一种巴戟天花叶病毒的鉴定及其核糖体RNA基因和应用

摘要

本发明公开了一种巴戟天花叶病毒的鉴定及其核糖体RNA基因和应用。本发明首次分离鉴定到巴戟天花叶病毒，并得到了其核糖体RNA基因的核苷酸序列，该基因可用于巴戟天花叶病毒的检测，并设计了可特异性检测巴戟天花叶病毒的引物，进一步构建了检测巴戟天花叶病毒的方法以及检测用试剂盒，该方法以及试剂盒的操作简便快速，检测结果准确可靠，为巴戟天花叶病毒的快速检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，对于监测和控制巴戟天花叶病毒引起的相关病害具有重要意义。

权利要求

1.一种巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因，其特征在于，所述核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述核糖体RNA基因在检测巴戟天花叶病毒和/或制备检测巴戟天花叶病毒的产品中的应用。

3.检测巴戟天花叶病毒的引物组合，其特征在于，所述引物组合能够同时扩增SEQ ID NO.1所示序列；所述引物组合由引物组F1/R1、引物组F2/R2和引物组F3/R3组成，所述引物组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示。

4.权利要求3所述引物组合在检测巴戟天花叶病毒和/或制备检测巴戟天花叶病毒的试剂盒中的应用。

5.一种检测巴戟天花叶病毒的方法，其特征在于，该方法是检测待测样本核酸中是否存在权利要求1所述核糖体RNA基因，若存在，则待测样品为巴戟天花叶病毒阳性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以待测样品核酸为模板，利用权利要求3所述引物组合进行PCR扩增反应，若扩增结果为阳性，则待测样品为巴戟天花叶病毒阳性。

7.一种检测巴戟天花叶病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求3所述引物组合。

8.权利要求7所述试剂盒在检测巴戟天花叶病毒中的应用。

说明书

一种巴戟天花叶病毒的鉴定及其核糖体RNA基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种巴戟天花叶病毒的鉴定及其核糖体RNA基因和应用。

背景技术

[0002] 巴戟天(Morinda officinalis How)，为茜草科(Rubiaceae)巴戟天属(Morinda)的多年生植物，是我国著名的“四大南药”之一，具有补肝肾、强筋骨的功效。近年来，随着中
医药保健事业的发展，巴戟天作为传统补益类中药逐渐受到重视。现代药理研究表明巴戟
天具有抗抑郁、提高记忆力、改善生殖功能、抗应激等作用。巴戟天的主要繁殖方式为扦插
繁殖，且为多年生植物，这些都为病害的发生以及传播创造了条件。病毒随无性繁殖在植物
体内逐代累积，严重影响了巴戟天的产量及质量。因此，巴戟天感染病毒的检测尤其是早期
检测至关重要。

[0003] 现有的植物病毒检测方法主要包括生物学检测法、电子显微镜检测法、血清学检测法和分子生物学检测法等。传统生物学检测主要是能够引起农作物严重病害的病毒，无
法适应症状较轻的、无症状的以及病毒含量较低的植物病毒的检测。而分子生物学检测植
物病毒的方法因其灵敏性高、特异性好等，具有传统检测方法无法比拟的优势。然而常用的
分子生物学检测均以传统分子生物学技术为基础，重要前提是对病毒的生物学特性、基因
组特性等有一定的预先了解，当我们对未知病原的了解极为有限或者完全缺乏，这些检测
方法的使用就会受到极大限制。

[0004] 目前，还未有关于巴戟天花叶病相关病原及检测手段的相关报道。因此，对巴戟天感染病毒的鉴定及检测的研究，对于监测和控制巴戟天花叶病具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有巴戟天花叶病检测技术的空白，提供一种巴戟天花叶病毒的鉴定及其核糖体RNA基因和应用。

[0006] 本发明的目的是提供一种巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因。

[0007] 本发明另一目的是提供所述核糖体RNA基因在检测巴戟天花叶病毒和/或制备检测巴戟天花叶病毒的产品中的应用。

[0008] 本发明又一目的是提供一组检测巴戟天花叶病毒的引物。

[0009] 本发明又一目的是提供所述引物在检测巴戟天花叶病毒和/或制备检测巴戟天花叶病毒的试剂盒中的应用。

[0010] 本发明又一目的是提供一种检测巴戟天花叶病毒的方法。

[0011] 本发明又一目的是提供一种检测巴戟天花叶病毒的试剂盒。

[0012] 本发明再一目的是提供所述方法或所述试剂盒在检测巴戟天花叶病毒中的应用。

[0013] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0014] 本发明首先提供了一种巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因，所述核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0015] 所述核糖体RNA基因由RNA1基因、RNA2基因和RNA3基因组成，序列总长度为8765bp，所述RNA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1～3421碱基序列；所述
RNA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第3422～6500碱基序列；所述RNA3基因
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第6501～8765碱基序列。

[0016] 所述核糖体RNA基因在检测巴戟天花叶病毒和/或制备检测巴戟天花叶病毒的产品中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

[0017] 另外，本发明还提供了一组检测巴戟天花叶病毒的引物，所述引物能够扩增SEQ ID NO.1所示序列或其片段。

[0018] 优选地，所述引物为引物组F1/R1、引物组F2/R2或引物组F3/R3，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示。

[0019] 引物F1的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：ATTCACTTCTCCACGGGTCG；

[0020] 引物R1的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：TCAACCAGAACCCTACTAACA；

[0021] 引物F2的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：TTGAACCACCGCCTATCTGT；

[0022] 引物R2的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：GCCACAGCCTTACTCAACCT；

[0023] 引物F3的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：TAACCCACGGTCGTATTGCT；

[0024] 引物R3的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)：CTAATACGCAACGAAATCACT。

[0025] 所述引物在检测巴戟天花叶病毒和/或制备检测巴戟天花叶病毒的试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

[0026] 本发明还提供了一种检测巴戟天花叶病毒的方法，该方法是检测待测样本核酸中是否存在所述核糖体RNA基因，若存在，则待测样品为巴戟天花叶病毒阳性。

[0027] 优选地，所述检测巴戟天花叶病毒的方法为：以待测样品核酸为模板，利用能够所述引物进行PCR扩增反应，若扩增结果为阳性，则待测样品为巴戟天花叶病毒阳性。

[0028] 另外，本发明还提供了一种检测巴戟天花叶病毒的试剂盒，所述试剂盒中包含上述引物。

[0029] 所述方法或所述试剂盒在检测巴戟天花叶病毒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

[0030] 本发明具有以下有益效果：

[0031] 本发明首次分离鉴定到巴戟天花叶病毒，并得到了其核糖体RNA基因的核苷酸序列，可应用于巴戟天花叶病的检测与监控。

[0032] 同时，应用所述巴戟天花叶病毒核糖体RNA基因设计了可特异性检测巴戟天花叶病毒的引物，能够准确、快速的检测待测样本是否受到了巴戟天花叶病毒的侵染；基于上述
引物，本发明还提供了一种检测巴戟天花叶病毒的方法以及检测用试剂盒，该方法以及试
剂盒的操作简便快速，检测结果准确可靠，为巴戟天花叶病毒的快速检测，尤其是检验检疫
工作提供了技术支持，对于监测和控制巴戟天花叶病毒引起的相关病害具有重要意义，具
有非常广泛的推广应用前景。

附图说明

[0033] 图1是巴戟天花叶病毒与黄瓜花叶病毒中的聚类分析结果图。

[0034] 图2是特异性引物用于检测巴戟天花叶病毒的结果图。

具体实施方式

[0035] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0036] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0037] 实施例1巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因的获得

[0038] 1、实验方法

[0039] 巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因的获得，具体步骤如下：

[0040] S1.收集巴戟天病叶；

[0041] S2.提取巴戟天病叶的总RNA；

[0042] S3.核糖体RNA文库构建：依照高通量测序文库构建流程，将以上总RNA构建成片段大小为500bp的双末端高通量测序文库；

[0043] S4.高通量测序；

[0044] S5.序列标签组装：采用SPAdes v.3.5.0软件进行序列标签组装，根据短测序片段之间的overlap(重叠区)关系，将测序片段组装为contig序列，并在contig序列的基础上，
结合双末端测序片段间的距离关系，进一步将contig序列组装为scaffold序列，在组装成
scaffold序列后，通过补gap策略，修补scaffold序列包含的空缺区域，以得到尽可能完整
的序列标签序列；

[0045] S6.序列标签注释、多样性分析和定量分析：将测序序列标签分别与NCBI的nt数据库的细菌库、真菌库和病毒库进行比对分析，采用blastn v2.5.0+软件进行比对分析；

[0046] S7.疑似病原的筛选：根据序列标签的注释信息、病原体数据库的检索信息和相关文献报道信息，检测与病症相符的潜在病原体，并依据序列检测丰度进行初步判定；

[0047] 一般情况下，病原体需要一定的数量才能使寄主患病，因此，我们依据疑似病原相关病症的一致性和病原的检测丰度，共同检测疑似病原。

[0048] 2、实验结果

[0049] 本发明得到的巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核糖体RNA基因由RNA1基因、RNA2基因和RNA3基因组成，序列总长度为8765bp，所述RNA1
基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列中第1～3473碱基序列；所述RNA2基因的核苷酸
序列如SEQ ID NO.1所示序列中第3474～6551碱基序列；所述RNA3基因的核苷酸序列如SEQ 
ID NO.1所示序列中第6552～8806碱基序列。

[0050] 经过序列比对，巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因与黄瓜花叶病毒的相似度仅为95％，存在序列差异。

[0051] 另外，巴戟天花叶病毒与黄瓜花叶病毒中的聚类分析结果如图1所示，可以看出，巴戟天花叶病毒与黄瓜花叶病毒在序列上存在差异，在图1中单独聚为一支，且巴戟天花叶
病毒与黄瓜花叶病毒寄主不同，巴戟天花叶病毒不能感染黄瓜等作物，与黄瓜花叶病毒同
属一类，但并非同种病毒。

[0052] 实施例2检测巴戟天花叶病毒的方法

[0053] 1、实验方法

[0054] (1)PCR扩增反应

[0055] 提取实施例所得巴戟天花叶病毒的总RNA提取的总RNA贮存于‑80℃，将总RNA反转录成cDNA文库。设计特异性引物(F1/R1引物组、F2/R2引物组和F3/R3引物组)，引物的核苷
酸序列分别如表1中的SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7所示；以cDNA文库为模板进行PCR检测，
PCR扩增体系如表2所示，扩增反应产物进行琼脂糖电泳，回收。

[0056] 表1 PCR检测所用的特异性引物

[0057]

[0058] 表2 PCR扩增体系

[0059]

[0060] PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，51℃～55℃(根据引物情况确定退火温度)退火30s；72℃延伸30s～1.5min(根据扩增片段长度确定该延伸时间，扩增1kb片
段需1min)，35个循环；72℃终延伸3min。

[0061] (2)序列比对

[0062] 将回收的片段进行测序，然后将测序结果与巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)进行比对，由此确定叶片上是否有巴戟天花叶病毒，并可由此推
测巴戟天花叶病毒是否可能是病原。

[0063] 2、检测结果

[0064] 特异性引物用于检测巴戟天花叶病毒的结果如图2所示，可以看出，利用特异性引物(F1/R1引物组、F2/R2引物组和F3/R3引物组)均能扩增出相应的目的条带，该扩增结果与
巴戟天花叶病毒的核糖体RNA基因的组装结果一致。

[0065] 实施例3巴戟天花叶病的检测

[0066] 在田间随机寻找到具有典型花叶症状的巴戟天叶片，收集；剪取巴戟天叶中的病斑区域，剪下的病斑材料使用液氮充分研磨，提取巴戟天病叶的总RNA；提取的总RNA贮存
于‑80℃，将总RNA反转录成cDNA文库；特异性扩增引物同实施例2。

[0067] 检测结果电泳图同图2，结果显示，三组引物均能扩增出相应的目的条带。

[0068] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。