蛋白。

[0050] 进一步地，所述步骤(a)中CHO衍生细胞系为DXB‑11。

[0051] 进一步地，所述步骤(c)中，细胞培养可选用分批、灌流或流加培养方法。

[0052] 进一步地，所述步骤(d)中采用四步层析法对融合蛋白进行纯化，分别为亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析和分子筛层析。本发明结合实施例5进一步给出其优选条件。

[0053] 本发明优选实施例中，采用上述方法制备得到的融合蛋白的活性>6000IU/mg。

[0054] 根据本发明的第六方面，提供所述融合蛋白在制备用于预防或治疗因FVIII缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病或事件的药物中的应用。

[0055] 进一步地，所述疾病包括甲型(或称A型)血友病。在甲型血友病患者的自发出血事件、手术预防、围手术期处理或手术治疗中，本发明所述融合蛋白起到控制或预防出血发生
的作用。

[0056] 本发明所公开和/或所记载的融合蛋白及其制备方法的优点可以概括如下：

[0057] 1、本发明构建的突变型单链FVIII融合蛋白，其Fc段是非裂解性的，即通过对Fc片段的补体、受体结合域进行突变，调节Fc与相应受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC
效应，而只保留Fc段延长活性蛋白体内半衰期的作用，却不产生细胞毒性。

[0058] 2、本发明提供的突变型单链FVIII融合蛋白包含具有多个糖基侧链的刚性CTP多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻
隔”作用促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。CTP
含有多个O型修饰的寡糖基，带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其清除作用，进一
步延长融合蛋白的半衰期；再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的
敏感性，使融合蛋白不易在连接区被降解。

[0059] 3、本发明所述融合蛋白无论在发酵、纯化过程以及储存过程中均具有良好的体外稳定性。25度室温储存7日，突变型单链FVIII融合蛋白的活性显著高于Arg1648和Glu1649
间(根据人野生型FVIII全长序列SEQ ID NO：1编码)蛋白酶切位点未被失活的重组双链
FVIII Fc融合蛋白药物，且活性丧失小于20％。

[0060] 4、本发明提供的所述融合蛋白的制备方法，产量较高，在300ml摇瓶中培养14天，累积产量至少可达到200mg/L，可进行工艺放大，实现大规模工业化生产。

[0061] 发明详述：

[0062] hCG‑β羧基末端肽(CTP)

[0063] CTP是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β‑亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺
激素(hCG)含有相同的α‑亚基和各自特异的β‑亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期
明显延长，这主要来源于其β‑亚基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA等,Proc Natl 
Acad Sci USA,1992,89(10):4304‑4308)。天然CTP含有37个氨基酸残基，具有4个O‑糖基化
位点，终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而
延长体内循环半衰期(Fares F A等,Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(10):4304‑4308)。
然而，本发明创造性地将至少一个CTP多肽与适当长度的柔性连接肽连接，共同作为连接
肽，用于连接FVIII与延长半衰期部分(如，免疫球蛋白Fc片段)。

[0064] 本发明发现，通过在FVIII与Fc变体间增加CTP肽，相当于增加了一段刚性连接肽。这一方面保证了N‑端融合的FVIII不会影响Fc变体与FcRn的结合位点，从而影响半衰期；另
外Fc的Protein A结合位点对于制备工艺中纯化步骤很重要，连接CTP保证N‑端融合的
FVIII也不会“罩住”它与protein A的结合位点，因而可选择更便宜和更适用的填料纯化融
合蛋白，降低纯化成本。另一方面，CTP的添加也使得约25kDa大小的Fc片段不会干扰N‑端融
合的FVIII的正确折叠，造成其生物学活性/功能的下降或丧失。具有多个糖基侧链的刚性
CTP多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这
种“阻隔”作用促使FVIII和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活
性。再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使融合蛋白不
易在连接区被降解。

[0065] IgG Fc变体

[0066] 非裂解性Fc变体

[0067] Fc元件来源于免疫球蛋白IgG的恒定区Fc片段，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc介导的IgG的效应子功能发挥通过两种机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)
结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原
体，或(2)与第一补体成分C1的C1q结合，引发补体依赖性细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病
原体。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力较
低，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。此外，人IgG1和
IgG3还能有效结合C1q而激活补体级联反应。人IgG2与C1q结合相对弱，而IgG4不与C1q结合
(Jefferis R等,Immunol Rev,1998,163:59‑76)，所以人IgG2CDC效应也较弱。显然，没有一
种天然IgG亚型是非常适合构建FVIII‑Fc融合蛋白的。为了得到不具效应子功能的非裂解
性Fc，最有效方法是对Fc片段上补体、受体结合域突变改造，调节Fc与相关受体的结合亲和
力，降低或消除ADCC和CDC效应，只保留功能蛋白的生物学活性和Fc段长效体内半衰期，而
不产生细胞毒性。更多的非裂解性Fc变体所包含突变位点可以参见Shields RL等,J Biol 
Chem,2001,276(9):6591‑604或中国发明专利CN 201280031137.2。

[0068] 与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体

[0069] IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH 6.0时结
合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半
衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突变可增加或降低FcRn结
合亲和力(Roopenian等,Nat.Rview Immunology7:715‑725,2007)。韩国专利号KR 10‑
1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且
这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨
基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010‑0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体
并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰
显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L 2个突变体分别使与FcRn的
结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L
突变体显示血浆半衰期增加2倍(Paul R.Hinton等,J Immunol,2006,176:346‑356)。更多
的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利
CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善
了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射给药，Fc突变
抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加、清除率降低、皮下生
物利用度提高(Datta‑Mannan A等.MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267‑273.)。

[0070] 融合蛋白及其制备方法

[0071] 本发明融合蛋白基因是密码子优化过的由人工合成方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本领域技术人员可方便的用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法
不限于人工合成或传统亚克隆等，具体方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作
为本发明的一种实施方式，通过分段合成核苷酸序列再进行亚克隆的方法来构建本发明的
编码核酸序列。

[0072] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞的表达载体，包含编码本发明的融合蛋白序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种
状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，
如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

[0073] 哺乳动物细胞表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员还可以根据宿主细胞来选择合
适的表达载体。

[0074] 根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重
组表达载体。

[0075] 本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO细胞，COS细胞，293细胞，
RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可较佳地表达本发明的融合
蛋白，可获得活性和稳定性良好的融合蛋白。

[0076] 本发明还提供一种用重组DNA技术制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：

[0077] 1)提供编码融合蛋白的核酸序列；

[0078] 2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；

[0079] 3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；

[0080] 4)在适合表达的条件下培养转染宿主细胞；

[0081] 5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。

[0082] 将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，脂质体转染，电穿孔，微注射，病毒感染法，碱金属离子法。

[0083] 有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM等，Dev Biol Stand 1996，86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集上清液。

[0084] 可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS‑PAGE电泳上呈单一或特定条带。首先将表达上清浓缩,浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或
采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼
脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的介质。Q‑或SP‑基团是较为理想的离子交换基团。
最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱
等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋
白纯度达到基本均一。还可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析
柱对表达的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓
冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。

[0085] 药物组合物

[0086] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效剂量的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可
接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5‑8，较佳地，pH约为6‑8。术语“有效量”或“有效剂
量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接
受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)
的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载
体，包括各种辅形剂和稀释剂。

[0087] 药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例
如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合
物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓
释制剂。

[0088] 本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过
临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用
率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者体重、患者免疫状况、给药途径
等。

附图说明

[0089] 图1、纯化后融合蛋白SS‑F8的SEC‑HPLC峰谱图。

[0090] 图2、纯化后融合蛋白SS‑F8的SDS‑PAGE电泳图。

[0091] 图3、融合蛋白SS‑F8对SD大鼠隐动脉出血时间的影响。

[0092] 图4、融合蛋白SS‑F8对SD大鼠血浆APTT的影响。

具体实施方式

[0093] 实施例1、构建编码突变型单链FVIII融合蛋白的表达质粒

[0094] 编码FVIII前导肽、B‑结构域部分缺失的FVIII蛋白、柔性肽接头、CTP刚性单元和人IgG vFc变体的基因序列都是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，经人工合成获得。所合
成融合蛋白全长DNA片段的5’和3’端各有一个限制性酶内切位点，分别为SpeI和EcoRI，全
长DNA片段插入至pUC57转移载体相应酶切位点间，并由DNA测序验证其序列。

[0095] 将上述获得的融合蛋白全长基因片段从中间载体转移到自制表达质粒PXY1A1M的相应酶切位点间，得到融合蛋白高表达质粒。PXY1A1M质粒包含但不限于以下重要表达元器
件：1)人巨细胞病毒早期启动子和哺乳动物细胞外源高表达所需增强子；2)双重筛选标记
物，在细菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳动物细胞中具有G418抗性；3)鼠二氢叶酸还原酶
(DHFR)基因表达框，当宿主细胞为DHFR基因缺陷型时，氨甲蝶呤(MTX)能共扩增融合基因和
DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。再将融合蛋白表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞
系，为了获得稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO‑细胞(参见美国专
利US 4,818,679)。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的筛选培养基，细胞以一定
浓度(5000‑10000个活细胞/孔)种植在96孔培养板里，培养10‑14天直至大的离散细胞克隆
出现。用ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。通过极限稀释96孔培养板，亚
克隆产生高水平融合蛋白的孔。

[0096] 本发明构建了一系列突变型单链FVIII融合蛋白，它含有不同长度的肽接头(Linker)、不同组成的CTP刚性单元以及几种不同亚型的IgG Fc变体(vFc)元件组成，以验
证连接肽、Fc变体对突变型单链FVIII融合蛋白活性的影响。详见表1。各组成元件的氨基酸
序列见序列表。

[0097] 表1、各种单链FVIII融合蛋白组成

[0098]

[0099] 实施例2、筛选高表达融合蛋白的稳定转染细胞系

[0100] 将上述融合蛋白的表达质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达突变型单链FVIII融合蛋白。为了维持稳定的高水平表达，优选的宿主细胞是DHFR缺陷型的CHO细胞(参
见美国专利US 4,818,679)。一种优选转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸
钙共沉降、脂质体转染和微注射等。电穿孔方法应用设置为300V电压和1050μFd电容的Gene 
7
Pulser Electroporator(Bio‑Rad Laboratories公司)，往放置在比色杯内的2～3×10 个
细胞中加入50μg PvuI线性化的表达质粒，电穿孔后的细胞转移至含30ml生长培养基的摇
瓶中。转染两天后，将培养基换成含0.6mg/mL G418的生长培养基，细胞以一定浓度种植在
96孔培养板里，培养10‑12天直至大的离散细胞克隆出现。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，
筛选对选择用药具有抗性的转染子，然后通过极限稀释法亚克隆产生高水平表达融合蛋白
的孔。

[0101] 为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释
DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定
6
其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约1(较佳地约3)IU/10 (即百
万)个细胞/24小时的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养，然后再用条件培养
基纯化融合蛋白。

[0102] 实施例3、生产融合蛋白

[0103] 将实施例2优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养。待细胞适应这些培养条件后，然后在300ml摇瓶中进行补
料流加培养或通过每天更换培养基的办法模拟灌流培养。由实施例2筛选得到的生产融合
蛋白SS‑F8的CHO衍生的细胞株在300ml体积的摇瓶中补料流加培养14天，其表达的重组融
6
合蛋白累积产量达到200mg/L，活细胞密度最高可达到15×10个/mL。为了得到更多融合蛋
白，也可以选用1000ml摇瓶培养。另一种培养方法，上述CHO衍生的细胞株在100ml体积的摇
瓶中每天更换培养基，其表达的重组融合蛋白每天累积产量约为20mg/L，在摇瓶中活细胞
6
密度最高可达到30×10个/mL。以上两种方法生产的重组融合蛋白的测定的生物学活性相
当。

[0104] 实施例4、纯化与定性融合蛋白

[0105] 本发明主要采用四步层析法对融合蛋白SS‑F8进行纯化。分别为亲和层析、阴离子交换层析、疏水层析和分子筛层析(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA pure 
25M。本实施例中采用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析级)。

[0106] 第一步，亲和层析：采用GE公司的VIII Select亲和层析介质进行样品捕获、浓缩以及部分污染物的去除。首先使用平衡buffer：10mM HEPES，150mM NaCl，25mM CaCl2，
0.05％Tween‑80，pH 6.8‑7.2，以50‑100cm/h的线性流速平衡层析柱3‑5个柱体积(CV)；将
经过澄清后的发酵液以50‑100cm/h的线性流速上样，载量不高于50000IU/ml；上样完毕后，
使用平衡buffer：10mM HEPES，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.05％Tween‑80，pH 6.8‑7.2，以
50‑100cm/h的线性流速平衡层析柱3‑5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer 
1：10mM HEPES，1M NaCl，25mM CaCl2，0.05％Tween‑80，pH 6.8‑7.2，以50‑100cm/h的线性
流速冲洗层析柱3‑5个柱体积，去除部分污染物；使用平衡buffer：10mM HEPES，150mM 
NaCl，25mM CaCl2，0.05％Tween‑80，pH 6.8‑7.2，以50‑100cm/h的线性流速平衡层析柱3‑5
个柱体积(CV)；之后使用洗脱buffer：20mM His‑HCl，25mM CaCl2，0.02％Tween 80，45％丙
二醇，pH 6.8‑7.2，以不高于50cm/h的线性流速洗脱目标产物，收集目标峰。

[0107] 第二步，阴离子交换层析：使用博格隆公司的Q‑HP或其它市售的阴离子交换层析介质(例如GE的Q HP、TOSOH的Toyopearl GigaCap Q‑650、天地人和的DEAE Beads 6FF，赛
分科技的Generik MC‑Q、Merck的Fractogel EMD TMAE、Pall的Q Ceramic HyperD F)进行
中间纯化，分离结构变异体、进一步去除HCP、DNA等污染物。首先使用平衡buffer：20mM 
His‑HCl，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH 7.0‑7.5，以50‑100cm/h的线性流
速冲洗层析柱3‑5个柱体积(CV)；经第一步亲和层析分离得到的目标蛋白稀释5‑10倍，降低
有机物浓度后上样，载量控制在5000‑10000IU/ml；上样完毕，使用平衡buffer：20mM His‑
HCl，100mM NaCl，10mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH 7.0‑7.5，以50‑100cm/h的线性流速冲
洗层析柱3‑5个柱体积(CV)；之后使用wash buffer：20mM His‑HCl，500mM NaCl，10mM 
CaCl2，0.02％Tween 80，pH 7.0‑7.5，以50‑100cm/h的线性流速冲洗层析柱3‑5个柱体积
(CV)，去除部分杂蛋白，之后采用层级梯度的盐浓度进行洗脱，洗脱buffer：20mM His‑HCl，
1M NaCl，10mM CaCl2，0.02％Tween80，pH 7.0‑7.5，条件为洗脱buffer从50％和60％，洗脱
3‑5个柱体积(CV)，线性流速控制在不高于50cm/h，对洗脱组分进行分段收集，分别送样进
行蛋白含量、SEC‑HPLC、活性和HCP含量检测。经蛋白浓度测定，及蛋白活性测定。

[0108] 第三步，疏水层析：使用博格隆公司的Butyl HP或其它市售的疏水层析介质(例如GE的Butyl HP、TOSOH的Toyopearl Butyl‑650、天地人和的Butyl Beads 4FF，赛分科技的
Generik MC30‑HIC Butyl、Merck的Fractogel EMD Propyl)进行中间纯化，用于降低聚合
体含量，第二步阴离子交换层析洗脱液中仍含有一定比例的聚合体，因为聚合体的形成原
因多样，包括结构未改变的聚合和结构发生变化的聚合，它们的生物学活性差别较大，因此
对于生物学活性的分析带来较大的干扰。目标蛋白聚合以后，聚合体和单体之间存在性质
上的差异，包括电荷特性以及疏水性，我们使用疏水性的差异对二者进行分离。因为纯化最
后步骤是分子筛层析，所以使用Butyl HP进行纯化，目标是部分去除聚合体，使其含量低于
10％。首先，使用平衡buffer：20mM His‑HCl，1.5M NaCl，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH 
6.8‑7.2，以50‑100cm/h的线性流速平衡层析柱3‑5个柱体积(CV)；第二步阴离子交换层析
分离得到的目标蛋白用buffer：2M(NH4)2SO4调电导，然后上样，载量控制在<20000IU/ml；上
样完毕后，使用平衡buffer：20mM His‑HCl，1.5M NaCl，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH 
6.8‑7.2，以50‑100cm/h的线性流速冲洗层析柱3‑5个柱体积(CV)；之后使用wash buffer：
20mM His‑HCl，1.5M NaCl，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，pH 6.8‑7.2，以50‑100cm/h的线性
流速冲洗层析柱3‑5个柱体积(CV)，去除部分聚合体；最后进行目标蛋白洗脱，使用洗脱
buffer：20mM His‑HCl，5mM CaCl2，0.02％Tween 80，50％乙二醇，pH 6.8‑7.2，分别以
20％、40％、100％洗脱buffer，以不高于60cm/h的线性流速洗脱3‑5个柱体积(CV)，对洗脱
组分进行分段收集，分别送检SEC‑HPLC。将单体百分比大于90％的目标组分合并进行下一
步层析。

[0109] 第四步，分子筛层析：使用GE的superdex 200或其它市售的分子筛介质(例如博格隆公司的Chromdex 200prep grade)进行分离，目标是降低聚合体含量至<5％，并进一步降
低关键污染物的含量。使用平衡buffer：10mM His‑HCl，150mM NaCl，2mM CaCl2，10mM蔗糖，
0.02％Tween80，pH 6.8‑7.2，以20‑40cm/h的线性流速冲洗层析柱2个柱体积(CV)；上样量
不高于柱体积的3％，以20cm/h的线性流速冲洗，依次收集洗脱组份，SEC检测合并。

[0110] 样品的SEC‑HPLC纯度结果及SDS‑PAGE电泳结果分见图1和图2，其中SEC‑HPLC结果显示，纯化后融合蛋白的主峰纯度达98％以上；SDS‑PAGE电泳带型符合预期，非还原电泳包
含未加工融合蛋白条带(约390kDa)，在另一常见酶切位点E720处被切割而脱落两条重链片
段后所形成的(LC‑L‑CTP‑Fc)2二聚片段(约210kDa)，以及LC‑L‑CTP‑Fc单链片段(约
100kDa)和HC片段(约90kDa)；还原后可得清晰的HC‑LC‑L‑CTP‑Fc(约190kDa)、LC‑L‑CTP‑Fc
(约105kDa)和HC(约90kDa)单链条带。得到的蛋白质组份的比活在6000‑8000IU/mg。

[0111] 实施例5.发色底物法间接测定融合蛋白体外活性

[0112] 突变型单链FVIII融合蛋白的活性可采用发色底物法测定。本实施例采用Biophen FVIII:C试剂盒(HYPHEN BioMed，Ref.221402)测定，其检测原理如下：当被凝血酶激活后，
FVIII:C在磷脂和钙离子存在下，与FIXa结合形成酶复合物，继而可激活因子X转变成其活
性形式Xa。激活形成的因子Xa继而可使其特异性发色底物(SXa‑11)发生裂解，释放发色基
团pNA。在405nm下测定所产生pNA的量，即可知与其量直接成正比关系的FXa的活性大小，其
中在体系中因子IXa和因子X的含量是一定且过量的，FXa的活性仅与FVIIIa的含量多少直
接相关。以本法测定突变型单链FVIII融合蛋白的比活性约为6000‑8000IU/mg。

[0113] 实施例6、纯化的融合蛋白的稳定性研究

[0114] 为进一步验证突变型单链FVIII融合蛋白在25度室温条件下稳定性，将突变型单链FVIII融合蛋白在25度室温条件下存放数天，考察该条件对融合蛋白活性的影响。

[0115] 药品稳定性试验箱(购自上海—恒科学仪器)设置试验温度为25℃，湿度为75％。将稀释至相同浓度的SS‑F8和双链八因子对照药物DS‑F8(该融合蛋白保留了人野生型
FVIII Arg1648和Glu1649间的蛋白酶剪切位点，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)各分
装8支，每支200μl，放入药品稳定性试验箱保存。各取一支SS‑F8和DS‑F8分装蛋白，根据上
述实施例5所述的方法，检测融合蛋白的活性，记为第一天(d1)的活性值。之后分别在室温
条件(温度：25℃，湿度75％)下放置d3、d5、d7和d14后，分别检测突变型单链FVIII融合蛋白
的活性。结果显示，25度室温条件下放置5天后，SS‑F8仅下降约10％的蛋白活性，而DS‑F8的
蛋白活性下降了25％以上；室温放置7天中，DS‑F8的活性降低速率较SS‑F8而言更显著，且
放置7天后SS‑F8仍保有80％以上的蛋白活性，由此可见SS‑F8融合蛋白的稳定性明显优于
DS‑F8。

[0116] 实施例7、融合蛋白的药效学研究

[0117] 血液凝固实际是一系列凝血因子的酶促反应，整个凝血过程分为三个阶段：第一阶段为血液凝血活酶形成；第二阶段凝血酶形成；第三阶段纤维蛋白形成，其中FVIII、FIX
属于内源性凝血因子，而FVII是外源性凝血因子。出血时间是表示皮肤毛细血管被刺破后
自然出血到自然止血所需的时间，通过观察突变型单链FVIII融合蛋白对SD大鼠隐动脉出
血时间的影响来检测融合蛋白的促凝血作用。

[0118] 选取7周龄的SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，随机分为2组。给药组以200IU/只单次静脉给予SS‑F8，对照组给以相同体积的生理盐水。给药3h后，对大鼠进行
诱导麻醉。对手术位置消毒处理后，由内脚踝往上约1cm位置处，经膝关节至腿根部动脉处
剪开皮肤，分离皮下组织和血管上保护膜，依次暴露静脉血管、动脉血管和神经。在膝关节
位置找到隐动脉及其分支，用显微直镊锐性分离静脉血管旁5mm*1mm处肌肉位置，从内侧挑
起静脉、动脉及神经；用显微剪剪断隐静脉和隐动脉，不得触碰和损伤神经，看到血液涌出
即为起始出血时间，记为t1。每隔30s观察一次出血部位，直到看到不出血位置，计为止血时
间t2。计算t2‑t1，记录出血时间。对数据进行统计分析，实验数据以均数±标差(Means±
SD)表示，若数据符合正态分布，则采用SPSS 18.0软件，单因素方差分析或者student’s‑
test；若非正态分布，采用非参数检验Kruskal‑wallis检验或者Mann‑whitney检验，P≤
0.05具有显著性差异，P≤0.01有非常显著性差异。

[0119] 实验结果如图3所示，在预防给药后，SD大鼠手术导致隐动脉出血后，SS‑F8与生理盐水组的出血时间有明显的统计学差异。在200IU/只剂量下，预防性给予受试药SS‑F8对该
出血模型有明显地止血作用。

[0120] 实施例8、凝血法直接测定融合蛋白的生物学活性

[0121] 通过测定活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)，观察SS‑F8对SD大鼠血浆的体外抗凝血作用。

[0122] 选取7周龄的SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，随机分为12组。将大鼠诱导麻醉后，在持续麻醉状态下，以手术刀沿腹部正中线划开，自腹部主动脉取血10‑12ml。
取上述血样，20℃下以1500rpm离心30min，分离上清血浆，分别加入到标记好的1.5ml离心
管中。将全血浆与受试药物SS‑F8和DS‑F8按体积比6:1，分别配制成25‑1000IU/ml浓度的待
测样品，对照组按体积比6:1加入稀释液。以全自动血凝仪(CS‑2000i，Sysmex公司)检测上
述样品的APTT值。根据公式计算APTT变化率＝(给药组APTT值‑对照组APTT值)/对照组APTT
值，实验数据以均数±标差(Means±SD)表示，若数据符合正态分布，则采用SPSS18.0软件，
单因素方差分析或者student’s‑test；若非正态分布，采用非参数检验Kruskal‑wallis检
验或者Mann‑whitney检验，P≤0.05具有显著性差异，P≤0.01有非常显著性差异。

[0123] 从图4中可以看出，受试药SS‑F8和DS‑F8对正常大鼠的血浆有抗凝血作用，在高浓度1000IU/ml下，受试药DS‑F8和SS‑F8的APTT时间与溶剂对照组比较，分别下降了33.65％
和31.86％；DS‑F8和SS‑F8的EC50值分别是139.4IU/ml和115.6IU/ml，受试药SS‑F8的EC50值
低于DS‑F8，可以预见更低的给药剂量。随着各受试药浓度的增加，APTT的时间明显缩短，且
有一定的量效关系。

[0124] 虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导做出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

[0125] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可
对本发明做各种修改或改动，这些等价形式同样落后于本申请所附权利要求书所限定的范
围。