一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶

摘要

本发明提供了一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶的制备方法。本研究将具有自组装成颅脑外伤术后可注射水凝胶兼基质金属蛋白酶响应分解的三聚甘油单硬脂酸酯（TGMS），通过亲疏水作用包载具有活性氧相响应的PPS120‑OH及营养神经的姜黄素；通过局部注射在脑外伤术后部位，达到快速响应释放并发挥抗炎及营养神经的作用；通过水凝胶注射给药，避免了全身的血液循环降解及血脑屏障的影响，同时达到响应创伤特定微环境，逐层响应释放药物进而发挥抗炎症及营养神经的双重作用。具备临床应用性和现实的治疗意义。

权利要求

1.一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶，其特征在于：颅脑外伤术后可注射水凝胶中至少含有：三聚甘油单硬脂酸酯，PPS120‑OH，姜黄素，各物质通过加热方式进行亲疏水自组装，形成颅脑外伤术后可注射水凝胶；

颅脑外伤术后可注射水凝胶是由三聚甘油单硬脂酸酯，PPS120‑OH，姜黄素，以及混合溶剂，各物质添加至混合溶剂通过加热方式进行亲疏水自组装形式组成；

其中，上述1毫升体积的颅脑外伤术后可注射水凝胶中，是由800 μL、水和200 μL、二甲基亚砜组成的混合溶剂，再加入三聚甘油单硬脂酸酯、100 mg， PPS120‑OH、16 mg以及姜黄素、4 mg，水浴加热至65 ℃，保持5 min，在室温下冷却后，形成颅脑外伤术后可注射水凝胶；

所述三聚甘油单硬脂酸酯具有响应脑外伤微环境中基质金属蛋白酶分解作用，其结构式如下所示：

 ；

所述PPS120‑OH具有响应脑外伤微环境中的活性氧作用，其结构式如下所示： ，

其中，n为120。

说明书

一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水

凝胶

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶，属于颅脑外伤药物制备领域。

背景技术

[0002] 颅脑外伤(traumatic brain injury，TBI)因其发病率、病死率及致残率高，已成为全世界范围内严重的公共卫生问题。虽然随着对颅脑损伤发病机制认识的不断深入，同
时伴随着新药物的不断增加和新技术的陆续应用，对颅脑外伤病人的救治已经有了明显提
高，但是在救治TBI患者的过程中，比较突出的问题是如何对抗损伤后局限或弥漫性的脑水
肿，以及伤后神经功能的缺失问题。因此，研发安全可靠的脑保护药物就显得尤为重要。

[0003] 自由基清除剂作为一种能有效对抗神经炎症的物质，其作用在于能特异性的耗竭炎性组织内的活性氧(reactive oxygen species，ROS)介质，起到阻断炎症反应的作用。
Tirilazad和超氧化物歧化酶都曾经应用的自由基清除剂，但是由于采取的静脉给药以及
血脑屏障的作用，脑组织内未能达到足够的浓度，对病人预后的改善也未能达到预期效果，
导致实验的失败。姜黄素作为一种从植物中提取的多分类化合物可以有效调节神经干细胞
的分化。但是其在水中极低的溶解度，以及相关不稳定的性质，极低的生物利用度，限制了
其作为一种神经保护剂的应用。研究提高创伤区域脑组织内的药物浓度，成为制备此类药
物递送系统面临的主要难题。

发明内容

[0004] 为了克服颅脑外伤药物治疗的缺乏及有效性欠佳，本发明提供了一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶；该颅脑外伤术后可注射水凝胶可以原位注
射在颅脑创伤的部位，通过响应颅脑创伤局部微环境中过剩的基质金属蛋白酶及活性氧，
并最终释放营养神经物质姜黄素，从而发挥早期抗炎症及营养神经作用。该种原位注射给
药的方式可以避免全身血液脏器的毒副作用，并提高了药物在脑外伤局部的浓度，及时有
效提高脑外伤治疗的效果，提高颅脑外伤救治水平。

[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的，一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶，其特征在于：颅脑外伤术后可注射水凝胶中至少含有：三聚甘油单硬脂
酸酯(TGMS)，PPS120‑OH，姜黄素(Cur)，各物质通过加热方式进行亲疏水自组装，形成颅脑外
伤术后可注射水凝胶。

[0006] 作为本发明所述的一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶的优化方案：颅脑外伤术后可注射水凝胶是由TGMS，PPS120‑OH，Cur 物质通过亲疏水自组
装形式组成；

[0007] 其中，上述颅脑外伤术后可注射水凝胶1mL体积的是由800μL、水和200 μL、二甲基亚砜(DMSO)组成的混合溶剂，再加入TGMS(100mg)，PPS120‑OH、 (16mg)以及Cur(4mg)，水浴
加热至65℃，保持5min，室温冷却后形成颅脑外伤术后可注射水凝胶。

[0008] 作为本发明所述的一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶的优化方案：所述TGMS具有响应脑外伤微环境中基质金属蛋白酶分解作用，其结构式如
下所示：

[0009]

[0010] 作为本发明所述的一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶的优化方案：所述PPS120‑OH具有响应脑外伤微环境中的活性氧作用，其结构式如下所示：

[0011]

[0012] 其中，n为120。

[0013] 本发明的有益效果：

[0014] 1、本发明一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶，所用的三聚甘油单硬脂酸酯是FDA批准的具有两亲段的物质，安全可靠； PPS120‑OH是一种具有消
耗活性氧的的疏水物质，姜黄素是一种传统的中药提取物，对机体毒副作用小。

[0015] 2、本发明一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝由于TGMS的引入，其可自组装成可注射型水凝胶，同时因亲疏水作用可包裹 PPS120‑OH及Cur。从而可
在颅脑创伤的原位进行注射。

[0016] 3、本发明一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶由于TGMS及PPS120‑OH的引入可在创伤环境中依次响应基质金属蛋白酶、ROS，从而加速水凝胶裂
解。

[0017] 4、本发明一种具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶，因其组成中的PPS120‑OH可以消耗脑外伤创伤微环境中的活性氧进而发挥抗炎症作用，水凝胶裂解
后释放Cur具有营养神经功能。

附图说明

[0018] 图1是PPS120‑OH的1H‑NMR的检测结果；

[0019] 图2是PPS120‑OH的GPC检测结果；

[0020] 图3是为本发明制备的颅脑外伤术后可注射水凝胶的形态图；

[0021] 图4是HR扫描电镜检查结果表明颅脑外伤术后可注射水凝胶表面形态；

[0022] 图5是颅脑外伤术后可注射水凝胶的流变检查结果；

[0023] 图6是本发明TM/PC颅脑外伤术后可注射水凝胶的在体外不同模拟环境下释放姜黄素的能力；

[0024] 图7为本发明颅脑外伤术后可注射水凝胶包载DiR在损伤及损伤对照组的老鼠体内的药物释放及降解的情况；

[0025] 图8对图7中荧光值进行统计学分析结果；

[0026] 图9本发明颅脑外伤术后可注射水凝胶可改善颅脑创伤早期脑水肿程度；

[0027] 图10本发明颅脑外伤术后可注射水凝胶可改善血脑屏障渗透程度；

[0028] 图11本发明颅脑外伤术后可注射水凝胶具有抗炎作用；

[0029] 图12本发明颅脑外伤术后可注射水凝胶可以改变颅脑创伤的神经元再生。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。

[0031] 实施例1：PPS120‑OH的合成路线和表征

[0032] PPS120‑OH的合成路线如下所示：合成路线中：Propylene sulfide为硫化丙烯、C4H9SH为1‑丁烷硫醇、2‑iodoethanol为2‑碘乙醇、DBU：1,8‑二氮杂二环[5.4.0]十一‑7‑烯；

[0033] 硫化丙烯；1,8‑二氮杂二环[5.4.0]十一碳‑7‑烯；1‑丁烷硫醇；2‑碘乙醇均购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

[0034]

[0035] 具体制备方法：

[0036] 脱气硫化丙烯的制备方法：将硫化丙烯加入烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，烧瓶倾斜浸没于水中约三分之一，水温4±2℃；启动真空泵抽尽装置内空气，并开启冷凝器及其进水
阀，此过程进行30min。

[0037] 脱气四氢呋喃的制备方法：将四氢呋喃加入烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，烧瓶倾斜浸没于水中约三分之一，水温4±2℃；启动真空泵抽尽装置内空气，并开启冷凝器及其进水
阀，此过程进行30min。

[0038] 先将1,8‑二氮杂二环[5.4.0]十一碳‑7‑烯(用量258mg,1.5mmol)与脱气四氢呋喃(用量1.5mL)加入圆底烧瓶中，在0℃下脱气30min，得到脱气DBU四氢呋喃溶液；

[0039] 1‑丁烷硫醇(用量45mg,0.5mmol)逐滴加入脱气DBU四氢呋喃溶液，反应 30min，温度维持在0℃，制得反应体系混合物；

[0040] 脱气硫化丙烯(用量2.96g,40mmol)添加到反应体系混合物中，在0℃反应 2小时；再加入2‑碘乙醇(用量172mg,1mmol)，室温下搅拌12h，终止反应，对聚合物溶液进行过滤去
除沉淀盐，通过冷甲醇三次沉淀进一步纯化，真空干燥后得到无色粘性聚合物，即产物
PPS120‑OH。

[0041] PPS120‑OH的1H‑NMR的检测结果见图1；PPS120‑OH的GPC检测结果见图 2。

[0042] 实施例2：具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶的形态图和高分辨率电镜检查及流变检查。

[0043] 称取100mg TGMS；16mg PPS120‑OH及4mg Cur，分别溶于800μL水和 200μL的二甲基亚砜配制的混合溶剂中，并加热到65℃，直至TGMS、PPS120‑OH 及Cur均匀溶解，然后放在室
温冷却30min后，溶液转变成粘性凝胶，即颅脑外伤术后可注射水凝胶，见图3，图3中右侧II
为倒立放置的装液瓶，水凝胶无下落现象，表明颅脑外伤术后可注射水凝胶制备成功。

[0044] 将制备的颅脑外伤术后可注射水凝胶用注射器打入冷冻传输专用样品台的小孔中，再转入液氮泥中快速冷冻至‑210℃，用传输杆转移到制备室内；调节制备室内温度，由‑
140℃升高到‑90℃，升华3min后，在颅脑外伤术后可注射水凝胶表面喷镀白金膜，喷镀时间
50秒；将处理好的颅脑外伤术后可注射水凝胶转移到HR扫描电镜(Zeiss Merlin High 
resolution SEM)中观察、拍照，见图4。

[0045] 使用美国TA Instruments公司生产的Discovery HR‑2型旋转流变仪测试样品的动态流变性能。平行板直径为40mm，板间距为500μm，测试时仪器选择“振荡测试”模式。频率
扫描范围为0.0398‑628.319rad/s，应变5％，温度为37℃,得到样品的储存模量(G′)，损耗
模量(G″)与角频率(ω)的关系曲线，见图5，图中： TM表示TGMS水凝胶组；TM/C表示TGMS包
载Cur的水凝胶组；TM/P表示 TGMS包载PPS120‑OH的水凝胶组；TM/PC表示TGMS包载PPS120‑OH
和Cur 的水凝胶组。从图5中可以得到该颅脑外伤术后可注射水凝胶具有水凝胶流变特性。

[0046] 实例3：具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶，在体内外不同模拟环境下释放姜黄素的能力。

[0047] 运用多功能酶标仪检测TM/PC(表示TGMS包载PPS120‑OH和Cur的水凝胶组，即颅脑外伤术后可注射水凝胶)，在体外不同模拟环境下的Cur释放率；取200μL的颅脑外伤术后可
注射水凝胶，加入10mL磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)，设置不同体外环
境，每三日加入10μL的不同溶剂，在37℃温箱中静置，在不同的时间点取样，应用多功能酶
标仪检测上清液中Cur的浓度，计算药物的累计释放量，见图6；图中结果表明在过氧化氢和
基质金属蛋白酶双重作用下Cur释放速度最快。

[0048] 上述中的每三日加入10μL的不同溶剂，其不同溶剂具体名称及其浓度如下:

[0049] 1)、PBS表示：磷酸缓冲盐溶液溶液；

[0050] 2)、H2O2表示：过氧化氢(浓度1mol/L)；

[0051] 3)、MMP‑2表示：基质金属蛋白酶2(浓度100ng/μL)；

[0052] 4)、H2O2+MMP‑2表示：过氧化氢(浓度2mol/L)+基质金属蛋白酶2(浓度200ng/μL)，各物质按照体积比1：1混合配制；

[0053] 5)、MMP‑2+Inhibitor表示：基质金属蛋白酶2(浓度200ng/μL)+基质金属蛋白酶抑制剂(浓度2mmol/L)，各物质按照体积比1：1混合配制；

[0054] 6)、H2O2+MMP‑2+Inhibitor表示：过氧化氢(浓度3mol/L)+基质金属蛋白酶2(浓度300ng/μL)+基质金属蛋白酶抑制剂(浓度3mmol/L)，各物质按照体积比1：1：1混合配制。

[0055] 实验动物选用ICR雄性小鼠(16‑20g)，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，预先适应性饲养12天后进行动物实验。实验动物饲养于独立送风隔离笼具中，室温控制在23
±2℃，保持有规律的光照(12h白天，12h黑夜)，保持水和粮食的充分供应。

[0056] 运用小动物活体成像仪，颅脑外伤术后可注射水凝胶包载荧光染料，检测颅脑外伤术后可注射水凝胶在颅脑创伤动物体内的荧光染料的代谢强度，评估颅脑外伤术后可注
射水凝胶在体内的降解释放能力，见图7(Sham组是假手术组， TBI是脑创伤组)和图8(ns：
无统计学价值；**：P＜0.01，***：P＜0.001)。

[0057] 实施例4:具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶改善早期动物颅脑创伤程度。

[0058] 运用脑干湿重法及评价水凝胶在颅脑创伤后抗水肿的效果，见图9(Cont：脑创伤未处理组；TM/PC是脑创伤给予TM/PC水凝胶的治疗组；***：P＜0.001)；运用酶标仪检测伊
文思蓝吸光度，评估水凝胶对于颅脑创伤后血脑屏障的保护作用，见图10(Cont：脑创伤未
处理组；TM/PC:是脑创伤给予TM/PC水凝胶的治疗组；****：P＜0.0001)；运用免疫荧光染色
的方法检测胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白(Iba‑1)，评价颅
脑创伤灶周围神经炎症的水平，见图11(Cont：脑创伤未处理组；TM/PC:是脑创伤给予TM/PC
水凝胶的治疗组)。

[0059] 实施例5:具响应释放和营养神经功能的颅脑外伤术后可注射水凝胶可以促进颅脑创伤后的神经元再生修复。

[0060] 运用免疫荧光染色的方法检测神经元指标Nestin、神经丝蛋白NF‑200，评估颅脑创伤灶周围神经元损伤修复指标的表达水平，见图12(Nestin及NF‑200 均为神经元再生修
复的分子标志物；Cont：脑创伤未处理组；TM/PC：是脑创伤给予TM/PC水凝胶的治疗组)。