N-芳基-3,3-二氟-5-对甲苯磺酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-醇的应用

摘要

本发明公开了一种N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。研究表明，本发明所述的化合物可阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡，抑制癌细胞增殖，具有良好的抗肿瘤活性。可用于制备抗肿瘤药物的开发。

权利要求

1.一种N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物为具有式1‑A结构式中的至少一种化合物：式1‑A

式1‑A中，所述的R1、R2独自为C1~C3的烷基；所述的R3为苯基。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，R1, R2为甲基；R3为苯基。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为能够抑制肿瘤细胞增殖和/或促进肿瘤细胞凋亡的药物。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为能够抑制肺鳞癌细胞、鼻咽癌细胞和肝癌细胞增殖；和/或促进肝癌细胞周期阻滞和/或凋亡的药物。

5.如权利要求 1或2所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为能够促进肿瘤细胞中促凋亡蛋白表达和/或抑制肿瘤细胞中抗凋亡蛋白表达的药物。

6.如权利要求5 所述的应用，其特征在于，所述的促凋亡蛋白为促凋亡家族蛋白 Bak，抗凋亡蛋白为抗凋亡家族蛋白Bcl‑2。

7.一种抗肿瘤药物，其特征在于，其包含药学有效量的权利要求1中所述的N‑芳基‑3,

3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物。

8.如权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、肺癌、鼻咽癌中的至少一种癌症的药物。

9.如权利要求7或8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。

说明书

N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇

的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型含氟有机小分子化合物在抗肿瘤药物中的应用，属于抗肿瘤药物领域。

背景技术

[0002] 肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，引起的死亡率在全球肿瘤中居第二位，长期影响人类的健康。尽管目前存在化疗，放疗和手术切除或移植等多种治疗手段和方式，但肝癌的
临床治疗效果仍不理想。因此，寻找新型抗肝癌药物是治疗肿瘤的关键手段之一。

[0003] 含氟有机化合物是近代有机化学的一崭新的研究领域。由于氟原子半径小和具有较大的电负性的特点，一方面作为氢原子经典的电子排体，可明显提高含氟有机分子的稳
定性，另一方面可增加有机分子中氟与碳的亲和作用。当含氟原子或含氟基团引入有机化
合物中，不仅改变了分子内部电子密度的分布，而且还能提高化合物的脂溶性和渗透性。目
前临床上应用含氟抗肿瘤的药物主要有：5‑氟尿嘧啶(5‑Fluorouracil)、卡莫氟
(Carmofur)、替加氟(Tegafur)、双呋氟尿嘧啶(Tegadifur)、氟铁龙(Furtulon)、优福定
(Uracil‑tegafur)以及氟他胺(Flutamide)等。2007年，自美国FDA批准第一个含氟抗肝癌
靶向药物索拉非尼(Sorafenib)以来，人们对于含氟抗癌药物的关注日益增加。而我国目前
还未有类似重量级药物的发现。因此，从含氟有机化合物中寻找和发现新型抗肿瘤药物成
为提高肿瘤患者治疗效果和降低医疗负担的一种迫切需要。

[0004] 肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少。若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，肿瘤细胞就有可能停止生
长，因此，研制出能够抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡的药物，对促进恶性肿瘤治疗技术的
发展具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0006] 本发明第二目的在于，提供了一种包含本发明所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物的抗肿瘤药物。

[0007] 一种N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物的应用，将其用于制备抗肿瘤药物；

[0008] 所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物为具有式1结构式中的至少一种化合物；

[0009]

[0010] R1、R2、R3独自为烷基、苯基或取代苯基；

[0011] Ar为芳香基团。

[0012] 本发明研究发现，式1结构的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物可作为抗肿瘤活性的药物活性中心，用于开发抗肿瘤药物。

[0013] 本发明研究发现，以N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇为核心片段的分子实体，可为开发新型抗肝癌药药物提供科学依据，并为开发新型抗肿瘤
物提供新的分子片段。

[0014] 本发明中，在所述的3,3‑二氟‑4‑羟基‑1,2,3,6‑四氢吡啶的母核的N位引入芳香取代基是赋予该化合物良好抗肿瘤活性的关键。所述的芳基可以为杂环芳基、苯基或者取
代苯基。所述的杂环芳基可以是包含O、N、S中至少一个杂原子的五元或六元杂环基团。所述
的取代苯基例如为烷基取代苯基、卤素取代苯基、烷氧基取代苯基、硝基取代苯基等；优选
地，所述的芳基为苯基。

[0015] 式1中，所述的烷基优选为C1～C6的直链或者支链取代基。

[0016] 优选地，式1中，R1、R2为烷基，且R1、R2优选为相同的取代基。所述的R3为苯基或者取代苯基。

[0017] 作为优选，所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物具有式1‑A结构式：

[0018]

[0019] 式1‑A中，所述的R1、R2独自选自C1～C3的烷基；所述的R3为苯基或取代苯基。

[0020] 本发明研究发现，式1‑A结构式化合物具有优异的抗肿瘤活性。

[0021] 本发明中，所述的C1～C3的烷基例如为甲基、乙基、正丙基或异丙基。

[0022] 所述的取代苯基例如为C1～C3的烷基、卤素、C1～C3的烷氧基等取代的苯基。

[0023] 进一步优选，式1‑A中，R1,R2为甲基；R3为苯环。该优选化合物的分子式C26H25F2NO3S，分子量469.15，化学名称为3,3‑二氟‑2,2‑二甲基‑1,6‑二苯基‑5‑对甲苯磺酰
基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇。

[0024] 本发明所述的应用中，作为优选，将N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物用于制备能够抑制肿瘤细胞增殖和/或促进肿瘤细胞凋亡的药物。

[0025] 本发明所述的应用中，作为优选，将N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物用于制备能够抑制肺鳞癌细胞、鼻咽癌细胞和肝癌细胞增殖；和/或
促进肝癌细胞周期阻滞和/或凋亡的药物。

[0026] 本发明所述的应用中，作为优选，将所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物用于制备能够促进肿瘤细胞中促凋亡蛋白表达和/或抑制肿
瘤细胞中抗凋亡蛋白表达的药物。

[0027] 本发明所述的应用中，作为优选，所述的促凋亡蛋白为促凋亡家族蛋白Bak，抗凋亡蛋白为抗凋亡家族蛋白Bcl‑2。

[0028] 本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其至少包含药学有效量的所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物。

[0029] 所述的抗肿瘤药物中，所述的N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑醇化合物优选为具有式1结构式中的至少一种化合物；进一步优选为具有式1‑A结
构式中的至少一种化合物；最优选，式1‑A中，R1,R2为甲基；R3为苯环的化合物。

[0030] 作为优选，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、肺癌、鼻咽癌中的至少一种癌症的药物。

[0031] 作为优选，所述的抗肿瘤药物，还包含药学上可接受的辅料。

[0032] 所述的抗肿瘤药物可以是可发挥式1化合物抗肿瘤活性的任意药学上可接受的制剂。

[0033] 有益效果

[0034] 本发明运用MTT法对人肝癌细胞HepG2和HCCLM3、人肺鳞癌细胞HTB‑182和人鼻咽癌细胞CNE2进行药效筛选，发现N‑芳基‑3,3‑二氟‑5‑对甲苯磺酰基‑1,2,3,6‑四氢吡啶‑4‑
醇化合物，特别是式1‑A化合物具有良好的抗肿瘤效果。

[0035] 本发明还通过流式细胞术检测了它对肝癌细胞周期和凋亡的影响，同时也对与细胞周期密切相关的关键蛋白Cyclin B1，Cyclin D1，Cyclin E1，Cyclin H，Cdc2，p‑Cdc2和
CDK7，以及与凋亡密切相关的关键蛋白PARP，Caspase‑3，Bcl2，Bax进行了检测，发现本发明
所述的化合物可通过将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期和诱导细胞凋亡的发生，从而实现其抗肿
瘤作用。在进一步的研究中，我们发现本发明化合物对肝癌裸鼠移植瘤同样具有一定的抑
制作用。实验结果表明本发明所述的化合物可提高Cdc2的磷酸化水平和抑制周期蛋白依赖
性激酶CDK7的表达，我们推测，化合物本发明所述的化合物可能通过调节Cdc2的磷酸化水
平和抑制CDK7激酶的活性，从而使细胞发生阻滞作用，进一步引起细胞凋亡，最终导致肿瘤
细胞死亡。

附图说明

[0036] 图1化合物4j对肝癌细胞克隆形成的抑制

[0037] 图2化合物4j对肝癌细胞周期蛋白的影响

[0038] 图3化合物4j对肝癌细胞凋亡蛋白的影响

[0039] 图4化合物4j在体内对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

[0040] 具体实验方案

[0041] 人肝癌细胞株HepG2和HCCLM3，肺鳞癌细胞株HTB‑182，鼻咽癌细胞CNE2购自中南大学细胞中心；DMEM和RMPI‑1640培养基，胰蛋白酶，胎牛血清购自美国Gibco公司。小分子
化合物采用二甲基亚砜溶解，使用培养液进行稀释。

[0042] 1.化合物的制备

[0043] 含氟四氢吡啶小分子化合物由中国科学院上海有机化学研究所肖吉昌研究员按其所发表文章方法制备，具体制备方法和化合物的波谱学数据见文献(Synlett,2008(13)：
1989‑1992)。

[0044] 合成的化合物结构式为：

[0045]

[0046] 2.细胞培养

[0047] 将装有人肝癌细胞株HepG2和HCCLM3，肺鳞癌细胞株HTB‑182，鼻咽癌细胞CNE2的冻存管取出，37℃水浴，不断摇动使其快速融化；待细胞融化后，从水浴中取出，1000rpm离
心5min；表面消毒后放入超净工作台内，弃上清，加入1mL含10％胎牛血清的DMEM或RMPI‑
1640新鲜培养基重悬，转移至培养瓶内静止培养，细胞培养箱的温度为37℃，CO2浓度为
5％，湿度为100％，隔天更换新鲜培养基。

[0048] 3.MTT法测定化合物4j(式1‑A中，R1、R2为甲基，R3为苯基)对肝癌细胞生长的影响

[0049] 3.1.细胞铺板

[0050] 选择处于对数生长期的癌细胞，倒去培养液，PBS洗两次，加胰蛋白酶消化1～3min，加入适量DMEM或RMPI‑1640培养基中和，终止消化，镜检计算细胞浓度，加入相应量培
4
养基，制成2.5×10/mL的细胞悬液。然后用移液器加细胞悬液至96孔板中，200μL/孔，移入
培养箱中培养24h。

[0051] 3.2.细胞给药

[0052] 在96孔板中分别加入不同浓度的化合物4a‑c，4e，4h，4j(10、20、40、80、160、320μM)，每个浓度设3个复孔，以不加药溶剂组为空白对照；5‑氟尿嘧啶(10、20、40、80、160、320μ
M)为阳性对照样品，加药完毕后移入培养箱中培养。化合物以二甲基亚砜(DMSO)溶解，5‑氟
尿嘧啶溶液以PBS溶解，DMSO的终浓度<0.3％。

[0053] 3.3.吸光度检测

[0054] 给药培养48小时后，弃去孔内液体，加DMEM或RMPI‑1640培养基190μL/孔和5mg/mL的MTT(3‑(4,5)‑dimethylthiahiazo(‑z‑y1)‑3,5‑di‑phenytetrazoliumromide，3‑(4，5‑
二甲基噻唑‑2)‑2，5‑二苯基四氮唑溴盐)10μL/孔。37℃，5％CO2培养箱中温孵4h后，弃板上
各孔内原有液体，加二甲基亚砜(DMSO)200μL/孔以完全溶解蓝紫色结晶甲瓒。室温置30min
后，用酶标仪在570和630nm波长下测定各孔光密度值(OD)。计算化合物抑制率：细胞生长抑
制率＝OD对照组‑OD实验组/OD对照组×100％，以药物抑制率对浓度作图计算半数最大抑制浓度IC50。

[0055] 结果如表1所示，化合物4j对人肝癌细胞HepG2和HCCLM3具有明显抑制作用，其半数最大抑制浓度IC50分别为21.25μM和29.07μM，显著低于阳性对照5‑氟尿嘧啶IC50＝72.48
μM，表明化合物4j的抗肝细胞癌药效显著高于阳性药物5‑氟尿嘧啶。此外，化合物4j对人肺
鳞癌细胞HTB‑182亦具有明显抑制作用，其半数最大抑制浓度IC50＝18.42μM。化合物4j对鼻
咽癌细胞也具有一定的抑制作用，IC50为44.39μM。

[0056] 表1六种含氟四氢吡啶小分子(4a‑c,e,h,j)抗肿瘤活性

[0057]

[0058]

[0059] 4.化合物4j对肝癌细胞克隆形成能力的影响

[0060] 将人肝癌细胞HepG2和HCCLM3分别以500个/孔的数量种于六孔板中，待细胞贴壁后以不同浓度化合物4j(0、10、20、40μM)处理，14天后，弃去培养基，PBS洗涤两次，甲醇固
定，结晶紫染色30min，自来水洗净，晾干。计数每孔细胞克隆的数量并拍照。

[0061] 结果如图1所示，随着化合物4j浓度的增加，肝癌细胞形成的克隆数量显著减少。说明化合物4j可显著抑制肝癌细胞HepG2和HCCLM3的克隆形成能力，从而使癌细胞的增殖
能力受到抑制。

[0062] 5.化合物4j对肝癌细胞周期和凋亡的影响

[0063] 分别以不同浓度化合物4j(0、20、40、80μM)处理人肝癌细胞HepG2和HCCLM3，分别处理24小时(用于周期检测)和48小时(用于凋亡检测)，胰蛋白酶消化收集细胞，1000r/min
离心5min，收集沉淀，PBS清洗两次。用于细胞周期检测的细胞，沉淀用4℃预冷的70％的冰
乙醇1mL重悬，4℃过夜。再次悬浮细胞于PBS，溴化丙啶避光染色15min后，上机检测。用于细
胞凋亡检测的细胞，沉淀加入PBS重悬配成单细胞悬液，加入凋亡检测试剂(含7‑AAD和PE)
染色，上机检测。

[0064] 结果如表2和表3所示，表明新型化合物4j可使细胞聚集在G0/G1期，导致人肝癌细胞G0/G1期阻滞的发生，而且表现出明显的剂量依赖性。凋亡检测结果表明，随着化合物4j
浓度的增加，与对照组相比，细胞凋亡率显著上升，说明化合物引起了细胞凋亡。因此，化合
物4j可同时引起细胞周期阻滞和细胞凋亡，我们推测化合物4j可能导致通过细胞有丝分裂
进程阻滞在G0/G1期，而长时间阻滞引起细胞凋亡。

[0065] 表2化合物4j对人肝癌细胞HepG2和HCCLM3细胞周期的影响

[0066]

[0067]

[0068] *与对照组相比p＜0.05

[0069] 表3化合物4j对人肝癌细胞HepG2和HCCLM3细胞凋亡的影响

[0070]

[0071] *与对照组相比p＜0.05

[0072] 6.Western blot法检测化合物4j对肝癌细胞内周期和凋亡相关蛋白表达水平的影响

[0073] 分别用0、10、20、40、80、160μM化合物4j处理HepG2和HCCLM3细胞24h和48h，提取细胞总蛋白，分别用于周期和凋亡蛋白的检测。Western blot(蛋白质免疫印迹)实验检测总
蛋白中相应周期和凋亡蛋白的表达。

[0074] 结果如图2所示，在该实验的处理条件下，化合物4j可以显著抑制周期蛋白Cyclin B1，Cyclin D1，Cyclin E1，Cyclin H，Cdc2和CDK7的表达，同时提高p‑Cdc2的表达，导致细
胞周期阻滞。如图3所示，化合物4j还可激活凋亡关键蛋白PARP和Caspase‑3，降低抗凋亡蛋
白Bcl2的表达，同时增加凋亡蛋白Bax的表达，从而促进细胞凋亡。这与流式细胞分析的结
果相一致。

[0075] 7.异种移植裸鼠动物实验

[0076] 培养足量状态良好的HepG2细胞，胰酶消化后配制成细胞悬液，无血清培养基洗涤7
两次，重悬于无血清培养基中，混匀，细胞计数仪计数，将细胞浓度调整为5×10个/mL；分
装于无菌离心管中，每管1mL，置冰上带到动物房；每管均用注射器一次吸取，接种于4‑5周
6
龄裸鼠腋部皮下，每个接种部位接种0.1mL(5×10个细胞)，接种24只；当瘤体体积达到50
3
～100mm时，选取瘤体积大小相对均匀的裸鼠20只，随机分成4组：溶剂对照组，阳性药组
(5‑FU，30mg/kg)，化合物4j低剂量组(60mg/kg)和高剂量组(240mg/kg)，每组5只，连续处理
16天；接种后每两天用游标卡尺测量一次瘤体大小，计算瘤体积。瘤体积计算公式V＝a×b
×b/2，其中a为长径，b为短径。用天平称量小鼠体重。实验完毕处死裸鼠，剥离瘤组织，记录
瘤组织的体积和重量，保存标本。

[0077] 结果如图4所示，化合物4j在高剂量下可以显著抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长，处理3 3
终点溶剂对照组瘤体体积为1061.11±358.89mm ，化合物4j高剂量组为369.66±52.83mm，
两者具有统计学差异(P<0.05)，但化合物4j的使用剂量显著高于阳性药组。