一种叶酸含量的检测方法

摘要

本发明涉及成分检测分析技术领域，尤其是涉及一种叶酸含量的检测方法。所述叶酸含量的检测方法，包括如下步骤：将供试品溶液进行检测处理；所述供试品溶液的制备包括：将待测样品与缓冲溶液、氨水溶液混合均匀；所述缓冲溶液的pH为7.0～9.0。本发明将待测样品与缓冲溶液、氨水溶液混合，消除钙、铁对叶酸含量检测的影响，回收率在99.97％～104.55％之间，检测结果的准确性也得到了极大的提高。

权利要求

1.一种叶酸含量的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将供试品溶液进行检测处理，采用高效液相色谱法进行所述检测处理；

所述供试品溶液的制备包括：将待测样品研细后，先加入缓冲溶液，再与氨水溶液混合均匀；

所述待测样品为含钙和/或铁的叶酸制剂；

所述混合的温度为45～60℃；

所述缓冲溶液的pH为7.0～8.7；

所述缓冲溶液包括磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲溶液中的任一种；

所述待测样品、缓冲溶液、氨水溶液的比例为1g﹕（1.5～2.5）mL﹕（2～4）mL；所述氨水溶液的质量分数为0.3%～0.7%。

2.根据权利要求1所述的叶酸含量的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH为7.4～8.7。

3.根据权利要求1或2所述的叶酸含量的检测方法，其特征在于，所述混合的方式包括振荡混合；所述振荡混合的时间为5～10min；

混合均匀后，还包括：加水稀释，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

4.根据权利要求1所述的叶酸含量的检测方法，其特征在于，所述待测样品、缓冲溶液、氨水溶液的比例为1g﹕（1.8～2.2）mL﹕（2.5～3.5）mL。

5.根据权利要求1所述的叶酸含量的检测方法，其特征在于，所述待测样品中钙的含量为50～400mg/g和/或铁的含量为3～200mg/g。

6.根据权利要求1所述的叶酸含量的检测方法，其特征在于，将叶酸标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将所述供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在同样色谱条件下得到色谱峰面积，根据标准曲线得到所述供试品溶液中叶酸的浓度；根据计算公式计算待测样品中叶酸的含量，所述计算公式如下：其中：W：待测样品中叶酸的含量，单位ug/g；

C：由标准曲线计算得到叶酸的浓度，单位ug/mL；

V：待测样品稀释后体积，单位mL；

M：待测样品的质量，单位g。

7.根据权利要求6所述的叶酸含量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件包括：色谱柱：5μm 反相C18色谱柱或反相C8色谱柱；

流动相：pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液；

检测波长：280nm；

流速：1～1.5mL/min；

柱温：20～30℃；

进样量1～10μL。

说明书

一种叶酸含量的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及成分检测分析技术领域，尤其是涉及一种叶酸含量的检测方法。

背景技术

[0002] 叶酸(folic acid)由蝶啶、对氨基苯甲酸和L‑谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸或维生素B9。1941年因为从菠菜中发现了这种生物因子，所以被命名为叶酸。叶酸富含于新鲜的水果、蔬菜、肉类食品中，食物中的叶酸若经长时间烹煮，会损失50％～90％。叶酸主要在十二指肠及近端空肠部位吸收。人体内叶酸储存量为5～20mg。叶酸主要经尿和粪便排出体外，每日排出量为2～5ug。

[0003] 叶酸是一种水溶性维生素，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症。叶酸对孕妇尤其重要，研究表明准妈妈在备孕期间就服用0.4毫克叶酸可以下降胎儿神经管畸形率85％，此项结果至今被全球50多个国家广泛应用。此外，5毫克叶酸是用来治疗女性贫血，市场上的叶酸补充剂或复合补充剂产品种类繁多，有必要进行这类补充剂中叶酸含量测定方法研究。

[0004] 当叶酸补充剂产品成分复杂，尤其是钙、铁等矿物质存在时，叶酸的含量测定结果与理论值相差较大，仅为理论值的50‑85％。现有的叶酸含量的检测方法容易受到产品中钙、铁等的影响，导致叶酸含量结果不准确。因而，提供一种选择性好、准确性好的检测叶酸的方法具有重要意义。

[0005] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种叶酸含量的检测方法，该检测方法选择性好，灵敏度高，准确度高。

[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

[0008] 一种叶酸含量的检测方法，包括如下步骤：

[0009] 将供试品溶液进行检测处理；

[0010] 所述供试品溶液的制备包括：将待测样品与缓冲溶液、氨水溶液混合均匀；所述缓冲溶液的pH为7.0～9.0。

[0011] 本发明的检测方法中，待测样品采用一定pH的缓冲溶液处理，能够调整供试品溶液中铁和/或钙的状态，避免了对叶酸的干扰，提高检测结果的准确度等。

[0012] 在本发明的具体实施方式中，所述缓冲溶液的pH为7.0～8.9，优选为7.0～8.7，进一步优选为7.4～8.7。

[0013] 在本发明的具体实施方式中，所述待测样品包括含钙和/或铁的叶酸制剂。

[0014] 在本发明的具体实施方式中，所述待测样品中钙的含量为50～400mg/g；铁的含量为3～200mg/g。

[0015] 在本发明的具体实施方式中，所述制剂可以为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂等中的任一种。制剂中可以含有常规辅料和添加剂等。

[0016] 当叶酸制剂中含有钙、铁等矿物质时，叶酸含量的测定结果与理论值相差较大。以钙铁维生素D叶酸片(样品规格：1.0g/片，叶酸含量：200μg/片)为例，采用《中国药典2015年版》中“叶酸片”项下“含量测定”方法检测该叶酸产品中叶酸含量，检测结果为107.87μg/片，仅为理论值的53.94％。由于叶酸易溶于稀碱中，《美国药典》、《英国药典》以及《中国药典》中样品的制备均采用氨水溶液或氢氧化钠溶液对样品进行制备。但是钙铁维生素D叶酸片中富马酸亚铁含量较大，由于亚铁盐与氢氧化铵或碱金属的氢氧化物溶液作用时，有部分氢氧化物沉淀，将叶酸包裹，不能溶出，使得叶酸的含量检测结果偏低。

[0017] 本发明将待测样品与缓冲溶液、氨水溶液混合，消除钙、铁对叶酸含量检测的影响，回收率在99.97％～104.55％之间；检测结果的准确性也得到了极大的提高。

[0018] 在本发明的具体实施方式中，将待测样品预先研细后，再与缓冲溶液、氨水溶液混合均匀。具体优选，将待测样品预先研细后，先加入缓冲溶液，再与氨水溶液混合均匀。

[0019] 在本发明的具体实施方式中，所述混合的温度为45～60℃。

[0020] 通过采用上述混合温度，提高待测样品及供试品溶液中叶酸的稳定性，使检测方法稳定、回收率高；同时能够保证检测结果的准确性。

[0021] 在本发明的具体实施方式中，所述混合的方式包括振荡混合。混合均匀后，还包括：加水稀释，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

[0022] 在本发明的具体实施方式中，所述振荡混合的时间为5～10min。

[0023] 其中，加水稀释的倍数可根据实际需求进行调整。如使待测样品的浓度为6～14μg/mL，优选为8～12μg/mL，如10μg/mL。

[0024] 在本发明的具体实施方式中，所述缓冲溶液中包括磷酸盐或Tris，优选包括磷酸盐。可选的，所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾。

[0025] 采用含有磷酸盐的缓冲溶液体系，能够进一步提高检测结果的准确度等。

[0026] 在本发明的具体实施方式中，所述缓冲溶液包括磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲溶液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲溶液中的任一种。

[0027] 在本发明的具体实施方式中，所述氨水溶液的质量分数为0.3％～0.7％，优选为0.4％～0.6％，如0.5％。

[0028] 在本发明的具体实施方式中，所述待测样品、缓冲溶液、氨水溶液的比例为1g﹕(1.5～2.5)mL﹕(2～4)mL，优选为1g﹕(1.8～2.2)mL﹕(2.5～3.5)mL，如1g﹕2mL﹕3mL。

[0029] 在本发明的具体实施方式中，采用高效液相色谱法进行检测处理。

[0030] 在本发明的具体实施方式中，将叶酸标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在同样色谱条件下得到色谱峰面积，根据标准曲线得到供试品溶液中叶酸的浓度。计算公式如下：

[0031]

[0032] 其中：W：待测样品中叶酸的含量，单位ug/g；

[0033] C：由标准曲线计算得到叶酸的浓度，单位ug/mL；

[0034] V：待测样品稀释后体积，单位mL；

[0035] M：待测样品的质量，单位g。

[0036] 其中，V表示待测样品稀释后的体积，具体为：将待测样品与缓冲溶液、氨水溶液混合均匀后，再加水稀释后，得到的液体的体积。

[0037] 标准溶液的配制、仪器的型号及运行情况，可能会导致标准曲线略有不同，但在保证标准曲线及待测样品测试情况相同的情况下，则不影响检测结果的计算。

[0038] 在本发明的具体实施方式中，采用氨水和水配制所述叶酸对照品溶液。具体的，称取叶酸对照品，采用0.5％氨水溶液溶解稀释得到浓度为1mg/mL的贮备溶液；采用水稀释至目标浓度，得到叶酸标准系列工作溶液。其中，叶酸标准系列工作溶液的浓度可以分别为14μg/mL，12μg/mL，10μg/mL，8μg/mL，6μg/mL。

[0039] 在本发明的具体实施方式中，所述高效液相色谱的条件包括：

[0040] 色谱柱：5μm反相C18色谱柱(250mm×4.6mm)或具有相同效果的色谱柱，如：反相C8色谱柱(250mm×4.6mm)；

[0041] 流动相：pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液；

[0042] 检测波长：280nm；

[0043] 流速：1～1.5mL/min，优选为1～1.2mL/min，如1.2mL/min；

[0044] 柱温：20～30℃，优选为23～27℃，如25℃；

[0045] 进样量1～10μL，优选为5～10μL，如10μL。

[0046] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0047] 对叶酸制剂进行特定的前处理，加入特定缓冲溶液，配合特定的混合温度，能够避免叶酸制剂中的钙、铁等对检测的影响并提高叶酸的稳定性；该检测方法选择性好，灵敏度高，准确度高；回收率在99.97％～104.55％。

附图说明

[0048] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0049] 图1为本发明实施例1提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0050] 图2为本发明实施例2提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0051] 图3为本发明实施例3提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0052] 图4为本发明实施例4提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0053] 图5为本发明实施例5提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0054] 图6为本发明实施例6提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0055] 图7为本发明实施例7提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0056] 图8为本发明实施例8提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0057] 图9为本发明实施例9提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0058] 图10为本发明实施例10提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0059] 图11为本发明实施例11提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0060] 图12为本发明实施例12提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0061] 图13为本发明实施例13提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0062] 图14为本发明实施例14提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0063] 图15为本发明实施例15提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0064] 图16为本发明实施例16提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0065] 图17为本发明实施例17提供的检测方法中供试品溶液的测试图谱；

[0066] 其中，上述测试图谱中标注YS的峰为叶酸对应的峰。

具体实施方式

[0067] 下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0068] 本发明中具体实施方式，采用Thermo U3000高效液相色谱仪进行检测。

[0069] 实施例1

[0070] 本实施例提供了一种叶酸含量的检测方法，包括如下步骤：

[0071] (1)试剂溶液的配制

[0072] pH＝8.0的缓冲溶液的配制：0.2mol/L的Na2HPO4 94.7mL与0.2mol/L的NaH2PO4 5.3mL，混匀即可；

[0073] 质量分数为0.5％的氨水溶液的制备：取5mL质量分数为25％的氨水加水定容至250mL即可；

[0074] 1mol/L的磷酸溶液的制备：取6.9mL质量分数为85％的磷酸稀释至100mL即可；

[0075] pH＝5.0的磷酸盐缓冲溶液的配制：取磷酸二氢钾2.0g，加水690mL溶解，加0.5mol/L四丁基氢氧化铵的甲醇溶液16mL、1mol/L磷酸溶液7mL与甲醇287mL，用1mol/L磷酸溶液或氨水溶液调节pH值至5.0；

[0076] (2)系统适用性检验对照品溶液的制备：

[0077] 精密称取叶酸对照品5.0mg，置于50mL棕色容量瓶中，加0.5％氨水溶液溶解并稀释定容至刻度，摇匀，作为贮备溶液①；

[0078] 精密量取贮备溶液①1mL，置于10mL棕色容量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，作为贮备溶液②；

[0079] 精密量取贮备溶液①2mL，置于10mL棕色容量瓶中，用水稀释定容至刻度，摇匀，作为贮备溶液③；

[0080] (3)叶酸标准系列工作溶液的制备

[0081] 分别精密量取贮备液①1.4mL，1.2mL，1.0mL，0.8mL，0.6mL，置10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制浓度分别为14μg/mL，12μg/mL，10μg/mL，8μg/mL，6μg/mL。滤过，取续滤液待测。

[0082] (4)供试品溶液的制备：

[0083] 取待测样品20片，研细，精密称取5.0000g，置于100mL容量瓶中加入步骤(1)配制的pH＝8.0的缓冲溶液10mL、0.5％氨水溶液15mL，保持容量瓶塞塞住的情况下，于水浴条件下振荡5min，水浴温度为50℃；振荡结束后，放冷，加水稀释定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液，供液相分析；其中，待测样品为钙铁维生素D叶酸片，样品规格：1.0g/片，叶酸添加量为200μg/片；

[0084] (5)高效液相色谱条件：

[0085] 色谱柱：5μm C18色谱柱(250mm×4.6mm)或具有相同效果的色谱柱；

[0086] 流动相：以步骤(1)中制备得到的pH＝5.0的磷酸盐缓冲液作为流动相；

[0087] 检测波长：280nm；

[0088] 流速：1.2mL/min；

[0089] 柱温：25℃；

[0090] 进样量：10μL；

[0091] (6)检验系统适用性检验：

[0092] 取叶酸对照品贮备溶液②注入液相色谱仪，进样5次，记录峰面积，叶酸峰的相对标准偏差应不大于2.0％；取叶酸对照品贮备溶液③注入液相色谱仪，进样2次，记录峰面积，含量在98％‑102％即可；

[0093] (7)测定方法：

[0094] 采用步骤(5)中的色谱条件，将叶酸标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在同样的色谱条件下，得到色谱峰面积，根据标准曲线得到供试品溶液中叶酸的浓度。然后根据计算公式计算待测样品中叶酸的含量，具体计算公式如下：

[0095]

[0096] 其中：W：待测样品中叶酸的含量，单位ug/g；

[0097] C：由标准曲线计算得到叶酸的浓度，单位ug/mL；

[0098] V：待测样品稀释后体积，单位mL；

[0099] M：待测样品的质量，单位g。

[0100] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为198.7μg/g，即198.7ug/片，为理论值的99.35％。

[0101] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图1所示。

[0102] 其中，具体的检测步骤顺序不局限于此，如各溶液的配制不分先后，可根据实际情况进行调整；比如可先配制供试品溶液，再配制贮备溶液以及叶酸标准系列工作溶液；也可同时配制供试品溶液以及贮备溶液等。

[0103] 实施例2

[0104] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0105] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝7.0的缓冲溶液，待测样品称样量为5.0088g。

[0106] 其中，pH＝7.0的缓冲溶液为磷酸氢二钠和柠檬酸的缓冲溶液，其配制方法包括：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液50.00mL加0.1mol/L柠檬酸溶液10.70mL，混匀即可。

[0107] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为197.31μg/g，即197.31ug/片，为理论值的98.66％。

[0108] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图2所示。

[0109] 实施例3

[0110] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0111] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝8.0的磷酸氢二钠和柠檬酸的缓冲溶液，待测样品称样量为5.0016g。

[0112] 其中，pH＝8.0的磷酸氢二钠和柠檬酸的缓冲溶液的配制方法包括：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液50.00mL加0.1mol/L柠檬酸溶液1.4mL，混匀即可。

[0113] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为204.38μg/g，即204.38ug/片，为理论值的102.19％。

[0114] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图3所示。

[0115] 实施例4

[0116] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0117] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝7.4的缓冲溶液，待测样品称样量为5.0009g。

[0118] 其中，pH＝7.4的缓冲溶液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液，其配制方法包括：15mol/L磷酸氢二钠溶液8.00mL加15mol/L磷酸氢二钾溶液2.00mL，混匀即可。

[0119] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为208.93μg/g，即208.93ug/片，为理论值的104.47％。

[0120] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图4所示。

[0121] 实施例5

[0122] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0123] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝8.0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液，待测样品称样量为5.0088g。

[0124] 其中，pH＝8.0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液的配制方法包括：15mol/L磷酸氢二钠溶液9.50mL加15mol/L磷酸氢二钾溶液0.50mL，混匀即可。

[0125] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为202.65μg/g，即202.65ug/片，为理论值的101.32％。

[0126] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图5所示。

[0127] 实施例6

[0128] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0129] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝8.7的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液，待测样品称样量为5.0054g。

[0130] 其中，pH＝8.7的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液的配制方法包括：15mol/L磷酸氢二钠溶液9.90mL加15mol/L磷酸氢二钾溶液0.10mL，混匀即可。

[0131] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为201.22μg/g，即201.22ug/片，为理论值的100.61％。

[0132] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图6所示。

[0133] 实施例7

[0134] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0135] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝7.5的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲溶液，待测样品称样量为5.0031g。

[0136] 其中，pH＝7.5的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲溶液的配制方法包括：0.2mol/mL的磷酸氢二钠溶液84.00mL加0.2mol/mL的磷酸二氢钠溶液16.00mL，混匀即可。

[0137] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为197.82μg/g，即197.82ug/片，为理论值的98.91％。

[0138] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图7所示。

[0139] 实施例8

[0140] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0141] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝7.5的Tris‑HCl缓冲溶液，待测样品称样量为5.0029g。

[0142] 其中，pH＝7.5的Tris‑HCl缓冲溶液的配制方法包括：0.1mol/L Tris碱溶液50.00mL加0.1mol/L盐酸40.30mL，用水定容至100mL，混匀即可。

[0143] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为170.26μg/g，即170.26ug/片，为理论值的85.13％。

[0144] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图8所示。

[0145] 实施例9

[0146] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0147] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝8.0的Tris‑HCl缓冲溶液，待测样品称样量为5.0047g。

[0148] 其中，pH＝8.0的Tris‑HCl缓冲溶液的配制方法包括：0.1mol/L Tris碱溶液50.00mL加0.1mol/L盐酸29.20mL，用水定容至100mL，混匀即可。

[0149] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为176.73μg/g，即176.73ug/片，为理论值的88.37％。

[0150] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图9所示。

[0151] 实施例10

[0152] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0153] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝8.5的Tris‑HCl缓冲溶液，待测样品称样量为5.0021g。

[0154] 其中，pH＝8.5的Tris‑HCl缓冲溶液的配制方法包括：0.1mol/L Tris碱溶液50.00mL加0.1mol/L盐酸14.70mL，用水定容至100mL，混匀即可。

[0155] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为184.12μg/g，即184.12ug/片，为理论值的92.06％。

[0156] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图10所示。

[0157] 实施例11

[0158] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0159] 将步骤(4)中的pH＝8.0的缓冲溶液替换为等体积的pH＝8.9的Tris‑HCl缓冲溶液，待测样品称样量为5.0051g。

[0160] 其中，pH＝8.9的Tris‑HCl缓冲溶液的配制方法包括：0.1mol/L Tris碱溶液50.00mL加0.1mol/L盐酸7.00mL，用水定容至100mL，混匀即可。

[0161] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为184.31μg/g，即184.31ug/片，为理论值的92.16％。

[0162] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图11所示。

[0163] 实施例12

[0164] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0165] 将步骤(4)中的水浴温度设置为40℃，待测样品称样量为5.0031g。

[0166] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为154.02μg/g，即154.02ug/片，为理论值的77.01％。

[0167] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图12所示。

[0168] 实施例13

[0169] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0170] 将步骤(4)中的水浴温度设置为45℃，待测样品称样量为5.0026g。

[0171] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为189.42μg/g，即189.42ug/片，为理论值的94.71％。

[0172] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图13所示。

[0173] 实施例14

[0174] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0175] 将步骤(4)中的水浴温度设置为55℃，待测样品称样量为4.9988g。

[0176] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为206.87μg/g，即206.87ug/片，为理论值的103.4％。

[0177] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图14所示。

[0178] 实施例15

[0179] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0180] 将步骤(4)中的水浴温度设置为60℃，待测样品称样量为5.0039g。

[0181] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为188.73μg/g，即188.73ug/片，为理论值的94.37％。

[0182] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图15所示。

[0183] 实施例16

[0184] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：

[0185] 将步骤(4)中的水浴温度设置为65℃，待测样品称样量为5.0034g。

[0186] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为181.14μg/g，即181.14ug/片，为理论值的90.57％。

[0187] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图16所示。

[0188] 实施例17

[0189] 本实施例参考实施例1的检测方法，区别在于：

[0190] 步骤(4)供试品溶液的制备：

[0191] 取待测样品20片，研细，精密称取0.5000g，置于100mL容量瓶中加入步骤(1)配制的pH＝8.0的缓冲溶液10mL、0.5％氨水溶液15mL，保持容量瓶塞塞住的情况下，于水浴条件下振荡5min，水浴温度为50℃；振荡结束后，放冷，加水稀释定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液，供液相分析；其中，待测样品为铁维生素D叶酸片，样品规格：0.25g/片，每片中叶酸添加量为400μg/片。

[0192] 根据公式计算结果为：叶酸含量W为1616.08μg/g，即404.02ug/片，为理论值的100.5％。

[0193] 采用上述检测方法检测得到的供试品溶液的测试图谱如图17所示。

[0194] 比较例1

[0195] 采用《中国药典2015年版》中“叶酸片”项下“含量测定”方法检测实施例1中的待测样品中叶酸含量，检测结果为：107.87μg/片，为理论值的53.94％。

[0196] 其采用氨溶液或氢氧化钠溶液对样品进行制备，钙铁维生素D叶酸片中富马酸亚铁含量较大，由于亚铁盐与氢氧化铵或碱金属的氢氧化物溶液作用时，有部分氢氧化物沉淀，将叶酸包裹，不能溶出，使得叶酸的含量检测结果偏低。

[0197] 比较例2

[0198] 按照夏瑞等(RP‑HPLC测定复方硫酸亚铁叶酸片中叶酸的含量，中国药学杂志，2006，41(23)：1835‑1836)报道的检测方法检测实施例1中的待测样品中叶酸含量，检测结果为：150.02μg/片，为理论值的75.01％。

[0199] 比较例3

[0200] 按照杨仲儒等(叶酸铁质复方软胶囊中叶酸的含量测定，西北药学杂志，2008，23(6)：362‑364)报道的检测方法检测实施例1中的待测样品中叶酸含量，检测结果为：156.38μg/片，为理论值的78.19％。

[0201] 比较例4

[0202] 采用申请号为201310559492.3的文件中具体实施例记载的检测方法，检测本发明实施例1中的待测样品中叶酸的含量，检测结果为：164.01μg/片，为理论值的82.05％。

[0203] 由于钙铁维生素D叶酸片中钙、铁含量大，加入DTPA或EDTA等螯合剂，螯合剂会与钙、铁大量螯合，在螯合过程中会对叶酸进行吸附，影响检测结果。

[0204] 实验例1

[0205] 为了进一步验证本发明叶酸含量的检测方法的可行性，进行如下试验：

[0206] 1、线性回归试验

[0207] (1)精密称取叶酸对照品5.00mg至50mL容量瓶中，用0.5％氨水溶解稀释至刻度，摇匀，配置成浓度为100μg/mL的叶酸对照品贮备溶液；

[0208] (2)叶酸对照品标准系列工作液：分别精密量取叶酸对照品贮备溶液1.4mL，1.2mL，1.0mL，0.8mL，0.6mL，置10mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配制浓度分别为14μg/mL，12μg/mL，10μg/mL，8μg/mL，6μg/mL。

[0209] (3)按照实施例1记载的方法将叶酸对照品标准系列工作液进样，以浓度为横坐4 3 2
标，峰面积为纵坐标作图，线性回归方程为：Y＝(2.96×10)X‑(3.41×10)，R＝0.9990；表明叶酸在6～14μg/mL范围内具有良好的线性关系。

[0210] 2、仪器精密度试验

[0211] 取同一叶酸对照品溶液(10μg/mL)，按照实施例1的色谱方法，连续进样6次，每次10μL，计算叶酸的峰面积RSD％为0.28％，表明仪器的精密度良好，结果见表1。

[0212] 表1仪器精密度试验数据

[0213]

[0214]

[0215] 3、重复性试验

[0216] 取6份实施例1中规格的钙铁维生素D叶酸片样品，按照实施例1所述方法进行叶酸的含量测定，结果叶酸的含量为200.03μg/片，表明该检测方法重复性良好，结果见表2。

[0217] 表2重复性试验数据

[0218]

[0219] 4、回收率试验

[0220] 以100μg/mL也叶酸对照品贮备液作为加样贮备液。取已知叶酸含量的样品(叶酸含量为200.03μg/g)，精密称定6份样品，每份2.50g于100mL容量瓶中，再加入5mL加样贮备液，进行叶酸含量测定，结果见表3。(加入对照品量与供试品含量1:1)

[0221] 表3回收率试验数据

[0222]

[0223] 从表中可以看出叶酸的回收率在99.97％‑104.55％之间，RSD％为1.56％。符合药典的标准。

[0224] 5、稳定性试验

[0225] 按照实施例1所述方法配制供试品溶液。在0、1、2、4、8、12、18、24h时间点按方法测定供试品溶液(0h样品在制备完成后立即进行测定)，结果见表4。

[0226] 表4稳定性试验数据

[0227]

[0228]

[0229] 从表中可以看出，叶酸的峰面积的RSD％为0.22％，表明供试品溶液在24h内是稳定的。

[0230] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。