一种快速获取DNA凝聚物的方法转让专利
申请号 : CN201911349958.0
文献号 : CN110964718B
文献日 : 2021-08-13
发明人 : 王艳伟 , 戴庭辉 , 罗胜 , 吕方怡 , 许诗雨 , 陈浩迪
申请人 : 温州大学
摘要 :
本发明涉及一种快速获取DNA凝聚物的方法，在包含水和乙醇的混合溶液中加入镁盐、待凝聚的DNA，所述包含水和乙醇的混合溶液为酸性或加入酸试剂使包含水和乙醇的混合溶液变为酸性。本发明采用不同PH值的缓冲溶液进行研究PH值、乙醇浓度、镁离子三者共同作用对DNA凝聚的影响，发现PH越低、乙醇浓度越高，DNA凝聚作用越大，DNA尺寸缩短时间明显加快，尤其是在PH≤6的体系下，乙醇浓度对DNA凝聚的影响明显增大。
权利要求 :
1.一种快速获取DNA凝聚物的方法，其特征在于：在包含水和乙醇的混合溶液中加入镁盐、待凝聚的DNA，所述包含水和乙醇的混合溶液为缓冲溶液和乙醇的混合溶液；
所述乙醇在缓冲溶液和乙醇的混合溶液中的体积分数为大于或等于10％；
所述包含水和乙醇的混合溶液的PH小于6；
‑1
所述缓冲溶液为5mmol·L Tris缓冲液；
在缓冲溶液和乙醇的混合溶液中镁离子的浓度为3mM。
说明书 :
一种快速获取DNA凝聚物的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种快速获取DNA凝聚物的方法。
背景技术
[0002] DNA是遗传信息的载体,高度缩合且有序排列的DNA结构保持了基因组的稳定性，使复制得以顺利完成。基因治疗是将人的健康基因或是拥有治疗作用的基因通过适当的运
载媒介，导入人体的致病细胞，以纠正致病基因，从而达到治疗疾病的目的。随着基因治疗
研究的兴起，人们对DNA凝聚的研究产生新的兴趣，因为DNA凝聚提供基因治疗中基因输送
中的重要工具。DNA凝聚是伸展的DNA分子塌缩形成紧凑有序机构的过程，一般包含一个或
几个分子，由于形成环状结构，DNA尺寸明显变小，可以融入细胞或病毒内的非常小的空间。
导致DNA凝聚的凝聚剂或者说配体有很多，比如多价阳离子、乙醇、蛋白质、中性的凝聚聚合
物、阳离子脂质体和一些抗癌药物等，在这些凝聚剂的作用下，DNA会凝聚成不同的形态。
载媒介，导入人体的致病细胞，以纠正致病基因，从而达到治疗疾病的目的。随着基因治疗
研究的兴起，人们对DNA凝聚的研究产生新的兴趣，因为DNA凝聚提供基因治疗中基因输送
中的重要工具。DNA凝聚是伸展的DNA分子塌缩形成紧凑有序机构的过程，一般包含一个或
几个分子，由于形成环状结构，DNA尺寸明显变小，可以融入细胞或病毒内的非常小的空间。
导致DNA凝聚的凝聚剂或者说配体有很多，比如多价阳离子、乙醇、蛋白质、中性的凝聚聚合
物、阳离子脂质体和一些抗癌药物等，在这些凝聚剂的作用下，DNA会凝聚成不同的形态。
[0003] 人们提出了几个理论模型来描述聚电解质周围的平衡离子分布的原理。在溶液中，DNA凝聚高度依赖于抗衡离子的化合价。需要化合价为3或化合价更大的阳离子来克服
核酸片段之间固有的静电排斥。通常在细胞中发现的多价阳离子是多胺，例如亚精胺和精
胺，它们在细胞增殖和生长中发挥重要作用。据推测，DNA主链的89‑90％的磷酸电荷必须被
中和，才能使DNA在各种离子条件下发生缩合。
核酸片段之间固有的静电排斥。通常在细胞中发现的多价阳离子是多胺，例如亚精胺和精
胺，它们在细胞增殖和生长中发挥重要作用。据推测，DNA主链的89‑90％的磷酸电荷必须被
中和，才能使DNA在各种离子条件下发生缩合。
[0004] 然而，在生物细胞中比较常见的小型抗衡离子，如Na+，K+，Ca2+和Mg2+等化合价小于3的金属阳离子，尽管它们有对DNA骨架具有高亲和力可以中和大部分DNA电荷，但它们不能
2+ 2+
引起DNA凝聚。在生物系统中广泛分布的二价阳离子Mg 和Ca ，在与复制、转录和重组相关
的许多酶活性中起重要作用。我们发现在受限的环境中，例如病毒衣壳内部，即使二价抗衡
2+ [1]
离子(例如Mg )也会引起强烈且非单调的作用 。在另一种限制DNA构型的环境中，即二维
[2] 2+
系统中 ，也观察到了二价抗衡离子引起的DNA凝聚。二价抗衡离子例如Mg ，在密闭环境
(如噬菌体内部的衣壳)中对DNA的凝结具有强烈影响，类似于价态较高的抗衡离子。细胞内
pH调节对于控制细胞周期和细胞的增殖能力是重要的，并且pH调节的基于DNA的纳米材料
和纳米装置具有用于体内成像的作用，有希望应用于临床诊断和药物递送。因此，研究各pH
2+
值下Mg 与DNA的相互作用，在医学上以及生命科学领域都具有举足轻重的意义。
2+ 2+
引起DNA凝聚。在生物系统中广泛分布的二价阳离子Mg 和Ca ，在与复制、转录和重组相关
的许多酶活性中起重要作用。我们发现在受限的环境中，例如病毒衣壳内部，即使二价抗衡
2+ [1]
离子(例如Mg )也会引起强烈且非单调的作用 。在另一种限制DNA构型的环境中，即二维
[2] 2+
系统中 ，也观察到了二价抗衡离子引起的DNA凝聚。二价抗衡离子例如Mg ，在密闭环境
(如噬菌体内部的衣壳)中对DNA的凝结具有强烈影响，类似于价态较高的抗衡离子。细胞内
pH调节对于控制细胞周期和细胞的增殖能力是重要的，并且pH调节的基于DNA的纳米材料
和纳米装置具有用于体内成像的作用，有希望应用于临床诊断和药物递送。因此，研究各pH
2+
值下Mg 与DNA的相互作用，在医学上以及生命科学领域都具有举足轻重的意义。
[0005] DNA作为一种生物大分子，与中性高分子和简单电解质相比，它是一种有着不同特性的聚电解质。当溶解于极性溶剂时，DNA将电离成高带电量的聚离子，且周围布满了许多
小的平衡离子。平衡离子凝聚理论、蒙特卡洛模拟、解泊松‑玻尔兹曼方程等理论研究结果
表明平衡离子在聚电解质表面凝聚形成一种薄层结构。从Manning的平衡离子凝聚理论可
知，平衡离子能中和DNA上的大部分电荷，但DNA上还有部分未被中和的电荷，DNA分子之间
[3]
还存在着静电排斥力。如何克服这个剩余静电排斥力，Shklovskii 研究小组提出了一种
新的理论解释。他们认为，由于强的横向排斥效应，平衡离子在DNA表面形成了一种类似
Wigner晶体结构的强关联流体结构。吸附在DNA表面的平衡离子屏蔽了DNA的电荷，从而使
得DNA间的排斥力减小，当DNA之间的静电排斥力小于静电吸引力时，DNA发生凝聚。由于溶
液中DNA的静电特性比较好，在实验上通常测量电泳迁移率来衡量DNA上的有效电荷。而导
致DNA凝聚的凝聚剂或者说配体有很多，比如说多价离子、乙醇、蛋白质、中性的凝聚聚合
物、阳离子脂质体和一些抗癌药物等，在这些药物作用下DNA会凝聚成不同的形态，这种现
象引起了不同领域的关注和研究。在不良溶剂中对冷凝机理的研究较少，对此我们知之甚
少。最近，MacKin Tosh和同事预测，半柔性聚合物在不良溶剂中的崩解是通过一系列称为
“网球拍”的长寿命、亚稳定的中间体发生的。对于该机理的实验研究，乙醇可以用作DNA的
不良溶剂，并且可以广泛用于化学，生物学和医学领域，因此乙醇可以作为一种很好的选
[4]
择。Fang等人 研究发现从乙醇浓度为0％的全B型到乙醇浓度>25％的全A型DNA转换。而且
[5]
二价金属离子在非特殊情况下一般不能引起DNA凝聚 ，但在乙醇(体积分数大约是15％)‑
[6]
水混合体系中能引起DNA凝聚 。醇及中性或阴离子聚合物也可以引起DNA凝聚。高浓度乙
[7]
醇通常用于沉淀DNA，但要控制好条件，它可以使DNA发生凝聚 。乙醇是半柔性DNA的不良
溶剂，使DNA与环境之间的相互作用较差，并且DNA倾向于拥挤成更紧凑的形态。因此，对乙
2+
醇与DNA相互作用的研究可能会提供有深刻见解的信息，以了解第二个冷凝机制。而且Mg 、
乙醇等药品对DNA凝聚的作用已经被广泛揭示，但是乙醇和pH值对镁离子导致DNA凝聚的协
2+
同作用的研究还未被深入研究。所以，揭示不同pH值、不同体积分数的乙醇和Mg 对DNA的影
响有重大意义。
小的平衡离子。平衡离子凝聚理论、蒙特卡洛模拟、解泊松‑玻尔兹曼方程等理论研究结果
表明平衡离子在聚电解质表面凝聚形成一种薄层结构。从Manning的平衡离子凝聚理论可
知，平衡离子能中和DNA上的大部分电荷，但DNA上还有部分未被中和的电荷，DNA分子之间
[3]
还存在着静电排斥力。如何克服这个剩余静电排斥力，Shklovskii 研究小组提出了一种
新的理论解释。他们认为，由于强的横向排斥效应，平衡离子在DNA表面形成了一种类似
Wigner晶体结构的强关联流体结构。吸附在DNA表面的平衡离子屏蔽了DNA的电荷，从而使
得DNA间的排斥力减小，当DNA之间的静电排斥力小于静电吸引力时，DNA发生凝聚。由于溶
液中DNA的静电特性比较好，在实验上通常测量电泳迁移率来衡量DNA上的有效电荷。而导
致DNA凝聚的凝聚剂或者说配体有很多，比如说多价离子、乙醇、蛋白质、中性的凝聚聚合
物、阳离子脂质体和一些抗癌药物等，在这些药物作用下DNA会凝聚成不同的形态，这种现
象引起了不同领域的关注和研究。在不良溶剂中对冷凝机理的研究较少，对此我们知之甚
少。最近，MacKin Tosh和同事预测，半柔性聚合物在不良溶剂中的崩解是通过一系列称为
“网球拍”的长寿命、亚稳定的中间体发生的。对于该机理的实验研究，乙醇可以用作DNA的
不良溶剂，并且可以广泛用于化学，生物学和医学领域，因此乙醇可以作为一种很好的选
[4]
择。Fang等人 研究发现从乙醇浓度为0％的全B型到乙醇浓度>25％的全A型DNA转换。而且
[5]
二价金属离子在非特殊情况下一般不能引起DNA凝聚 ，但在乙醇(体积分数大约是15％)‑
[6]
水混合体系中能引起DNA凝聚 。醇及中性或阴离子聚合物也可以引起DNA凝聚。高浓度乙
[7]
醇通常用于沉淀DNA，但要控制好条件，它可以使DNA发生凝聚 。乙醇是半柔性DNA的不良
溶剂，使DNA与环境之间的相互作用较差，并且DNA倾向于拥挤成更紧凑的形态。因此，对乙
2+
醇与DNA相互作用的研究可能会提供有深刻见解的信息，以了解第二个冷凝机制。而且Mg 、
乙醇等药品对DNA凝聚的作用已经被广泛揭示，但是乙醇和pH值对镁离子导致DNA凝聚的协
2+
同作用的研究还未被深入研究。所以，揭示不同pH值、不同体积分数的乙醇和Mg 对DNA的影
响有重大意义。
[0006] [1]Evilevitch,Alex,Fang,Tai L,Yoffe,Aron M,Castelnovo,Martin,Donald C.Effects of Salt Concentrations and Bending Energy on the Extent of Ejection
of Phage Genomes.Biophysical Journal.2008；94:1110‑20.
of Phage Genomes.Biophysical Journal.2008；94:1110‑20.
[0007] [2]Koltover I,Wagner K,Safinya CR.DNA Condensation in Two Dimensions.Proc Natl Acad Sci U S A.2000；97:14046.
[0008] [3]Nguyen T T,Grosberg A Y,Shklovskii B I.Screening of a charged particle by multivalent counterions in salty water:Giant charge inversion[J]
.The Journal of Chemical Physics,2000,113(3):1110‑1125.
.The Journal of Chemical Physics,2000,113(3):1110‑1125.
[0009] [4]Y.Fang,T.Spisz and J.Hoh,Nucleic Acids Res.,1999,27,1943.
[0010] [5]Yoshikawa,V.V.Vasilevskaya A.R.Khokhlov Y.Matsuzawa and K.,Collapse of single DNA molecule in poly(ethylene glycol)
solutions.J.Chem.Phys.,1995.102:16.
solutions.J.Chem.Phys.,1995.102:16.
[0011] [6]王艳伟,胡高铭,林瑜.乙醇与三氯六氨络合钴协同作用导致的DNA凝聚[J].浙江大学学报(理学版),2012(04):56‑61.
[0012] [7]张文科,单分子水平高分子相互作用的AFM成像与单分子力谱研究.高分子学报,2011.9:913‑922.
发明内容
[0013] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种快速获取DNA凝聚物的方法。
[0014] 本发明所采取的技术方案如下：一种快速获取DNA凝聚物的方法，在包含水和乙醇的混合溶液中加入镁盐、待凝聚的DNA，所述包含水和乙醇的混合溶液为酸性或加入酸试剂
使包含水和乙醇的混合溶液变为酸性。
使包含水和乙醇的混合溶液变为酸性。
[0015] 所述包含水和乙醇的混合溶液为缓冲溶液和乙醇的混合溶液。
[0016] 所述乙醇在缓冲溶液和乙醇的混合溶液中的体积分数为大于或等于10％。
[0017] 所述包含水和乙醇的混合溶液的PH小于或等于6。
[0018] 本发明的有益效果如下：常规研究平衡离子与DNA的凝聚关系一般采用弱碱性或中性的缓冲溶液进行试验，本发明采用不同PH值的缓冲溶液进行研究PH值、乙醇浓度、镁离
子三者共同作用对DNA凝聚的影响，发现PH越低、乙醇浓度越高，DNA凝聚作用越大，DNA尺寸
缩短时间明显加快，尤其是在PH≤6的体系下，乙醇浓度对DNA凝聚的影响明显增大。
子三者共同作用对DNA凝聚的影响，发现PH越低、乙醇浓度越高，DNA凝聚作用越大，DNA尺寸
缩短时间明显加快，尤其是在PH≤6的体系下，乙醇浓度对DNA凝聚的影响明显增大。
附图说明
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据
这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据
这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
[0020] 图1为磁镊示意图；
[0021] 图2在不同pH值、不同浓度的酒精与3mM Mg2+环境下诱导的DNA的AFM形态图。(a)‑2+ 2+
(c):3mMMg ,pH＝8.0、6.0、5.0；(d)‑(f):3mMMg ,10％乙醇，pH＝8.0、6.0、5.0；(g)‑(i):
2+ 2+
3mMMg ,20％乙醇，pH＝8.0、6.0、5.0；(j)‑(l):3mMMg ,30％乙醇，pH＝8.0、6.0、5.0；
(c):3mMMg ,pH＝8.0、6.0、5.0；(d)‑(f):3mMMg ,10％乙醇，pH＝8.0、6.0、5.0；(g)‑(i):
2+ 2+
3mMMg ,20％乙醇，pH＝8.0、6.0、5.0；(j)‑(l):3mMMg ,30％乙醇，pH＝8.0、6.0、5.0；
[0022] 图3为在不同乙醇浓度下，DNA电泳迁移率与pH的关系；
[0023] 图4为在不同pH溶液环境下，DNA电泳迁移率与乙醇浓度的关系；
[0024] 图5为在3mMMg2+和5mM Tris中，以不同pH值和不同体积分数的DNA拉伸过程中用MT2+，pH 2+
测量的DNA延长时间曲线。(a)、(b)、(c)：3mM Mg ＝8.0，6.0，5.0。(d)，(e)，(f)：3mM Mg
2+
10％乙醇，pH＝8.0，6.0，5.0.(g)，(h)，(i)：3mM Mg 20％乙醇，pH＝8.0，6.0，5.0.(j，(k)，
2+
(l)：3mM Mg 30％乙醇，pH＝8.0，6.0，5.0；
测量的DNA延长时间曲线。(a)、(b)、(c)：3mM Mg ＝8.0，6.0，5.0。(d)，(e)，(f)：3mM Mg
2+
10％乙醇，pH＝8.0，6.0，5.0.(g)，(h)，(i)：3mM Mg 20％乙醇，pH＝8.0，6.0，5.0.(j，(k)，
2+
(l)：3mM Mg 30％乙醇，pH＝8.0，6.0，5.0；
[0025] 图6为在不同溶液环境中DNA收缩的过程中MT测量的DNA延伸时间曲线。
具体实施方式
[0026] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0027] 以下为采用三种实验手段—原子力显微镜(AFM)、单分子磁镊(MT)及动态光散射2+
(DLS)技术对DNA分子在不同pH值、不同体积分数的乙醇、3mM Mg 溶液下进行实验研究。用
AFM、MT、DLS分别研究了该环境下DNA凝聚形态、临界凝聚力和电泳迁移率的变化。
(DLS)技术对DNA分子在不同pH值、不同体积分数的乙醇、3mM Mg 溶液下进行实验研究。用
AFM、MT、DLS分别研究了该环境下DNA凝聚形态、临界凝聚力和电泳迁移率的变化。
[0028] 一、实验过程
[0029] 1.材料
[0030] 乙醇购自经科宏达公司(中国上海)，氯化镁等化学试剂购自Sigma‑Aldrich公司，－1
使用前用5mmol·L Tris缓冲液稀释。超纯水通过Milli‑Q系统(美国密理博公司)纯化的
电阻率为18.2MΩ·cm的纯化系统去离子与净化处理。双链噬菌体λ‑DNA(48502bp)购买于
‑1
New England Biolabs公司，DNA的原始浓度是500ng·μL 。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用于我们
的MT样品制备中，含有10mM磷酸盐，140mM NaCl，pH＝8.0。
使用前用5mmol·L Tris缓冲液稀释。超纯水通过Milli‑Q系统(美国密理博公司)纯化的
电阻率为18.2MΩ·cm的纯化系统去离子与净化处理。双链噬菌体λ‑DNA(48502bp)购买于
‑1
New England Biolabs公司，DNA的原始浓度是500ng·μL 。磷酸盐缓冲盐水(PBS)用于我们
的MT样品制备中，含有10mM磷酸盐，140mM NaCl，pH＝8.0。
[0031] 2.检测方法
[0032] 动态光散射
[0033] 动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)主要根据激光的改变来测定样品的性质，因此又称光子相关光谱(Photon Correlation Spectroscop，PCS)，因为光照射到
被测物质后会产生散射光，DLS就是通过检测散射光的强度及频率随时间的变化来探测物
质的大小和电位，其也能够测量光强变化与时间的关系。DLS技术广泛的应用于研究DNA与
平衡离子之间的相互作用，也可用于研究蛋白质及其它大分子的理化性质。在本实验中主
要使用DLS装置(Malvern Zetasizer nano ZS90)，并应用He‑Ne激光(l＝633nm)和雪崩光
电二极管(用于检测散射光)来测量物质的zeta电位和电泳迁移率。在外加电场的作用下，
聚电解质会向与其电荷相反的电极方向移动，与介质中的平衡离子作相对运动，我们把这
种现象称之为电泳。我们实验中的λ‑DNA可看成一种线性的强带电的聚电解质，DNA的电泳
迁移率μ由下式给出:
被测物质后会产生散射光，DLS就是通过检测散射光的强度及频率随时间的变化来探测物
质的大小和电位，其也能够测量光强变化与时间的关系。DLS技术广泛的应用于研究DNA与
平衡离子之间的相互作用，也可用于研究蛋白质及其它大分子的理化性质。在本实验中主
要使用DLS装置(Malvern Zetasizer nano ZS90)，并应用He‑Ne激光(l＝633nm)和雪崩光
电二极管(用于检测散射光)来测量物质的zeta电位和电泳迁移率。在外加电场的作用下，
聚电解质会向与其电荷相反的电极方向移动，与介质中的平衡离子作相对运动，我们把这
种现象称之为电泳。我们实验中的λ‑DNA可看成一种线性的强带电的聚电解质，DNA的电泳
迁移率μ由下式给出:
[0034]
[0035] 其中f(κr)是κr的函数，称为Henry函数，其中r是粒子半径，1/k是德拜长度，η为介质的粘度系数，是zeta电势，ε是介质的介电常数。这里利用DLS技术通过电泳法可以直接
测量被测粒子的zeta电位，再通过上式即可得到被测粒子的电泳迁移率。
测量被测粒子的zeta电位，再通过上式即可得到被测粒子的电泳迁移率。
[0036] 实验中，用移液器取1000μl待测溶液于离心管内，并将DNA在溶液中稀释至1ng.μ‑1
l 的浓度。在测量之前，需要先在室温下孵育5分钟。最后用移液器将离心管中的1000μl待
测混合液取出，转移到zeta毛细管样品池中，然后放在动态光散射样品槽中进行实验。在测
量过程中，样品池保持在25°的恒定温度。
l 的浓度。在测量之前，需要先在室温下孵育5分钟。最后用移液器将离心管中的1000μl待
测混合液取出，转移到zeta毛细管样品池中，然后放在动态光散射样品槽中进行实验。在测
量过程中，样品池保持在25°的恒定温度。
[0037] 原子力显微镜(AFM)成像
[0038] 实验仪器选用多模式原子力显微镜(JPK Instruments AG，Berlin Germany),工作模式为轻敲模式。实验中采用1 Hz的扫描速度采集图像,图像像素是512×512。使用4.2
版本的JPK Data Processing分析软件来分析DNA图像的高度、宽度等信息。AFM的工作过程
是通过内部悬臂一端的极小针尖和被测样品之间极微弱的原子间作用力，从而得到样品表
面的形貌信息。
版本的JPK Data Processing分析软件来分析DNA图像的高度、宽度等信息。AFM的工作过程
是通过内部悬臂一端的极小针尖和被测样品之间极微弱的原子间作用力，从而得到样品表
面的形貌信息。
[0039] 实验过程中，将1厘米×1厘米的云母片，用双面胶平整的贴至规格为25.4×76.2mm的载玻片上，并用磨砂胶带仔细解离云母片直至云母片表面平整干净，用作DNA吸附
的基质。每个样品都在MgCl2溶液中加入定量的λ‑DNA和不同体积分数的乙醇并调至所需的
‑1 －1
pH值。使λ‑DNA的最终浓度为1ng·μL ，MgCl2的最终浓度为3mmol·L 。用移液器取50μL事
先配制好的混合物，将该混合物沉积在新在刚刚解离好的云母片上，并在室温下孵育5分
钟。孵育后，将云母片表面余液吸走，将样品用30μL水冲洗10次左右，然后使用氮气轻轻吹
干。置于装置盒里约0.5h待扫描。
的基质。每个样品都在MgCl2溶液中加入定量的λ‑DNA和不同体积分数的乙醇并调至所需的
‑1 －1
pH值。使λ‑DNA的最终浓度为1ng·μL ，MgCl2的最终浓度为3mmol·L 。用移液器取50μL事
先配制好的混合物，将该混合物沉积在新在刚刚解离好的云母片上，并在室温下孵育5分
钟。孵育后，将云母片表面余液吸走，将样品用30μL水冲洗10次左右，然后使用氮气轻轻吹
干。置于装置盒里约0.5h待扫描。
[0040] 磁镊实验
[0041] 单分子磁镊(MT)
[0042] 磁镊装置它由倒置显微镜和由个人计算机控制的电荷耦合器件(CCD)等组成，用于获得抗衡离子溶液中DNA的力谱。在我们的实验中，我们用自制的实验样品槽进行实验，
样品槽由两片载玻片中间放置一片0.17mm厚的盖玻片，侧面盖玻片与两个载玻片不对齐，
两端各插入一根玻璃微管，最后用玻璃胶固化密封中间空隙处就形成微槽。实验前把样品
槽硅烷化处理后，通入抗地高辛药品(1％)，竖直静置约6h；然后通入牛血清蛋白溶液(BSA，
5％)，竖直静置约30min左右；最后把修饰好的DNA、链霉亲和素、磁球三者混合之后通入样
品槽，静置1h放在倒置显微镜下寻找样品槽内的单根DNA分子(如图1所示)。用磁铁通对DNA
上面的磁球施加拉力，从而起到拉伸DNA的目的。实验中使用微注射泵把配置好的药品注入
到样品槽使其与单根DNA反应，然后慢慢减小力，DNA的长度与时间的变化过程通过CCD记
录，并使用图像处理程序分析磁球运动，得出力谱曲线图。并根据垂直DNA方向顺磁球的布
朗运动测力的原理得出凝聚力。以下所述的凝聚力是临界凝聚力，为DNA第一次发生凝聚时
对应的凝聚力。
样品槽由两片载玻片中间放置一片0.17mm厚的盖玻片，侧面盖玻片与两个载玻片不对齐，
两端各插入一根玻璃微管，最后用玻璃胶固化密封中间空隙处就形成微槽。实验前把样品
槽硅烷化处理后，通入抗地高辛药品(1％)，竖直静置约6h；然后通入牛血清蛋白溶液(BSA，
5％)，竖直静置约30min左右；最后把修饰好的DNA、链霉亲和素、磁球三者混合之后通入样
品槽，静置1h放在倒置显微镜下寻找样品槽内的单根DNA分子(如图1所示)。用磁铁通对DNA
上面的磁球施加拉力，从而起到拉伸DNA的目的。实验中使用微注射泵把配置好的药品注入
到样品槽使其与单根DNA反应，然后慢慢减小力，DNA的长度与时间的变化过程通过CCD记
录，并使用图像处理程序分析磁球运动，得出力谱曲线图。并根据垂直DNA方向顺磁球的布
朗运动测力的原理得出凝聚力。以下所述的凝聚力是临界凝聚力，为DNA第一次发生凝聚时
对应的凝聚力。
[0043] 二、实验结果
[0044] 1.DNA在AFM下的形态
[0045] 利用AFM可能会改变不同pH值、不同浓度的乙醇溶液中DNA的实际形态。但用多价阳离子溶液处理吸附在表面上的DNA产生的圆环尺寸(即直径)类似于溶液中的环形，但具
有较小的高度(轴向)。也就是说吸附在云母表面上的DNA只是高度会被压缩，横向的尺寸并
不会有所改变，因此AFM只是将体系中的DNA形态变平，但其结构不会发生变化。所以为了能
2+
直接观察DNA形态的变化，我们使用AFM观察了DNA在不同pH值、不同体积分数的乙醇与Mg
环境下的形貌图。图2显示了在不同pH值(pH＝8.0‑5.0)和不同体积分数(0，10％，20％，
2+
30％)的乙醇与Mg 环境下的DNA的AFM图像。在图2(a‑c)中，我们看到云母片上的DNA呈自由
松散的线状，并未随pH值的降低而发生变化，我们找不到凝聚的DNA。但向不同pH值(pH＝
2+
8.0，6.0，5.0)的Mg ‑DNA溶液中加入10％乙醇，DNA的形态从自由的松散状态变为由许多网
络组成的花状结构，该结构由一个或多个DNA分子的交叉形成，如图2(d‑f)。图2(g‑i)显示
将乙醇体积分数增至20％时，DNA的形态从扭结状变为紧密的花状。图2(j‑l)显示将乙醇体
积分数增至30％时，DNA的形态D都是紧密的花状。该花状结构在中间具有由一个或多个DNA
2+
分子的交叉形成的核心，两边有一些自由松散的线状。从中我们可以看到在pH＝6的Mg ‑
DNA溶液中加入乙醇(体积分数10％)，当其浓度和pH值各低于其临界值，也可以引起DNA凝
聚，说明乙醇和pH值对镁离子导致DNA凝聚具有协同作用。我们还可以看到DNA的凝聚随着
乙醇体积分数的增加和pH值的降低而增强。可见，随着乙醇体积分数的升高和pH值的降低，
DNA凝聚效果明显增强。
有较小的高度(轴向)。也就是说吸附在云母表面上的DNA只是高度会被压缩，横向的尺寸并
不会有所改变，因此AFM只是将体系中的DNA形态变平，但其结构不会发生变化。所以为了能
2+
直接观察DNA形态的变化，我们使用AFM观察了DNA在不同pH值、不同体积分数的乙醇与Mg
环境下的形貌图。图2显示了在不同pH值(pH＝8.0‑5.0)和不同体积分数(0，10％，20％，
2+
30％)的乙醇与Mg 环境下的DNA的AFM图像。在图2(a‑c)中，我们看到云母片上的DNA呈自由
松散的线状，并未随pH值的降低而发生变化，我们找不到凝聚的DNA。但向不同pH值(pH＝
2+
8.0，6.0，5.0)的Mg ‑DNA溶液中加入10％乙醇，DNA的形态从自由的松散状态变为由许多网
络组成的花状结构，该结构由一个或多个DNA分子的交叉形成，如图2(d‑f)。图2(g‑i)显示
将乙醇体积分数增至20％时，DNA的形态从扭结状变为紧密的花状。图2(j‑l)显示将乙醇体
积分数增至30％时，DNA的形态D都是紧密的花状。该花状结构在中间具有由一个或多个DNA
2+
分子的交叉形成的核心，两边有一些自由松散的线状。从中我们可以看到在pH＝6的Mg ‑
DNA溶液中加入乙醇(体积分数10％)，当其浓度和pH值各低于其临界值，也可以引起DNA凝
聚，说明乙醇和pH值对镁离子导致DNA凝聚具有协同作用。我们还可以看到DNA的凝聚随着
乙醇体积分数的增加和pH值的降低而增强。可见，随着乙醇体积分数的升高和pH值的降低，
DNA凝聚效果明显增强。
[0046] 2.电泳迁移率的测量
[0047] DNA的有效电荷会随其形态的改变而发生变化，也就是说DNA的电泳迁移率的变化不仅取决于DNA的表面电荷量，还可能取决于DNA的凝聚情况。因此通过DLS实验研究了DNA
的电泳迁移率在不同pH值(pH＝5‑8)、不同体积分数(0，10％，20％,30％，40％)的乙醇与
2+
Mg 环境中的变化关系。表1和图3、图4是DLS测量的实验结果，改变溶液的pH值或加入乙醇
2+
后Mg 导致的DNA的电泳迁移率变化趋势有所改变。当只改变pH值，溶液的pH＝8.0时DNA的
‑4 ‑1 ‑1
电泳迁移率为‑0.69×10 (cm2V s )，随着pH值的降低，DNA的电泳迁移率不断增加，且随
着pH值的降低DNA的电泳迁移率变化趋势趋于平缓。当溶液中加入乙醇后，DNA的电泳迁移
率的大小整体变大，并随着乙醇体积分数增大而增大。每个数据点是三个连续测量数据的
平均值，相应的标准偏差为误差。所以可以得到随着乙醇体积分数的增加和pH值的降低DNA
的电泳迁移率逐渐减小但始终为负。在pH大于6时，pH的改变对DNA电泳迁移率的影响极小；
在pH小于6时，pH的改变对DNA电泳迁移率的影响较大。在pH大于6时，乙醇的体积分数在低
浓度范围(0‑10％)的变化相比在较高浓度范围(10％‑40％)较弱；在pH小于6时，乙醇的体
积分数在低浓度范围(0‑10％)的变化相比在较高浓度范围(10％‑40％)更加明显。
的电泳迁移率在不同pH值(pH＝5‑8)、不同体积分数(0，10％，20％,30％，40％)的乙醇与
2+
Mg 环境中的变化关系。表1和图3、图4是DLS测量的实验结果，改变溶液的pH值或加入乙醇
2+
后Mg 导致的DNA的电泳迁移率变化趋势有所改变。当只改变pH值，溶液的pH＝8.0时DNA的
‑4 ‑1 ‑1
电泳迁移率为‑0.69×10 (cm2V s )，随着pH值的降低，DNA的电泳迁移率不断增加，且随
着pH值的降低DNA的电泳迁移率变化趋势趋于平缓。当溶液中加入乙醇后，DNA的电泳迁移
率的大小整体变大，并随着乙醇体积分数增大而增大。每个数据点是三个连续测量数据的
平均值，相应的标准偏差为误差。所以可以得到随着乙醇体积分数的增加和pH值的降低DNA
的电泳迁移率逐渐减小但始终为负。在pH大于6时，pH的改变对DNA电泳迁移率的影响极小；
在pH小于6时，pH的改变对DNA电泳迁移率的影响较大。在pH大于6时，乙醇的体积分数在低
浓度范围(0‑10％)的变化相比在较高浓度范围(10％‑40％)较弱；在pH小于6时，乙醇的体
积分数在低浓度范围(0‑10％)的变化相比在较高浓度范围(10％‑40％)更加明显。
[0048] 表1DNA的电泳迁移率在不同pH值(pH＝5‑8)、不同体积分数(0，10％，20％,30％，2+
40％)的乙醇与Mg 环境中的变化关系
40％)的乙醇与Mg 环境中的变化关系
[0049]
[0050] 3.凝聚力的测量
[0051] DNA的临界凝聚力的大小与DNA的有效电荷有关，当溶液内正电荷越多，DNA的磷酸根之间、磷酸根与云母表面之间的连接就会更加紧密。图5(a)‑(c)显示，当力减小时，DNA延
伸随时间线性变化，没有看到逐级跳跃。这个过程证明DNA不会发生凝结。当将10％乙醇添
2+
加到Mg ‑DNA溶液中时，当pH值从8.0到5.0时，DNA延长时间曲线变化跳跃，但图5(d)‑图5
(f)中的pH＝8.0除外。在图5(d)中的低体积分数乙醇中，pH＝8.0未发生DNA凝结。在图5
(e)‑图5(f)中，曲线显示，随着乙醇摩擦量的增加，从13μm到6μm的延长需要的时间更少。
伸随时间线性变化，没有看到逐级跳跃。这个过程证明DNA不会发生凝结。当将10％乙醇添
2+
加到Mg ‑DNA溶液中时，当pH值从8.0到5.0时，DNA延长时间曲线变化跳跃，但图5(d)‑图5
(f)中的pH＝8.0除外。在图5(d)中的低体积分数乙醇中，pH＝8.0未发生DNA凝结。在图5
(e)‑图5(f)中，曲线显示，随着乙醇摩擦量的增加，从13μm到6μm的延长需要的时间更少。
[0052] 在图5(g)‑图5(i)中，当将20％乙醇Mg2+‑DNA溶液中pH值从8.0添加到5.0的时，DNA延长时间曲线跳向和缩短相同长度的时间随着乙醇体积分数的增加而减小。时间从430s变
为5s，随着乙醇体积分数的增加，力增大。因此，该现象证明了凝聚强度随pH值降低、乙醇增
2+
加而增强。在图5(j)‑图5(l)中，当将30％乙醇添加到mg ‑DNA溶液中时，当pH值从8.0到
5.0时，DNA延长时间曲线有较大的跳跃，而减少相同长度的时间迅速缩短。时间从400s变为
2s，随着乙醇体积分数的增加，力增大。
为5s，随着乙醇体积分数的增加，力增大。因此，该现象证明了凝聚强度随pH值降低、乙醇增
2+
加而增强。在图5(j)‑图5(l)中，当将30％乙醇添加到mg ‑DNA溶液中时，当pH值从8.0到
5.0时，DNA延长时间曲线有较大的跳跃，而减少相同长度的时间迅速缩短。时间从400s变为
2s，随着乙醇体积分数的增加，力增大。
[0053] 图6(b)显示了在Mg2+、pH＝6.0、乙醇体积分数为20％的溶液中DNA收缩的过程。在图6(a)中我们可以看到在pH＝8.0、乙醇体积分数为10％环境下，即使施加非常小的拉力(<
0.5pN)，DNA的延伸也会随时间保持几乎恒定的长度。这表明在这种环境下DNA没有凝聚。然
2+
而在图6(b)中我们可以看到在Mg 、pH＝6.0、乙醇体积分数为20％环境下情况发生变化，其
中发生明显的DNA收缩过程，我们可以看到，DNA延伸时间曲线有跳跃性变化。这表明在这种
2+
环境下DNA发生凝聚。并可以测得它的凝聚力为1.7pN。由此我们也可得到乙醇、pH值与Mg
对DNA凝聚具有协同作用。当力大于10pN时，DNA的延伸随时间不连续且逐步变化，并且在最
后的延伸过程，DNA的延伸无法拉伸轮廓长度。这可能会伴随着DNA凝聚而改变DNA的持久长
2+
度。为了量化观察结果，我们测量了DNA在不同pH值、不同乙醇体积分数与Mg 环境下的凝聚
力，如下表1所示。在单分子实验中，磁球的位移在微米范围内，对应于施加磁力的变化小于
0.03pN。在大多数情况下，测量误差小于5％。因此，力可以被认为是恒定的，并且在实验过
程中不需要进一步调整。表2列出了DNA在不同pH值(pH＝8.0，6.0，5.0)和不同体积分数(0，
2+
10％，20％)的乙醇与Mg 环境下的凝聚力Fc。从表中我们可以看到，不同pH值(pH＝8.0、
6.0、5.0)的溶液中不加入乙醇时，Fc都为0PN当加入10％乙醇时，Fc分别变为0PN、1.3PN、
1.5PN。当乙醇增至20％时，Fc变为1.1PN、1.8PN、2.1PN。由此我们可以知道DNA凝聚力随着
乙醇体积分数的增加和pH值的降低而增大。与多价阳离子的情况相反，当乙醇浓度高达
2+
65％时，我们无法观察到DNA在很小的作用力下的致密性。但是，当Mg 添加到溶液中时，在
pH＝8.0时乙醇体积分数为20％就可以诱导DNA凝聚。并且当pH值降低时，乙醇引起DNA凝聚
的临界体积分数≤10％。因此，乙醇和pH值对镁离子导致DNA凝聚具有协同作用。
0.5pN)，DNA的延伸也会随时间保持几乎恒定的长度。这表明在这种环境下DNA没有凝聚。然
2+
而在图6(b)中我们可以看到在Mg 、pH＝6.0、乙醇体积分数为20％环境下情况发生变化，其
中发生明显的DNA收缩过程，我们可以看到，DNA延伸时间曲线有跳跃性变化。这表明在这种
2+
环境下DNA发生凝聚。并可以测得它的凝聚力为1.7pN。由此我们也可得到乙醇、pH值与Mg
对DNA凝聚具有协同作用。当力大于10pN时，DNA的延伸随时间不连续且逐步变化，并且在最
后的延伸过程，DNA的延伸无法拉伸轮廓长度。这可能会伴随着DNA凝聚而改变DNA的持久长
2+
度。为了量化观察结果，我们测量了DNA在不同pH值、不同乙醇体积分数与Mg 环境下的凝聚
力，如下表1所示。在单分子实验中，磁球的位移在微米范围内，对应于施加磁力的变化小于
0.03pN。在大多数情况下，测量误差小于5％。因此，力可以被认为是恒定的，并且在实验过
程中不需要进一步调整。表2列出了DNA在不同pH值(pH＝8.0，6.0，5.0)和不同体积分数(0，
2+
10％，20％)的乙醇与Mg 环境下的凝聚力Fc。从表中我们可以看到，不同pH值(pH＝8.0、
6.0、5.0)的溶液中不加入乙醇时，Fc都为0PN当加入10％乙醇时，Fc分别变为0PN、1.3PN、
1.5PN。当乙醇增至20％时，Fc变为1.1PN、1.8PN、2.1PN。由此我们可以知道DNA凝聚力随着
乙醇体积分数的增加和pH值的降低而增大。与多价阳离子的情况相反，当乙醇浓度高达
2+
65％时，我们无法观察到DNA在很小的作用力下的致密性。但是，当Mg 添加到溶液中时，在
pH＝8.0时乙醇体积分数为20％就可以诱导DNA凝聚。并且当pH值降低时，乙醇引起DNA凝聚
的临界体积分数≤10％。因此，乙醇和pH值对镁离子导致DNA凝聚具有协同作用。
[0054] 表2 DNA的凝聚力(Fc)随乙醇体积分数和pH值的变化
[0055]
[0056] 采用AFM、MT及DLS技术对不同pH值、不同乙醇体积分数的Mg2+溶液中的DNA分子进行了实验研究。通过AFM实验可以发现DNA的凝聚随着乙醇体积分数的增加和pH值的降低而
增强。通过MT实验可以测得DNA凝聚力随着乙醇体积分数的增加和pH值的降低而增大。并用
DLS实验测量了DNA在相同环境下的电泳迁移率的变化，可以看到随着酒精浓度的增加和pH
值的降低DNA的电泳迁移率逐渐减小但始终为负。由以上三个实验可以得到乙醇和pH值对
镁离子导致DNA凝聚具有协同作用。
增强。通过MT实验可以测得DNA凝聚力随着乙醇体积分数的增加和pH值的降低而增大。并用
DLS实验测量了DNA在相同环境下的电泳迁移率的变化，可以看到随着酒精浓度的增加和pH
值的降低DNA的电泳迁移率逐渐减小但始终为负。由以上三个实验可以得到乙醇和pH值对
镁离子导致DNA凝聚具有协同作用。
[0057] 以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。