一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法

摘要

本发明公开了一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法，属于发酵工程技术领域。本发明的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)A14 CGMCC No.18666产香叶醇的能力高，发酵48h香叶醇的浓度可达63.48μg/L，而其他白酒发酵过程中的优势酵母产生香叶醇的最高含量仅为43.59μg/L；在白酒酿造过程中加入含有葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)A14 CGMCC No.18666的菌剂，可显著提高白酒中的香叶醇含量，并提升白酒的风味和营养价值。

权利要求

1.一株葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）A14，已于2019年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18666。

2.一种产香叶醇的方法，其特征在于，是以权利要求1所述葡萄汁有孢汉逊酵母A14为发酵微生物合成香叶醇。

3.根据权利要求2所述产香叶醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将葡萄汁有孢汉逊酵母A14单菌落接种到青稞汁培养基中，培养24 48h成为种子培~养液；

（2）将培养好的种子培养液接种到青稞汁培养基中，发酵36 72h。

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4.一种酵母菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的葡萄汁有孢汉逊酵母A14。

5.根据权利要求4所述的一种酵母菌剂，其特征在于，酵母菌剂的形式为液体菌剂或固体菌剂。

6.制备权利要求5所述的酵母菌剂的方法，其特征在于，挑取葡萄汁有孢汉逊酵母A14接种于YPD液体培养基中，25 35℃培养24 48h成为液体菌剂。

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7.制备权利要求5所述的酵母菌剂的方法，其特征在于，挑取葡萄汁有孢汉逊酵母A14接种于YPD液体培养基中，25 35℃培养24 48h成为液体菌剂，再将葡萄汁有孢汉逊酵母A14~ ~的液体菌剂真空干燥制成固体菌剂。

8.权利要求4或5所述的酵母菌剂在白酒酿造中的应用，其特征在于，将所述酵母菌剂加入酒醅进行发酵。

9.权利要求1所述葡萄汁有孢汉逊酵母A14在香叶醇生产、酿酒领域及生产含香叶醇的酒精饮品中的应用。

10.权利要求4或5所述的酵母菌剂在香叶醇生产、酿酒领域及生产含香叶醇的酒精饮品中的应用。

说明书

一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一株产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

[0002] 萜类物质是组成植物挥发物的重要成分，香叶醇作为白酒中无环单萜类物质，具有温和、香甜的玫瑰花气息，同时还具有一定的保健功能。将香叶醇应用于酿造酒业以及其他食品领域，可显著改善发酵食品的风味并提高食品的保健效果。

[0003] 由于香叶醇在白酒发酵过程中产生的含量较低，目前工业上往往通过基因工程构建具有香叶醇生产能力的菌株，如在酿酒酵母中进行代谢流重排，或者在大肠杆菌等不具备香叶醇生产能力的模式微生物中构建香叶醇合成途径，以提高香叶醇产量，但这些基因工程菌株由于存在安全隐患，在白酒等食品领域并不适用。部分已报道的未进行基因改造的原始菌株，如酿酒酵母，其发酵48h香叶醇的浓度仅为10-40μg/L。目前关于如何提高白酒中香叶醇含量的相关报道较少。因此，从原位体系内筛选高产香叶醇的菌株，并在发酵过程中进行生物强化，是提高白酒中香叶醇的含量、提升白酒品质和营养价值的重要途径。

发明内容

[0004] 针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种高产香叶醇的葡萄汁有孢汉逊酵母及其发酵生产香叶醇的方法，并将其应用于白酒发酵中，以提高香叶醇的含量并增加白酒的风味和营养价值。

[0005] 本发明的第一个目的是提供一株葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)A14，已于2019年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18666，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0006] 本发明的第二个目的是提供一种葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666发酵生产香叶醇的方法，包括如下步骤：

[0007] (1)将葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666单菌落至装有5mL青稞汁培养基的25mL试管中，自然pH，30℃，200rpm，培养36h成为种子培养液；

[0008] (2)将培养好的种子培养液以5％的接种量接种在装有50mL青稞汁培养基的250mL三角瓶中，自然pH，30℃，发酵48h。

[0009] 本发明的第三个目的是提供含有葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666的多种形式的酵母菌剂。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666菌剂的形式包括液体菌剂和固体菌剂。

[0011] 本发明的第四个目的是提供含有葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666的液体菌剂和固体菌剂的制备方法。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述液体菌剂的制备方法为：挑取葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666菌株接种于YPD液体培养基中，25～35℃培养24～48h。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述固态制剂的制备方法为：将葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666菌株接种到YPD液体培养基中，25～35℃培养24～48h后真空干燥制成固体菌剂。

[0014] 本发明的第五个目的是提供一种含有葡萄汁有孢汉逊酵母CGMCC No.18666的菌剂在白酒酿造中的应用方法。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述酵母菌剂(mL)、青稞大曲(g)、酒醅(mL)以0.005-0.5％：5-10％：1的比例加入混合进行发酵。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述应用方法是将固体菌剂(g)、青稞大曲(g)、酒醅(mL)以：0.005％：10％：1的比例混合均匀进行发酵。

[0017] 本发明还要求保护所述菌株在香叶醇生产、酿酒及食品领域中的应用。

[0018] 本发明的有益效果：

[0019] 本发明的葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)A14 CGMCC No.18666产香叶醇的能力高，发酵48h香叶醇的浓度为63.48μg/L，较其他白酒发酵过程中的优势酵母产生香叶醇的含量增加了1.5倍以上；在白酒酿造过程中加入含有葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)A14 CGMCC No.18666的菌剂，可显著提高青稞酒中的香叶醇含量，提升白酒的风味和营养价值。

[0020] 生物材料保藏

[0021] 葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)A14，分类命名为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)；已于2019年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18666，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

[0022] 图1为Hanseniaspora uvarum平板菌落形态。

具体实施方式

[0023] WL培养基：酵母浸粉4.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，葡萄糖50.0g/L,磷酸二氢钾0.55g/L，氯化钾0.425g/L，氯化钙0.125g/L，硫酸镁0.125g/L，氯化铁0.0025g/L，硫酸锰0.0025g/L，琼脂20g/L，嗅甲酚绿22mg/L。

[0024] 青稞汁培养基：青稞和去离子水按1:4(w/v)比例进行添加，先将去离子水加热至沸腾，加入洗净的青稞，加入高温淀粉酶(30U/g青稞)蒸煮，糊化至糖度为10Bx°，然后冷却至60℃，加入糖化酶(200-300U/g青稞)于60℃恒温箱中下糖化4h。过滤得到青稞汁。

[0025] YPD液体培养基：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、其余为水；

[0026] 固体酵母菌剂培养基：以青稞大曲原料作为培养基成分。

[0027] 青稞大曲：青稞及豌豆进行粉碎(过40目筛，过筛率27±3％)，以7:3比例混匀后制成曲块，在曲房内培养30d，培养过程中常规控制各阶段曲块的水分及温度，再储存3个月以上，直至菌群稳定后可投入生产使用。

[0028] 液态发酵产物检测：运用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)方法对液体发酵产生的挥发性产物进行分析：取发酵后8mL挥发性样品，放入装有3g NaCl的顶空进样瓶中，加入10μL浓度为106.25mg/L的L-薄荷醇作为内标。将顶空瓶于60℃恒温萃取45min，萃取完后进行GC-MS分析。

[0029] 固态发酵产物检测：称取10g发酵末期酒醅，加入25mL超纯水，震荡仪震荡5min后，于4℃过夜静提，再用震荡仪震荡1min后，冰浴超声30min。取上清液，置于-20℃保存。运用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和全二维气相色谱-质谱(GC×GC-TOFMS)方法对挥发性产物进行分析：取8mL挥发性样品，放入装有3g NaCl的顶空进样瓶中，加入10μL浓度为106.25mg/L的L-薄荷醇作为内标。将顶空瓶于60℃恒温萃取45min，萃取完后进行GC×GC-TOFMS分析。

[0030] 实施例1:高产香叶醇的Hanseniaspora uvarum的筛选及鉴定

[0031] 取10g青稞大曲溶于90mL无菌生理盐水中，摇床振荡30分钟后进行梯度稀释，选取稀释度为10-2、10-3、10-4、10-5的菌液各取50μl涂布WL固体平板，在30℃培养48h后，Hanseniaspora uvarum平板菌落形态如图1所示。

[0032] 挑取符合Hanseniaspora uvarum表型特征的单菌落至装有5mL青稞汁培养基的25mL试管中，自然pH，30℃，200rpm，培养36h成为种子培养液。将培养好的种子培养液以5％的接种量接种在装有50mL青稞汁培养基的250mL三角瓶中，自然pH，30℃，发酵48h。采用HS-SPME和GC-MS技术筛选出3株具有较高香叶醇产量的菌株，其中香叶醇产量分别为63.48μg/L、43.59μg/L与37.05μg/L。

[0033] 对发酵获得的3株高产香叶醇的潜在Hanseniaspora uvarum进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物NL1和NL4分别扩增酵母的26S rDNA的片段(NL1和NL4引物序列见表1)，凝胶电泳检测扩增片段大小是否正确，并进行测序比对。测序结果显示扩增片段与NCBI中Hanseniaspora uvarum的26S rDNA序列同源性为100％，确定所筛选得到的酵母在分类学上属于Hanseniaspora uvarum酵母。将获得的具有最高香叶醇产量的一株Hanseniaspora uvarum(即产量为63.48μg/L的菌株)命名为Hanseniaspora uvarum A14，并保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18666。

[0034] 表1引物序列

[0035]

[0036] 实施例2：Hanseniaspora uvarum A14与其他酵母产香叶醇的比较

[0037] 本实施例所包括的菌株有Saccharomyces cerevisiae(Sc)，Hyphopichia burtonii(Hb)、Kazachstania unispora(Ku)，Wickerhamomyces anomalus(Wa)，
Torulaspora delbrueckii(Td)，Pichia kudriavzevi(Pku)，Pichia scaptomyzae(Psc)，Pichia membranifaciens(Pme)和Pichia manshurica(Pma)，以及本发明的菌株
Hanseniaspora uvarum A14(Hu A14)。这10种菌株都来自青稞酒酿造环境。

[0038] 挑取上述10种菌株的单菌落至装有5mL青稞汁培养基的25mL试管中，自然pH，30℃，200rpm，培养36h成为种子培养液。将培养好的种子培养液以5％的接种量接种在装有50g灭过菌青稞的250mL三角瓶中，自然pH，30℃，200rpm，发酵48h，HS-SPME和GC-MS技术检测各菌株香叶醇含量。结果发现，Hanseniaspora uvarum A14(Hu A14)菌株的香叶醇产量为63.48μg/L，Torulaspora delbrueckii与Pichia membranifaciens产量可分别达到
43.59μg/L及37.05μg/L，其他菌株香叶醇含量均低于15μg/L或未达到最低检出限，见表2。
说明本发明的菌株Hanseniaspora uvarum A14的香叶醇生产能力明显高于其他菌株。

[0039] 表2不同菌株的香叶醇产量(μg/L)

[0040]

[0041] 注：N.A.表示样本中待检物含量低于检出限。

[0042] 实施例3：Hanseniaspora uvarum A14生理生化性质检测

[0043] 温度耐受性检测：挑取实施例1获得的Hanseniaspora uvarum A14菌株，接种于5ml YPD液体液体培养基中，30℃培养36h至OD800在1.2-1.4。用无菌生理盐水稀释培养基OD800至1,吸取0.5mL菌液接种到50ml YPD液体培养基中。分别于20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、42℃以及46℃不同温度梯度下培养36h。结果显示本发明的Hanseniaspora uvarum A14菌株能够在20-46℃温度范围内行生长，适温为25-35℃(OD800大于1)。

[0044] 酸度耐受性检测：挑取实施例1获得的Hanseniaspora uvarum A14菌株，接种于5ml YPD液体培养基中，30℃培养36h至OD800在1.2-1.4。用无菌生理盐水稀释培养基OD800至
1,吸取0.5mL菌液接种到50ml YPD液体培养基中，YPD培养基提前用0.1M乳酸钠或0.1M乳酸分别调节培养基pH至12、11、10、9、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2，接种后于30℃培养36h。结果显示本发明的Hanseniaspora uvarum A14菌株生长pH范围为2.0-12.0，适宜pH为3.0-8.0(OD800大于1)。

[0045] 实施例4：Hanseniaspora uvarum A14液体菌剂在青稞清香型白酒中的应用

[0046] 挑取Hanseniaspora uvarum A14菌株接种于5ml YPD液体培养基中，30℃培养36h成种子液。调整种子液浓度至108个菌/mL成为液体菌剂，将液体菌剂(mL)、青稞大曲(g)、酒醅(mL)以0.1％：10％：1的比例混合均匀，控制初始发酵条件为17℃、pH值4.1，发酵15d。发酵结束后，检测发酵后期酒醅中香叶醇含量，发现添加Hanseniaspora uvarum A14后酒醅中香叶醇含量由0.0491ug/g增加至0.0526ug/g。

[0047] 实施例5：Hanseniaspora uvarum A14固体菌剂在青稞清香型白酒中的应用

[0048] 挑取Hanseniaspora uvarum A14菌株接种到5mlYPD液体培养基中，30℃培养36h成种子液。将种子液通过真空干燥制成固体菌剂，将固体菌剂(g)、青稞大曲(g)、酒醅(mL)以：0.01％：10％：1的比例混合均匀，控制初始发酵条件为17℃、pH值4.1，发酵15d。。发酵结束后，检测发酵后期酒醅中香叶醇含量，发现添加Hanseniaspora uvarum A14后酒醅中香叶醇含量由0.049ug/g增加至0.0512ug/g。

[0049] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。