一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置

摘要

本发明提供了一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置，通过将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，再通过空间光调制器，将正弦调制的激光调制成多个光束，同步并行扫描激发成像样品，从而成倍提高了扫描效率，有效解决单点扫描时成像时间长的问题，利用非正弦荧光结构光图像的所有频率分量叠加重构待成像样品的超分辨率图像，对比衍射极限其分辨率提高3倍，因此本实施例的方法可以实现快速超分辨率双光子荧光显微成像。本发明所公开的方法及装置可以满足几十纳米甚至更高的双光子荧光成像需求，提高双光子荧光结构光图像分辨率。

权利要求

1.一种多焦点超分辨光学显微成像方法，其特征在于，包括：

将激光按照预设调制函数调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并采用扫描振镜使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描；

采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

提取各个所述结构光图像中的频率分量，并且对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，对叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；

将所述激发光调制成与待成像样品各个区域相对应的多个光束，并控制各个光束与各个区域一一对应，且同步进行各个区域上的激发光扫描，各个区域之间不重叠；其中，使用空间光调制器对调制后的经扫描振镜的激发光进行调制，使得调制后的激发光分成多个光束，每个光束对应样品成像面的一个区域；

所述预设调制函数满足以下公式：

其中，I为待成像样品成像面上的激发光的光强，ωm为调制频率，θ是荧光结构光图像中条纹与水平方向夹角，t为X方向扫描的时间，h表示Y方向上扫描的步数， 为初始位相。

2.根据权利要求1所述的多焦点超分辨光学显微成像方法，其特征在于，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：沿所述待成像样品对各个区域纵向进行逐点扫描，当一个并行纵向列扫描完成后，再沿所述待成像样品横向对各个区域并行进行步进扫描一次，重复执行各个区域内纵向逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品上各个区域扫描完成。

3.一种多焦点超分辨光学显微成像装置，其特征在于，包括依次设置的激光器、强度调制器、扫描振镜、空间光调制器及探测器；

激光器，用于产生激光；

强度调制器，用于按照预设调制函数将所述激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光；

扫描振镜，用于控制调制后的激发光对待成像样品扫描；

空间光调制器，用于将调制后的激发光分成多个光束，使得所述激发光对所述待成像样品进行分区域并行扫描；

探测器，用于采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端，用于提取各个所述结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，对叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；

其中，所述强度调制器、扫描振镜、空间光调制器、探测器分别和计算终端连接；

将所述激发光调制成与待成像样品各个区域相对应的多个光束，并控制各个光束与各个区域一一对应，且同步进行各个区域上的激发光扫描，各个区域之间不重叠；其中，使用空间光调制器对调制后的激发光进行调制，使得调制后的激发光分成多个光束，每个光束对应样品成像面的一个区域；

所述预设调制函数满足以下公式：

其中，I为待成像样品成像面上的激发光的光强，ωm为调制频率，θ是荧光结构光图像中条纹与水平方向夹角，t为X方向扫描的时间，h表示Y方向上扫描的步数， 为初始位相。

4.根据权利要求3所述的多焦点超分辨光学显微成像装置，其特征在于，在所述扫描振镜和所述空间光调制器之间设置有扩束准直装置；

所述扩束准直装置包括：激光扩束镜和激光准直镜；

所述激光扩束镜，用于扫描振镜发出的调制后的激发光进行扩束；

所述激光准直镜，用于对所述激光扩束镜扩束后的激发光进行准直。

5.根据权利要求3所述的多焦点超分辨光学显微成像装置，其特征在于，所述空间光调制器与所述探测器之间的光路中还设置有凸透镜、管镜、第一滤光片和双色镜；

所述空间光调制器处于所述凸透镜的前焦面上，所述凸透镜的后焦面与所述管镜的前焦面重合；

所述第一滤光片和双色镜分别用于对激发光进行过滤和反射。

6.根据权利要求5所述的多焦点超分辨光学显微成像装置，其特征在于，所述双色镜与各个光束中心线之间的夹角为45°或135°。

说明书

一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置

技术领域

[0001] 本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置。

背景技术

[0002] 荧光显微技术在生命科学领域中具有十分重要的作用，其中，双光子荧光显微技术是近年发展起来的一种新型非线性光学成像方法，由于其优异的特性已广泛用于细胞生物活细胞、组织的长时间动态三维成像。双光子荧光显微技术同时吸收两个光子，发射出的荧光波长远离激光，可实现暗场成像；其技术采用近红外激光源，可实现生物组织中深度物质层析成像；另外，双光子荧光显微技术可以避免荧光漂白和对生物细胞的光毒性问题。最后，要产生双光子吸收，必须要求激光有足够高的光子密度。通常使用聚焦光束，只有在焦点附近的光强才能达到产生双光子和多光子吸收的功率密度条件，而远离焦点的区域，不具备达到产生双光子和多光子吸收的功率密度条件，则不产生双光子和多光子吸收，所以和单光子荧光相比，多光子荧光具有很高的空间局域特点和空间分辨能力。

[0003] 由于成像系统传递函数的存在，所有的荧光显微技术的分辨率都受到衍射极限的限制。为了突破衍射极限，近年来发展了各种各样的超分辨显微技术。例如：受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)技术、结构光照明显微镜(structured illuminationmicroscopy,SIM)技术以及基于单分子定位的超分辨成像技术——光激活定位显微镜(photo‑activation localization microscopy,PALM)、随机光学重构显镜(stochasticopticalreconstruction microscopy,STORM)和基于双光子的扫描结构光照明显微技术等。其中，现有的基于双光子的扫描结构光照明显微技术利用电光调制器(EOM)调制飞秒激光，激光经过系统在样品上聚焦成激发聚焦光点；扫描振镜使激光聚焦在样品上进行二维扫描，激发样品产生正弦荧光图案。聚焦的激光点扫描完整个样品，生成完整的样品图像，图像分辨率低，且单点扫描结构光耗时长，成像速度慢，不利于对活体细胞或组织的超分辨率成像。

[0004] 因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

[0005] 鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种多焦点超分辨光学显微成像方法及装置，解决现有双光子SIM技术中单点扫描时间长、成像速度慢和分辨率低的缺陷，同时解决现有多焦点显微技术分辨率低的问题。

[0006] 第一方面，一种多焦点超分辨光学显微成像方法，其中，包括：

[0007] 将激光按照预设调制函数调制成激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行分区域扫描；

[0008] 采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有的多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

[0009] 提取各个所述结构光图像中的频率分量，并且对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

[0010] 可选的，所述将激光按照预设调制函数调制成激发光的步骤包括：

[0011] 根据预设调制函数，将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光。

[0012] 可选的，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：

[0013] 将所述激光调制成与待成像样品各个区域相对应的多个光束，并控制各个光束与成像面区域一一对应，且同步进行各个区域上的激发光扫描，各个区域之间不重叠。

[0014] 可选的，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：

[0015] 沿所述待成像样品对各个区域纵向进行逐点扫描，当一个并行纵向列扫描完成后，再沿所述待成像样品横向对各个区域并行进行步进扫描一次，重复执行各个区域内纵向逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品上各个区域扫描完成。

[0016] 可选的，所述调制函数满足以下公式：

[0017]

[0018] 其中，I为待成像样品成像面上的激发光的光强，ωm为调制频率，θ是荧光结构光图像中条纹与水平方向夹角，t为X方向扫描的时间，h表示所述扫描振镜扫描时Y方向上扫描的步数， 为初始位相。

[0019] 可选的，所述根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

[0020] 对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

[0021] 第二方面，本实施例还公开了一种多焦点超分辨光学显微成像的装置，其中，包括：

[0022] 激光器，用于产生激光；

[0023] 电光调制器，用于按照预设调制函数将所述激光调制成激发光；

[0024] 扫描振镜，用于控制调制后的激发光对待成像样品扫描；

[0025] 空间光调制器，用于将调制后的激发光分成多个光束，使得所述激发光对所述待成像样品进行分区域扫描激发；

[0026] 探测器，用于采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有的多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

[0027] 计算终端，用于提取各个所述结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；

[0028] 其中，所述强度调制器、扫描振镜、空间光调制器、探测器和计算终端连接。

[0029] 可选的，在所述扫描振镜和所述空间光调制器之间还设置有扩束准直装置；

[0030] 所述扩束准直装置包括：激光扩束镜和激光准直镜；

[0031] 所述激光扩束镜，用于扫描振镜发出的调制后的激发光进行扩束；

[0032] 所述激光准直镜，用于对所述激光扩束镜扩束后的激发光进行准直。

[0033] 可选的，所述空间光调制器与所述探测器之间的光路中还设置有凸透镜、管镜、第一滤光片和双色镜；

[0034] 所述空间光调制器处于所述凸透镜的前焦面上，所述凸透镜的后焦面与所述管镜的前焦面重合；

[0035] 所述第一滤光片和双色镜均用于对激发光进行过滤。

[0036] 可选的，所述双色镜与各个光束中心线之间的夹角为45°或135°。

[0037] 与现有技术相比，本发明实施例具有以下优点：

[0038] 根据本发明实施方式提供的方法，通过利用空间光调制器，将激发光调制成多个光束，同步扫描到待成像样品上，实现多焦点的同步扫描，从而有效解决单点扫描时成像时间长的问题，并且本实施例中采用非正弦荧光结构光的所有频率分量叠加重构待成像样品的超分辨率图像，因此本实施例的方法可以在高速成像条件下突破衍射极限，实现分辨率3倍衍射极限的提高，甚至更高，提高图像分辨率和成像速度。

附图说明

[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0040] 图1是本发明实施例中一种多焦点超分辨光学显微成像的方法步骤流程图；

[0041] 图2是本发明实施例中强度调制器调制后激发光的光强随时间按正弦函数变化曲线图；

[0042] 图3是本发明实施例中所述多焦点超分辨光学显微成像装置的结构示意图；

[0043] 图4是本发明实施例中等效的宽场结构光图案示意图。

具体实施方式

[0044] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

[0045] 由于现有技术中的双光子扫描结构光照明显微技术中采用的是单点扫描，激发样本成像面的荧光材料发出荧光信号，为了获取到完整的样品图像，需要依次对样本成像面全部区域进行扫描，因此单点扫描的耗时长，导致成像速度慢，不利于对活体细胞或组织成像。为了克服现有单点扫描耗时长和多点并行扫描分辨率低的缺点，本发明中提供了一种多焦点扫描的超分辨光学显微成像的方法及装置，实现了多区域同步扫描，缩短扫描时间，并且本实施例中利用非正弦荧光结构光图案的包含高次谐波的频率分量叠加重构待成像样品的超分辨率图像，从而实现高速成像条件下的双光子荧光结构光超分辨成像，对比衍射极限，其成像分辨率提高3倍甚至更高，而且，不需要荧光饱和激发。

[0046] 第一方面，本实施例公开了一种多焦点超分辨光学显微成像方法，如图1所示，所述方法包括：

[0047] 步骤S1、将激光按照预设调制函数调制成激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行分区域扫描。

[0048] 本步骤中首先使用激光器发射出激光，在一种实施方式中，所述激光器可以选择使用钛宝石飞秒激光器，该激光可以用于实现荧光物质双光子激发。

[0049] 为了实现得到不同方向上不同相位上的多幅完整的待成像样品的成像图像，所述将激光按照预设调制函数调制成激发光的步骤包括：

[0050] 根据预设调制函数，将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光。

[0051] 本实施例中利用电光调制器，以预设调制函数对激光进行调节，使得调制出的激发光的光强随着时间正弦周期性变化，如图2为调节后的激发光光强随时间按正弦函数周期变换的波形示意图，所述预设调制函数的函数表达式满足：

[0052]

[0053] 其中，I是待成像样品成像面上的激发光的光强，ωm为调制频率，θ是样本上条纹与水平方向夹角，t为X方向扫描的时间，h表示所述扫描振镜扫描时Y方向上扫描的步数，为初始位相。

[0054] 结合图3所示，为了实现更好的激发光传输，在激光器与强度调制器之间的光路中，设置有第一半波片，所述第一半波片用于调制激光器发出激光的偏振方向，使得激光偏振方向与强度调制器偏振方向匹配。

[0055] 为了实现多焦点扫描，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发的步骤包括：

[0056] 将所述激发光调制成与待成像样品各个区域相对应的多个光束，并控制各个光束与成像面区域一一对应，且同步进行各个区域上的激发光扫描激发，各个区域之间不重叠。

[0057] 一种实现方式中，使用空间光调制器对调制后的激发光进行调制，使得调制后的激发光分成多个光束，每个光束对应样品成像面的一个区域。其中空间光调制器采用纯相位型空间光调制器SLM10，所述SLM10对入射激发光的相位进行调制，将激发光分成多个子光束，并且子光束的个数与样品成像面上划分出的区域个数相同，每个子光束均对应一个区域。

[0058] 具体的，所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：

[0059] 沿所述待成像样品对各个区域纵向进行逐点扫描，当一个并行纵向列扫描完成后，再沿所述待成像样品横向对各个区域并行进行步进扫描一次，重复执行各个区域内纵向逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品上各个区域扫描完成。

[0060] 在一种实施方式中，利用所述扫描振镜通过以下方式对所述待成像样品各个区域进行扫描：

[0061] 首先在Y方向的振镜开始在纵向进行逐点扫描，当Y方向的振镜逐点扫描结束后，Y方向的振镜返回到原位置，同时X方向的振镜沿横向进行步进扫描，即调整激发光点的纵向位置。

[0062] 循环执行上述的逐点扫描和步进扫描，对应到待成像样品各个区域上逐点扫描和步进扫描，直至完成对所述待成像样品各个区域的扫描。

[0063] 在进行扫描控制时，每个光束对应一个区域，形成多点激发，并且各个光束同步并行二维扫描，一个光束对应扫描完一个区域，各个区域之间彼此相邻并且不重叠构成完整样本成像面层，并且在进行扫描时，控制各个光束分别沿纵向逐点扫描和沿横向逐步扫描，以实现对待成像样品进行完整扫描的目的。

[0064] 步骤S2、采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有的多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同。

[0065] 由于待成像样品内分布有荧光物质，当各个光束对待成像样品进行扫描激发时，则各个区域内的荧光物质发出荧光，从而得到待成像样品激发出的荧光信号。多个区域激发光的阵列点同时激发产生双光子荧光信号，并且由扫描产生整个样品的荧光信号。

[0066] 由于各个光束分别对应扫描一个区域，各个区域共同组成待成像样品成像面，因此通过接收到多个区域激发出的荧光信号，可以得到整个待成像样品激发出的荧光信号。各个荧光信号对应一个荧光结构光图像，各个区域内均得到多个荧光结构光图像，每个区域内得到的荧光结构光图像对应一个应荧光结构光图像组，整个待成像样品的全部区域组成一个荧光结构光图像集，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不完全相同，也即是各个荧光结构光图像组中包含对应激发光图案的取向相同，但相位不同的荧光结构光图像，也包含对应激发光图案的相位相同，取向不同的多个荧光结构光图像。

[0067] 进一步的，所述空间光调制器和扫描振镜同步，Y方向扫描初始点的光强为以上控制的空间光调制器可使荧光结构光图像中正弦照明结构光的相位和方向改变，并在不改变扫描振镜的扫描方向的前提下实现所需结构光的相位和条纹方向变化，通过控制调制函数变化有效实现了各区域彼此相邻且不重叠，避免了条纹方向改变导致区域重叠或每行初始强度不同导致的复杂调制函数问题。

[0068] 结合图3所示，各个光束经扫描振镜6沿待成像样品纵向进行逐点扫描，沿样品纵向的扫描结束后，扫描振镜6步进扫描即沿待成像样品横向移至下一位置，进行下一纵向位置的逐点扫描，如此循环，即可实现对整个待成像样品的扫描，获取整个待成像样品不同位置处荧光信息。探测器19在扫描开始时并行记录荧光信号，在整个样品的扫描完成时并行记录结束，得到一幅荧光结构光图像，并将所述荧光结构光图像存储在计算终端20中。

[0069] 步骤S3、提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

[0070] 当获取到的各个荧光结构光图像后，对荧光结构光图像中的各个荧光信号对应的频率分量进行分离，然后对分离出的各个频率分量进行复位，并将复位后的各个频率分量进行叠加整合，得到处于同一方向上的频率分量叠加值，最后将叠加值从频域转换到时域，实现同一个方向上的超分辨率图像。

[0071] 具体的，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

[0072] 对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

[0073] 同一个方向上采集到的荧光结构光图像公式组成一下矩阵：

[0074]

[0075] 其中， 为任意条纹取向下采集到的不同初始相位的荧光信号对应的荧光结构光图像，低频部分为 线性高频部分为 谐
波高频部分为 通过将上述各个频率分量分离，然后复位分离的频率
分量并线性相加，最后使用傅里叶逆变换得到某一个方向的超分辨的图像。

[0076] 通过调节调制函数的周期和相位，可以获取到不同取向和不同相位的荧光结构光图像，理论上若要在各个方向均提高待成像样品的成像分辨率，需要获取到所有取向上的荧光结构光图像，但是实验证明：基于某个方向上的成像分辨率增加也会使得其相邻方向上的成像分辨率相应增加，因此选取相差预设相位差值的多个方向上的超分辨率图像也可以取得较好的成像效果。在一种实施方式中，上述预设相位差值为120度，则通过分别计算3个条纹取向：0度，120度和240度的超分辨率图像，即可提高该样品平面内各个方向扫描区域的成像分辨率，可以理解：其他取向也有同样效果。

[0077] 在上述方法的基础上，本实施例还公开了一种多焦点超分辨光学显微成像的装置，结合图3所示，包括：

[0078] 激光器1，用于产生激光；

[0079] 强度调制器3，用于按照预设调制函数将所述激光调制成激发光；所述强度调制器为电光调制器或声光调制器；

[0080] 扫描振镜6，用于控制调制后的激发光对待成像样品扫描；

[0081] 空间光调制器10，用于将调制后的激发光分成多个光束，使得所述激发光对所述待成像样品进行分区域并行扫描；

[0082] 探测器19，用于采集待成像样品各个区域产生的荧光信号，得到各个区域荧光信号分别对应的荧光结构光图像集；其中，所述荧光结构光图像集包括：多个荧光结构光图像组；各个荧光结构光图像组中含有的多个荧光结构光图像，各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同。

[0083] 计算终端20，用于提取各个所述结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

[0084] 其中，所述强度调制器3，扫描振镜6，空间光调制器10，探测器19与计算终端20连接。计算终端20控制强度调制器3改变调制函数，以使透过的激光调制成光强随时间变化的激发光，以及控制所述扫描振镜6的扫描速度和范围，也用于控制空间光调制器10调制成多个子光束，另所述计算终端20还用于控制所述探测器19采集荧光结构光图像。

[0085] 在所述强度调制器3之前还设置有第一半波片2，在所述强度调制器3与所述扫描振镜6之间，还分别设置有第一反射镜4和第二半波片5。所述第一半波片2和第二半波片5分别用于调制入射光的偏振方向，所述第一反射镜4用于调节激发光的传播路径。

[0086] 具体的，为了实现更好的激发光传输效果，在所述扫描振镜6和所述空间光调制器10之间设置有扩束准直装置；

[0087] 所述扩束准直装置包括：激光扩束镜7和激光准直镜8；

[0088] 所述激光扩束镜7，用于扫描振镜发出的调制后的激发光进行扩束；

[0089] 所述激光准直镜8，用于对所述激光扩束镜扩束后的激发光进行准直。

[0090] 在所述激光准直镜8之后，还设置有第二反射镜9，所述第二反射镜9用于调节光路的传输方向，使得从所述激光准直镜8中传出的激发光反射到空间光调制器10上。

[0091] 进一步的，所述空间光调制器10与所述探测器19之间的光路中设置有凸透镜11、管镜12、第一滤光片13和双色镜14；所述空间光调制器10处于所述凸透镜11的前焦面上，所述凸透镜11的后焦面与所述管镜12的前焦面重合；所述第一滤光片13用于对激发光进行过滤，所述双色镜14用于导出所述荧光。

[0092] 在一种实施方式中，本步骤中，在空间光调制器10与凸透镜11和管镜12构成4f系统。空间光调制器10放置到凸透镜11的前焦面上，凸透镜11的后焦面和管镜12前焦面重合。多个子光束激发光经过凸透镜11后，在凸透镜11的后焦面上形成所需的多个焦点，在扫描振镜6扫描作用后，多个焦点同时进行扫描。

[0093] 本发明实施例中，管镜12的后焦面与物镜15的前焦面重合，对每一个扫描焦点来说，经过管镜12后，发射出平行光，分别透过第一滤光片13，双色镜14反射后经物镜15聚焦到待成像样品16上。对所有的光束来说，管镜12前焦面位置处扫描焦点与待成像样品上扫描焦点一一对应，待成像样品面上多个光束经聚焦形成激发光阵列点分别投射至待成像样品16的各个区域，在扫描振镜6扫描时，沿待成像样品16纵向对各子区域进行逐点扫描，各子区域内的荧光物质在激发光阵列点的作用下发出荧光。对各个子区域纵向的并行逐点扫描结束后，沿待成像样品16横向对各个区域并行进行步进扫描，即调整激发光阵列点在待成像样品16横向的位置。循环执行上述逐点扫描和步进扫描，直至完成对待成像样品16各个子区域的扫描。

[0094] 在一种实施方式中，双色镜14设于物镜15与发射滤光片17之间，双色镜14对脉冲激发光高反，对荧光高透，双色镜14与各个光束之间的夹角为45°或135°。荧光光束经双色镜14透射后的光路上依次设有发射滤光片17、成像透镜18和探测器19。发射滤光片17为带通滤光片，对激发光高反，只允许荧光信号通过。

[0095] 本发明实施所提供的所述方法，通过利用空间光调制器，将激发光调制成多个光束，同步照射到待成像样品上，实现多焦点的同步扫描，从而有效解决单点扫描时成像时间长的问题，并且本实施例中利用非正弦荧光结构光的包含高次谐波的频率分量叠加重构待成像样品的超分辨率图像，从而实现高速成像条件下的双光子荧光结构光超分辨成像，对比衍射极限，其成像分辨率提高3倍甚至更高，且不需要荧光饱和激发。

[0096] 本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

[0097] 应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制[0098] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。