ODN或衍生物的多肽偶合物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及医药领域，本发明提供了一种ODN或其衍生物的多肽偶合物及其制备方法，本发明所述偶合物为式(I)化合物：本发明所述化合物具有靶向性好、生物活性强、毒副作用低，水溶性好、生物利用度高的特点；本发明的工艺简单，科学合理，质量可控，重现性好，适于生产；本发明所述化合物可特异性地抑制骨组织内破骨细胞分泌的组织蛋白酶活性，进而抑制骨吸收活性，可有效延缓骨质疏松症和骨关节炎的病理进程，并具有良好的生物相容性和安全性，使用简便。

权利要求

1.ODN或其衍生物的多肽偶合物，其特征在于，所述偶合物为式(I)化合物：其中，R1＝为F或CH3SO2或NH2SO2；

R2＝为CH3或CH2F或是C(CH3)2F；

R3＝为CH2或(CH2)2C或是(CH2)3C；

所述A选自‑CO‑、‑CO‑CH2‑、‑CH2‑CO‑、‑CO‑CH2‑CO‑、‑CO‑CH2‑CH2‑CO‑、或‑CO‑O‑CH2‑CO‑；所述B为(Asp)8。

2.根据权利要求1所述的偶合物，其特征在于，所述ODN衍生物为如下结构的化合物：

3.根据权利要求1～2所述的偶合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)ODN或其衍生物在有机溶剂中与含有中间链接键的化合物反应，其中所述中间链接键为取代基A代表的中间链接键；

2)将步骤1)所得产物在有机溶剂中与多肽适配子反应，即得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)包括ODN或其衍生物在有机溶剂中与含有中间链接键的化合物在缩合剂作用下反应；所述步骤2)包括将步骤1)所得产物在有机溶剂中与多肽适配子在缩合剂作用下反应。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的有机溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、吡啶或四氢呋喃。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中含有中间链接键的化合物的用量为1～3当量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中含有中间链接键的化合物的用量为1.2当量。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中反应温度为0～80℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中反应温度为室温条件。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中有机溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

11.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缩合剂为2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯、4‑(4,6‑二甲氧基三嗪)‑4‑甲基吗啉盐酸盐、二环己基碳二亚胺‑N‑羟基琥珀酰亚胺或1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐‑N‑羟基琥珀酰亚胺。

12.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应在碱性条件下进行。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中碱为N,N‑二异丙基乙胺。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，N,N‑二异丙基乙胺用量为2.0当量。

15.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中缩合剂的用量为1～3当量。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中缩合剂的用量为1.2～1.5当量。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中缩合剂的用量为1.2当量。

18.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应温度为0～80℃。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应温度为室温条件。

20.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应时间为0.5h～24h。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应时间为1小时。

22.权利要求1所述ODN或其衍生物的多肽偶合物在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。

23.权利要求1所述ODN或其衍生物的多肽偶合物在制备治疗关节炎的药物中的应用。

说明书

ODN或衍生物的多肽偶合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及制药领域，具体涉及odanacatib(ODN)或其衍生物的多肽偶合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 骨质疏松症是以骨量减少，骨小梁、皮质骨多孔、变薄，致使骨骼的强度降低和骨折的危险性增加为特征的一种全身性骨骼疾病。当前研究发现，成年人每年大约有25％的
骨小梁和3％的皮质骨,进行破骨细胞的骨吸收及成骨细胞的骨形成这一动态平衡过程，当
骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，则引起骨质疏松症。骨吸收过程中，破骨细胞通过酸性物
质与溶酶体蛋白酶结合，将细胞膜和骨基质之间的空隙作为间隙进行再吸收,与此过程关
系密切的酶主要是破骨细胞分泌的组织蛋白酶。组织蛋白酶K是一种溶酶体蛋白酶，属于番
木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族，广泛存在于骨吸收表面、胞转囊泡和细胞溶酶体内，在破
骨细胞中表达量最高、溶骨活性最强。组织蛋白酶K以剪切胶原螺旋和末端肽域的方式降解
骨胶原，这不仅破坏了骨细胞外基质主要成分，而且使胶原中隐藏的精氨酸(Arg)‑甘氨酸
(Gly)‑天冬氨酸(Asp)序列(RGD序列)暴露，此序列对破骨细胞黏附于细胞外基质至关重
要。因此，Cathepsin K是骨吸收过程中的一个关键酶，其抑制剂已经成为治疗骨质疏松症
的一种新型治疗方法。

[0003] 骨关节炎是一种以关节软骨或关节下骨损伤为特征的关节疾病，主要症状是关节疼痛或僵硬，其他症状包含关节肿胀、关节活动度降低，后期形成骨赘。好发患病部位为手
指末梢关节、拇指根部、颈部、下背部、膝关节及髋关节。现有研究显示，在骨关节炎发病的
早期阶段，病理特征主要为破骨细胞介导的软骨下骨骨吸收，而组织蛋白酶K在该病理过程
中扮演了重要角色。前期研究显示，缺乏组织蛋白酶K的小鼠在诱导骨关节炎发病后，与野
生型对照相比，其软骨下骨骨吸收的水平降低，关节软骨降解被抑制，提示了组织蛋白酶K
可作为治疗骨关节炎的分子靶点。

[0004] ODN是一种作用较强、可逆性非肽联芳组织蛋白酶K抑制剂，能使组织蛋白酶K的解朊作用失活，从而选择性抑制破骨细胞组织蛋白酶K。ODN不影响骨髓前体细胞向破骨细胞
的分化过程，也不影响破骨细胞的寿命。

[0005]

[0006] 通过测定1型胶原交联C端肽(CTx)和测量破骨细胞的吸收区域表明ODN能够影响破骨细胞的吸收活性，未经ODN作用的破骨细胞可以产生一个尾状的吸收区域，而经ODN处
理过的细胞则仅产生一个比较小的吸收陷窝。破骨细胞经ODN作用后，针对组织蛋白酶K和
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的细胞内的密度明显增加。一般来说，组织蛋白酶K的囊泡
定位于破骨细胞极性基侧和功能分泌区膜上，而TRAP则分布于胞浆内，提示ODN干扰了多种
组织蛋白酶K原前体或成熟组织蛋白酶K的转运通路。试验结果显示,ODN与安慰剂相比，可
显著降低髋部骨折、脊柱骨折、非脊柱骨折3种类型骨质疏松性骨折风险。此外，ODN可降低
临床脊柱骨折风险。与安慰剂组相比，ODN组新发脊柱骨折或脊柱骨折恶化的相对风险降低
54％、髋部骨折相对风险降低47％、非脊柱骨折相对风险降低23％、脊柱骨折相对风险降低
72％，但是增加了房颤和中风风险,因此，未能通过临床最后的试验。近期研究显示，非骨组
织中也有大量的组织蛋白酶K表达，且发挥生理病理功能。ODN缺乏器官靶向性，其治疗导致
全身各组织器官内的组织蛋白酶K活性被抑制，具有潜在的脱靶效应及发生不良事件的风
险。因此，需改善ODN的骨靶向性，减少其在骨外器官组织的暴露。

[0007] (Asp)8为AspAspAspAspAspAspAspAsp，其为8个天门冬氨酸多肽重复序列，能够与高结晶化的矿盐晶体(骨吸收表面的矿盐理化特征)特异性结合。由于破骨细胞主要向骨吸
收表面募集，故偶联(Asp)8的药物可以在(Asp)8向骨吸收表面接近的过程中增加该药物与
破骨细胞接触的几率，实现破骨细胞特异性递送。

[0008] 目前还尚未发现ODN或其衍生物与多肽适配子结合以靶向药物的相关报道。

发明内容

[0009] 针对以上现有技术情况，本发明提供了一种新的ODN或衍生物的多肽偶合物及其制备方法和应用。

[0010] 本发明所述ODN或其衍生物的多肽适配子偶合物为具有如下式(I)的化合物：

[0011]

[0012] 其中，R1＝为F或CH3SO2或NH2SO2；

[0013] R2＝为CH3或CH2F或是C(CH3)2F；

[0014] R3＝为CH2或(CH2)2C或是(CH2)3C；

[0015] A为‑CO‑、‑CO‑(CH2)n‑CO‑、‑(CH2)n‑CO‑、‑CH＝CH‑CO‑、‑(CH2)n‑CO‑NH‑CO‑、‑CH＝CH‑(CH2)n‑CO‑、‑CH(OH)‑Ph‑CO‑、‑CH(OH)‑Ph‑(CH2)n‑CO‑、‑CH2‑Ph‑(CH2)n‑CO‑、‑CH2‑CONH‑
(CH2)n‑CO‑、‑CH(OCH3)‑Ph‑CO‑、‑CH(OCH3)‑Ph‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑NH‑CO‑、‑CO‑NH‑(CH2)n‑
CO‑、‑CO‑NH‑(CH2)n‑NH‑CO‑、‑CH2‑CH＝CH‑CO‑、‑CH2‑CH＝CH‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑(CH2)n‑、‑
(CH2)n‑CO‑、‑CO‑O‑(CH2)n‑CO‑、‑SO2‑Ph‑CO‑、‑SO2‑Ph‑(CH2)n‑CO‑、‑SO2‑Ph‑(CH2)n‑NH‑、‑
SO2‑Ph‑(CH2)n‑NH‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑CO‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Lys‑Phe‑CO‑
(CH2)n‑CO‑、‑CO‑(CH2)n‑Su‑、‑CH＝CH‑Su‑、‑CH＝CH‑(CH2)n‑Su‑、‑CH(OH)‑Ph‑Su‑、‑CH
(OH)‑Ph‑(CH2)n‑Su‑、‑CH2‑Ph‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑NH‑Su‑、‑CO‑NH‑(CH2)n‑Su‑、‑CH2‑CH＝CH‑
Su‑、‑CH2‑CH＝CH‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑(CH2)n‑、‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑O‑(CH2)n‑Su‑、‑SO2‑Ph‑
Su‑、‑SO2‑Ph‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑CO‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑、‑CO‑
O‑PAB‑Phe‑Lys‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Phe‑Lys‑、‑CO‑O‑PAB‑Lys‑Phe‑CO‑(CH2)n‑Su‑、或不存在，
其中1≤n≤14；优选为1≤n≤7；例如n为1、2、3、4、5、6或7；

[0016] 作为本发明实施方式之一，可选择地(CH2)n还含有取代(CH2)n中一个或多个氢的直链或支链烷基、链烯基、芳烷基和烷基芳烷基、芳香烃基、卤素、杂原子基团、或杂环取代
基；所述烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或庚基；所述链烯基包括但不
限于乙烯基、1‑丙烯基、烯丙基、异丙烯基、1‑丁烯基、或其链烯基的E或Z的异构体；所述的
芳烷基和烷基芳烷基的示例包括但不限于苄基、二苯甲基、甲苯基甲基、苯乙基、苯基丁基；
所述芳香烃基包括但不限于苯基、二苯基、甲苯基、蒽基、茚基、萘基、卤代芳基、卤代芳烷基
苯氧基、甲苯氧基、二甲苯基氧基、2,4,6‑三甲苯氧基和枯烯氧基、二苯基、甲苯磺酰基、烯
丙苄基或苯基、呋喃基、吡啶基；

[0017] B为多肽，作为实施方案之一，所述多肽为(Asp)8。

[0018] 作为本发明的实施方式，所述A选自‑CO‑、‑CO‑(CH2)n‑CO‑、‑(CH2)n‑CO‑、‑(CH2)n‑CO‑NH‑CO‑、‑CH＝CH‑CO‑、‑CH＝CH‑(CH2)n‑CO‑、‑CH(OH)‑Ph‑CO‑、‑CH(OH)‑Ph‑(CH2)n‑
CO‑、‑CH2‑Ph‑(CH2)n‑CO‑、‑CH2‑CONH‑(CH2)n‑CO‑、‑CH(OCH3)‑Ph‑CO‑、‑CH(OCH3)‑Ph‑
(CH2)n‑CO‑、‑CO‑NH‑CO‑、‑CO‑NH‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑NH‑(CH2)n‑NH‑CO‑、‑CH2‑CH＝CH‑CO‑、‑
CH2‑CH＝CH‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑(CH2)n‑、‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑O‑(CH2)n‑CO‑、‑SO2‑Ph‑CO‑、‑SO2‑
Ph‑(CH2)n‑CO‑、‑SO2‑Ph‑(CH2)n‑NH‑、‑SO2‑Ph‑(CH2)n‑NH‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑CO‑
(CH2)n‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Lys‑Phe‑CO‑(CH2)n‑CO‑、‑CO‑(CH2)n‑Su‑、‑CH＝CH‑Su‑、‑CH＝CH‑
(CH2)n‑Su‑、‑CH(OH)‑Ph‑Su‑、‑CH(OH)‑Ph‑(CH2)n‑Su‑、‑CH2‑Ph‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑NH‑Su‑、‑
CO‑NH‑(CH2)n‑Su‑、‑CH2‑CH＝CH‑Su‑、‑CH2‑CH＝CH‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑(CH2)n‑、‑(CH2)n‑
Su‑、‑CO‑O‑(CH2)n‑Su‑、‑SO2‑Ph‑Su‑、‑SO2‑Ph‑(CH2)n‑Su‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑CO‑(CH2)n‑
Su‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑、‑CO‑O‑PAB‑Phe‑Lys‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Phe‑Lys‑、‑CO‑O‑PAB‑
Lys‑Phe‑CO‑(CH2)n‑Su‑、或不存在。

[0019] 本发明中，作为本发明实施方式之一、B为多肽，所述多肽为(Asp)8。

[0020] 本发明中，作为本发明的实施方式之一，所述A选自CO‑、‑CO‑CH2‑、‑CH2‑CO‑、‑CH2‑CO‑NH‑CO‑、‑CO‑CH2‑CO‑、‑CO‑CH2‑CH2‑CO‑、‑CO‑O‑CH2‑CO‑、‑CO‑O‑CH2‑CH2‑CO‑、‑CO‑NH‑
CH2‑CO‑、‑CO‑NH‑CH2‑CH2‑CO‑、‑CO‑NH‑CH2‑CH2‑NH‑CO‑、‑CO‑NH‑CH2‑CH2‑NH‑、‑CH＝CH‑CH2‑
CO‑、‑CH2‑CH＝CH‑CO‑、‑CH2‑CH＝CH‑CH2‑CO‑、‑CH2‑CH＝CH‑CH2‑CH2‑CO‑、‑CH2‑Ph‑CH2‑
CO‑、‑CH2‑Ph‑CH2‑CH2‑CO‑、‑CH2‑CONH‑CH2‑CO‑、‑CH(OCH3)‑Ph‑CO‑、‑SO2‑Ph‑CH2‑CO‑、‑SO2‑
Ph‑CO‑、‑SO2‑Ph‑CH2‑NH‑、‑SO2‑Ph‑CH2‑NH‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Phe‑Lys‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑
Val‑、‑CO‑O‑PAB‑Phe‑Lys‑、‑CO‑O‑PAB‑Phe‑Lys‑CO‑CH2‑CH2‑CO‑、.‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑
CO‑CH2‑CH2‑CO‑、‑CO‑O‑PAB‑Cit‑Val‑CO‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑CO‑、或不存在。

[0021] 作为本发明实施方式，所述ODN或其衍生物的多肽适配子偶合物为如下结构的化合物：

[0022]

[0023] 本发明还提供一种所述ODN或其衍生物的多肽适配子的偶合物的制备方法，其包括但不限于如下制备方法：

[0024] a)ODN或其衍生物在有机溶剂中与多肽适配子在缩合剂作用下反应；

[0025] 或者，

[0026] 1)ODN或其衍生物在有机溶剂中与含有中间链接键的化合物反应或与含有中间链接键的化合物在缩合剂作用下反应；

[0027] 2)将步骤1)所得产物在有机溶剂中与多肽适配子反应或与多肽适配子在缩合剂作用下反应，即得。

[0028] 上述方法中所述“中间链接键”是指取代基A代表的中间链接键，为了实现本发明ODN或其衍生物的多肽偶合物的中间链接键，本领域技术人员可以根据本领域技术常识通
过一个含有中间链接键的化合物、或通过多个含有部分中间链接键的化合物(例如每个化
合物仅含有中间链接键部分结构，通过多个不同的含有部分中间链接键的化合物)进行反
应来实现。

[0029] 作为实施方案之一，所述步骤a)或1)中的有机溶剂包括但不限于DMF、DMSO、DCM、THF、乙腈、或吡啶。

[0030] 作为实施方案之一，所述步骤1)中的含有中间链接键的化合物的用量包括但不限于1～3eq；作为进一步实施方案之一，所述含有中间链接键的化合物的用量为1.2eq。

[0031] 作为实施方案之一，所述步骤1)中的反应温度为0～80℃，作为进一步实施方案之一，反应温度为室温条件。

[0032] 作为实施方案之一，所述步骤a)或2)中有机溶剂包括但不限于DMF或DMSO。

[0033] 作为实施方案之一，所述步骤a)或2)中缩合剂包括但不限于2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、4‑(4,6‑二甲氧基三嗪)‑4‑甲基吗啉盐酸盐
(DMT‑MM)、二环己基碳二亚胺‑N‑羟基琥珀酰亚胺(DCC‑NHS)或1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙
基碳二亚胺盐酸盐‑N‑羟基琥珀酰亚胺(EDCI‑NHS)。

[0034] 作为实施方案之一，所述步骤a)或2)中进一步包括反应在碱性条件下进行。

[0035] 作为实施方案之一，在所述步骤a)或2)中进一步包括碱为DIPEA；DIPEA优选用量为2.0eq。

[0036] 作为实施方案之一，所述步骤a)或2)中缩合剂的用量包括但不限于1～3eq，作为进一步实施方案之一，所述缩合剂的用量优选1.2～1.5eq，作为示例性的说明，所述缩合剂
的用量为1.2、1.3、1.4、或1.5eq，

[0037] 作为实施方案之一，所述步骤a)或2)中的反应温度为0～80℃，作为进一步实施方案之一，反应温度为室温条件。

[0038] 作为实施方案之一，所述步骤a)或2)中的反应时间为0.5h～24h，作为进一步实施方案之一，反应时间为约1小时。

[0039] 本发明制备方法中所采用的各种分析、检测、脱保护基及纯化等方法均可以由本领域技术人员根据本发明公开内容并结合本领域常识进行确定，其并不影响本发明的实
施。

[0040] 本发明还提供一种所述ODN或其衍生物的多肽偶合物在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。

[0041] 本发明还提供一种所述ODN或其衍生物的多肽偶合物在制备治疗关节炎的药物中的应用。

[0042] 本发明通过对ODN或其衍生物的多肽偶合物，即(Asp)8‑ODN偶合物进行相关的药效和药理学研究。

[0043] 体外药效实验显示(Asp)8‑ODN偶合物能显著地抑制组织蛋白酶K活性，且不产生对其他组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、S和L)的脱靶效应，这种酶活性抑制力和选择性与
ODN没有差异。(Asp)8‑ODN偶合物能显著地抑制体外培养诱导的破骨细胞的组织蛋白酶K活
性及其介导的骨吸收能力，显著地降低了骨吸收生化标志物CTX‑I的水平，且与ODN没有差
异。以(Asp)8‑ODN偶合物进行体内实验，用FAM荧光素标记的(Asp)8‑ODN偶合物和ODN并分别
注射给绝经后骨质疏松小鼠。通过生物光子成像技术，分析荧光信号的体内分布。结果显
示：注射(Asp)8‑ODN偶合物的小鼠骨组织内的荧光信号强度显著高于注射ODN的小鼠，而其
心血管组织(包括心脏和主动脉)及脑组织内的荧光信号强度则显著低于对照组小鼠。组织
学分析显示，注射(Asp)8‑ODN偶合物的小鼠骨吸收表面上FAM荧光素标记药物的共定位数
量显著多于注射ODN的小鼠。通过酶活性测试检测各器官组织的组织蛋白酶K活性，结果显
示注射(Asp)8‑ODN偶合物的小鼠骨组织内组织蛋白酶K活性水平显著低于注射ODN的小鼠，
而其心脑血管组织内的组织蛋白酶K活性水平则显著高于注射ODN的小鼠。应用(Asp)8‑ODN
偶合物治疗去势后骨质疏松小鼠，结果显示，与空白对照组相比，(Asp)8‑ODN偶合物治疗一
个月后小鼠血清骨吸收标志物的水平显著降低，且骨量丢失显著减轻。

[0044] (Asp)8‑ODN偶合物的剂量随给药途径、受试者年龄和体重而改变。剂量通常为成人30‑50mg/kg/周，优选为30～40mg/kg/周。

[0045] 在药物的安全性方面，在小鼠体外毒性实验结果发现，(Asp)8‑ODN偶合物对小鼠破骨细胞无明显毒性。在小鼠体内毒性实验结果发现，(Asp)8‑ODN偶合物对小鼠无明显毒
性。

[0046] ODN治疗骨质疏松患者，缺乏骨靶向性而造成骨组织外的脱靶效应，本发明通过用具有骨靶向性的(Asp)8偶合ODN，形成(Asp)8‑ODN偶合物，可用于解决ODN治疗中潜在的脱靶
效应及不良反应问题。该发明可以用于各种骨质疏松疾病的治疗，解决了现有药物无法治
疗给患者所带来的痛苦。同时，本发明所述化合物可有效减缓骨关节炎的病理过程，亦可用
于骨关节炎的早期治疗。

[0047] 本发明的工艺简单，质量可控，重现性好，适于生产。本发明所述化合物具有靶向性好、抗癌活性强、毒副作用低，水溶性好、生物利用度高的特点；且发明方法工艺科学合
理，质量可控，重现性好，适于生产。

附图说明

[0048] 图1：试验例2中(Asp)8‑ODN偶合物对体外诱导的破骨细胞组织蛋白酶K及其介导骨吸收的影响。(A)(Asp)8‑ODN偶合物处理的破骨细胞组织蛋白酶K活性。(B)(Asp)8‑ODN偶
合物处理后的破骨细胞上清中骨吸收生化标志物CTX‑I的水平。(C)(Asp)8‑ODN偶合物处理
后的破骨细胞骨吸收活性。

[0049] 图2：试验例3中(A)FAM荧光素标记的(Asp)8‑ODN偶合物及ODN在健康小鼠体内不同器官的分布数据。(B)TRAP染色标记左侧股骨远端的骨吸收表面并分析FAM荧光素与骨吸
收表面的共定位。

[0050] 图3：试验例4中小鼠骨与非骨器官组织(心脏及主动脉、脑组织、肾脏、肝脏、肺)内组织蛋白酶K活性。

[0051] 图4：试验例5中(Asp)8‑ODN偶合物处理体外破骨细胞的MTT试验数据。

[0052] 图5：试验例6中(Asp)8‑ODN偶合物对去势后骨质疏松小鼠的治疗效果；(A)小鼠骨密度BMD数据(显微CT)；(B)小鼠骨体积分数BV/TV数据(显微CT)；(C)小鼠血清骨吸收标志
物CTX‑I水平。

[0053] 图6：试验例7中(Asp)8‑ODN偶合物对前交叉韧带切断小鼠的治疗效果(OARSI病理评分)。

[0054] 图7：实施例12中化合物M1的氢谱；

[0055] 图8：实施例12中化合物M1的碳谱；

[0056] 图9：实施例12中化合物M2的氢谱；

[0057] 图10：实施例12中化合物M2的碳谱；

[0058] 图11：实施例12中化合物M3的氢谱；

[0059] 图12：实施例12中化合物M3的碳谱。

具体实施方式

[0060] 以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

[0061] 反应路线1

[0062]

[0063] 化合物A‑1的合成:

[0064] 在室温条件下，将1.0eq.的ODN溶于乙腈中，再加入1.2eq.的溴乙酸苄酯和2.0eq.的碳酸钾。将反应体系温度升至60℃，并在此温度下反应24小时，TLC监测反应完全后，加入
水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将
粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品A‑1。

[0065] 化合物A‑2的合成:

[0066] 将1.0eq.的A‑1溶于四氢呋喃中，加入1M的氢氧化锂水溶液，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到A‑1反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合
并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分
离纯化得到纯品A‑2。

[0067] 化合物A‑3的合成:

[0068] 将1.0eq.的A‑2溶于DCM中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的2‑氨基乙酸苄酯，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到A‑2反应消失完全，将有机溶剂
减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过
滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品A‑3。

[0069] 化合物A‑4的合成:

[0070] 将1.0eq.的A‑3溶于四氢呋喃中，加入1M的氢氧化锂水溶液，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到A‑3反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合
并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分
离纯化得到纯品A‑4。

[0071] 化合物A‑5的合成:

[0072] 将1.0eq.的A‑4溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到A‑4反应消失完全，将有机溶剂减压
除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓
缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品A‑5。

[0073] 化合物A‑6的合成:

[0074] 将1.0eq.的A‑5溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到A‑5反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品A‑6。ESI‑MS:1559.35。

[0075] 实施施例2

[0076] 反应路线2

[0077]

[0078] 化合物B‑1的合成：

[0079] 将1.0eq.的Val溶于10％的碳酸钠水溶液中，在0℃条件下加入1.1eq溶于1,4二氧六环的Fmoc‑Cl。在此温度下反应1小时后，将反应体系自然升至室温过夜反应，TLC监测反
应完全后，将反应液到入水中，乙醚萃取三次，将水溶液冷却后，稀盐酸进行酸化后，再用乙
酸乙酯萃取三次，在减压条件下除去所得的有机溶液后得到化合物B‑1。

[0080] 化合物B‑2的合成：

[0081] 将化合物1.0eq的B‑1溶于四氢呋喃溶液后，在0℃条件下加入1.1eq.的NHS和1.1eq.的二环己基碳二亚胺(DCC)，将反应体系自然升至室温过夜反应，TLC监测反应完全
后，过滤除去不溶的DCU,再用冷却的四氢呋喃洗涤沉淀，合并有机溶液，在减压条件下除去
所得的有机溶液后可以得到粗品B‑2，直接用于下一步。

[0082] 化合物B‑3的合成：

[0083] 将1.0eq.的化合物B‑2溶于乙二醇二甲醚(DME)后，加入溶于碳酸氢钠水溶液的1.1eq.的Cit。再加入四氢呋喃提高溶解度。此反应在常温条件下搅拌16小时后，加入柠檬
酸水溶液，异丙醇/乙酸乙酯体系萃取两次后，合并有机相，减压除去有机溶剂，将所得到的
固体真空干燥6小时后，加入乙醚后，超声振荡后，过滤，干燥得到化合物B‑3。

[0084] 化合物B‑4的合成：

[0085] 将1.0eq.的化合物B‑3和2.0eq.的对氨基苯甲醇溶于体积比2:1的二氯甲烷和甲醇溶液中，再加入2.0eq.的2‑乙氧基‑1‑乙氧碳酰基‑1,2‑二氢喹啉(EEDQ)。整个反应体系
保持在常温条件避光反应36小时后，在40℃下减压除去有机溶剂，将所得到的固体置于乙
醚溶液中，超声振荡后过滤，冷却乙醚洗涤固体后，即得到化合物B‑4。

[0086] 化合物B‑5的合成：

[0087] 将1.0eq.的化合物B‑4和2.0eq.的吡啶溶于四氢呋喃溶液中，在‑40℃，氮气保护的条件下，加入2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯后，自然升至室温反应。溶液分别搅拌12小时，
24小时后再次冷却到‑40℃，补加2.0eq.的吡啶和2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯，最终反应36
小时后，加入乙酸乙酯，依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤后，将有机相用无水硫酸钠干
燥，过滤后除去有机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品B‑5。

[0088] 化合物B‑6的合成：

[0089] 将1.0eq.的化合物B‑5，1.1eq.的ODN以及1.1eq.的N,N‑二甲基苯胺溶于干燥的二氯甲烷中，在室温条件下避光过夜反应，TLC监测反应完全后，加入二氯甲烷稀释后，依次用
水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经过制备
色谱柱分离纯化得到纯品B‑6。

[0090] 化合物B‑7的合成：

[0091] 将1.0eq.的化合物B‑6溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品B‑7。

[0092] 化合物B‑8的合成：

[0093] 将1.0eq.的化合物B‑7溶于干燥的四氢呋喃中，依次加入2.0eq.的丁二酸酐，2.5eq.的吡啶。溶液在实验条件下搅拌5小时，TLC监测反应完全后，减压除去有机溶剂，再
加入乙酸乙酯稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去
有机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品B‑8。

[0094] 化合物B‑9的合成:

[0095] 将1.0eq.的B‑8溶于DMF中，加入1.2eq.的2‑(7‑氧化苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和2.0eq.的N,N‑二异丙基乙胺(DIPEA)，然后加入1.1eq.的(Asp‑
tBu)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到B‑8反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，
加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗
品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品B‑9。

[0096] 化合物B‑10的合成:

[0097] 将1.0eq.的B‑9溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到B‑9反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品B‑10。ESI‑MS:1979.49。

[0098] 实施施例3

[0099] 反应路线3

[0100]

[0101] 化合物C‑1的合成：

[0102] 在常温条件下，向溶有ODN(1.0eq.)的吡啶溶液中加入1.2eq.的丁二酸酐。在氮气保护的条件下,保持在此温度下反应5小时。反应结束后(TLC监测)，加入正己烷，将产生的
固体抽滤，并用正己烷洗涤固体产物。最后将粗品用正己烷/乙酸乙酯来重结晶进行纯化得
到C‑1。

[0103] 化合物C‑2的合成:

[0104] 将1.0eq.的C‑1溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到C‑1反应消失完全，将有机溶剂减压
除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓
缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品C‑2。

[0105] 化合物C‑3的合成:

[0106] 将1.0eq.的C‑2溶于MeOH中，加入三氟乙酸(TFA)，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到C‑2反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分
离纯化得到纯品C‑3。ESI‑MS:1544.34。

[0107] 实施施例4

[0108] 反应路线4

[0109]

[0110] 化合物D‑1的合成:

[0111] 在0℃，将1.0eq.的OND和1.1eq.的三乙胺溶于二氯甲烷中，然后加入1.1eq.的Z‑1，这个反应体系保持在此条件下反应12小时，TLC监测反应完全后，加入水稀释，二氯甲烷
萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备
色谱柱分离纯化得到纯品D‑1。

[0112] 化合物D‑2的合成:

[0113] 向三口反应瓶中，投入1.0eq.的D‑1，加入四氢呋喃溶液，投入10％的钯碳，通入氢气置换三次，并保持氢气源与反应系统相通，常温条件搅拌反应12小时，TLC监测反应完全
后，过滤除去钯碳，加入水稀释，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸
钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品D‑2。

[0114] 化合物D‑3的合成:

[0115] 将1.0eq.的D‑2溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到D‑2反应消失完全，将有机溶剂减压
除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓
缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品D‑3。

[0116] 化合物D‑4的合成:

[0117] 将1.0eq.的D‑3溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到D‑3反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品D‑4。ESI‑MS:1545.33。

[0118] 实施施例5

[0119] 反应路线5

[0120]

[0121] 合物E‑1的合成:

[0122] 在0℃条件下，将1.0eq.的OND和1.5eq.的三乙胺溶于二氯甲烷中，然后加入1.1eq.的Z‑2，这个反应体系保持在此条件下反应12小时，TLC监测反应完全后，加入水稀
释，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗
品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品E‑1。

[0123] 化合物E‑2的合成:

[0124] 向三口反应瓶中，投入1.0eq.的E‑1，加入四氢呋喃溶液，投入10％的钯碳，通入氢气置换三次，并保持氢气源与反应系统相通，常温条件搅拌反应12小时，TLC监测反应完全
后，过滤除去钯碳，加入水稀释，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸
钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品E‑2。

[0125] 化合物E‑3的合成:

[0126] 将1.0eq.的E‑2溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到E‑2反应消失完全，将有机溶剂减压
除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓
缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品E‑3。

[0127] 化合物E‑4的合成:

[0128] 将1.0eq.的E‑3溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到E‑3反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品E‑4。ESI‑MS:1628.43。

[0129] 实施施例6

[0130] 反应路线6

[0131]

[0132]

[0133] 化合物F‑1的合成：

[0134] 将1.0eq.的Fmoc‑Lys‑OH溶于碳酸氢钠水溶液和四氢呋喃的混合溶液中，在0℃条件下缓慢加入1.1eq的烯丙基氯甲酸。在此温度下反应1小时后，将反应体系自然升至室温
过夜反应，TLC监测反应完全后，将反应液倒入水中，将水溶液冷却后，稀盐酸进行酸化后，
再用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶
剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品F‑1。

[0135] 化合物F‑2的合成：

[0136] 将化合物1.0eq.F‑1溶于四氢呋喃溶液后，在0℃条件下加入1.1eq.的NHS和1.1eq.的二环己基碳二亚胺(DCC)，将反应体系自然升至室温过夜反应，TLC监测反应完全
后，过滤除去不溶的DCU,再用冷却的四氢呋喃洗涤沉淀，合并有机溶液，在减压条件下除去
所得的有机溶液后可以得到粗品F‑2，直接用于下一步。

[0137] 化合物F‑3的合成：

[0138] 将1.0eq.的化合物F‑2溶于DME后，加入溶于碳酸氢钠水溶液的1.1eq.的苯丙氨酸(Phe)。再加入四氢呋喃提高溶解度。反应在常温条件下搅拌16小时后，加入柠檬酸水溶液，
异丙醇/乙酸乙酯体系萃取两次后，合并有机相，减压除去有机溶剂，将所得到的固体真空
干燥6小时后，加入乙醚后，超声振荡后，过滤，干燥得到化合物F‑3。

[0139] 化合物F‑4的合成：

[0140] 将1.0eq.的化合物F‑3和2.0eq.的对氨基苯甲醇溶于体积比2:1的二氯甲烷和甲醇溶液中，再加入2.0eq.的2‑乙氧基‑1‑乙氧碳酰基‑1,2‑二氢喹啉(EEDQ)。整个反应体系
保持在常温条件避光反应36小时后，在40℃下减压除去有机溶剂，将所得到的固体置于乙
醚溶液中，超声振荡后过滤，冷却乙醚洗涤固体后，即得到化合物F‑4。

[0141] 化合物F‑5的合成：

[0142] 将1.0eq.的化合物F‑4和2.0eq.的吡啶溶于四氢呋喃溶液中，在‑40℃，氮气保护的条件下，加入2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯后，自然升至室温反应。溶液分别搅拌12小时，
24小时后再次冷却到‑40℃，补加2.0eq.的吡啶和2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯，最终反应36
小时后，加入乙酸乙酯，依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤后，将有机相用无水硫酸钠干
燥，过滤后除去有机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品F‑5。

[0143] 化合物F‑6的合成：

[0144] 将1.0eq.的化合物F‑5，1.1eq.的ODN以及1.1eq.的N,N‑二甲基苯胺溶于干燥的二氯甲烷中，在室温条件下避光过夜反应，TLC监测反应完全后，加入二氯甲烷稀释后，依次用
水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经过制备
色谱柱分离纯化得到纯品F‑6。

[0145] 化合物F‑7的合成：

[0146] 将1.0eq.的化合物F‑6，1.1eq.的1,3‑二甲基巴比妥酸以及0.1eq.的四三苯基膦钯溶于干燥的四氢呋喃中，在室温条件下氮气保护反应48h，TLC监测反应完全后，加入二氯
甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶
剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品F‑7。

[0147] 化合物F‑8的合成：

[0148] 将1.0eq.的化合物F‑7溶于干燥的四氢呋喃中，依次加入2.0eq.的丁二酸酐，2.5eq.的吡啶。溶液在实验条件下搅拌5小时，TLC监测反应完全后，减压除去有机溶剂，再
加入乙酸乙酯稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去
有机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品F‑8。

[0149] 化合物F‑9的合成:

[0150] 将1.0eq.的F‑8溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到F‑8反应消失完全，将有机溶剂减压
除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓
缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品F‑9。

[0151] 化合物F‑10的合成:

[0152] 将1.0eq.的F‑9溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到F‑9反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品F‑10。

[0153] 化合物F‑11的合成：

[0154] 将1.0eq.的化合物F‑10溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，用RP‑HPLC纯化粗品后得到目标产物F‑11。ESI‑MS:2107.。

[0155] 实施施例7

[0156] 反应路线7

[0157]

[0158] 化合物G‑1的合成:

[0159] 将1.0eq.的ODN溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8‑NHFmoc，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到ODN反应消失完全，将有机溶
剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，
过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品G‑1。

[0160] 化合物G‑2的合成：

[0161] 将1.0eq.的化合物G‑1溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品G‑2。

[0162] 化合物G‑3的合成:

[0163] 将1.0eq.的G‑2溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到G‑2反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品G‑3。ESI‑MS:1473.26

[0164] 实施施例8

[0165] 反应路线8

[0166]

[0167] 化合物H‑1的合成：

[0168] 将1.0eq.的Val溶于10％的碳酸钠水溶液中，在0℃条件下加入1.1eq溶于1,4二氧六环的Fmoc‑Cl。在此温度下反应1小时后，将反应体系自然升至室温过夜反应，TLC监测反
应完全后，将反应液到入水中，乙醚萃取三次，将水溶液冷却后，稀盐酸进行酸化后，再用乙
酸乙酯萃取三次，在减压条件下除去所得的有机溶液后得到化合物H‑1。

[0169] 化合物H‑2的合成：

[0170] 将化合物1.0eq.H‑1溶于四氢呋喃溶液后，在0℃条件下加入1.1eq.的NHS和1.1eq.的DCC，将反应体系自然升至室温过夜反应，TLC监测反应完全后，过滤除去不溶的
DCU,再用冷却的四氢呋喃洗涤沉淀，合并有机溶液，在减压条件下除去所得的有机溶液后
可以得到粗品H‑2，直接用于下一步。

[0171] 化合物H‑3的合成：

[0172] 将1.0eq.的化合物H‑2溶于DME后，加入溶于碳酸氢钠水溶液的1.1eq.的Cit。再加入四氢呋喃提高溶解度。在反应在常温条件下搅拌16小时后，加入柠檬酸水溶液，异丙醇/
乙酸乙酯体系萃取两次后，合并有机相，减压除去有机溶剂，将所得到的固体真空干燥6小
时后，加入乙醚后，超声振荡后，过滤，干燥得到化合物H‑3。

[0173] 化合物H‑4的合成：

[0174] 将1.0eq.的化合物H‑3和2.0eq.的对氨基苯甲醇溶于体积比2:1的二氯甲烷和甲醇溶液中，再加入2.0eq.的EEDQ。整个反应体系保持在常温条件避光反应36小时后，在40℃
下减压除去有机溶剂，将所得到的固体置于乙醚溶液中，超声振荡后过滤，冷却乙醚洗涤固
体后，即得到化合物H‑4。

[0175] 化合物H‑5的合成：

[0176] 将1.0eq.的化合物H‑4和2.0eq.的吡啶溶于四氢呋喃溶液中，在‑40℃，氮气保护的条件下，加入2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯后，自然升至室温反应。溶液分别搅拌12小时，
24小时后再次冷却到‑40℃，补加2.0eq.的吡啶和2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯，最终反应36
小时后，加入乙酸乙酯，依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤后，将有机相用无水硫酸钠干
燥，过滤后除去有机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品H‑5。

[0177] 化合物H‑6的合成：

[0178] 将1.0eq.的化合物H‑5，1.1eq.的ODN以及1.1eq.的N,N‑二甲基苯胺溶于干燥的二氯甲烷中，在室温条件下避光过夜反应，TLC监测反应完全后，加入二氯甲烷稀释后，依次用
水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经过制备
色谱柱分离纯化得到纯品H‑6。

[0179] 化合物H‑7的合成：

[0180] 将1.0eq.的化合物H‑6溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品H‑7。

[0181] 化合物H‑8的合成:

[0182] 将1.0eq.的化合物H‑7溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8‑NHFmoc，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到H‑7反应消失完全，将
有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠
干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品H‑8。

[0183] 化合物H‑9的合成：

[0184] 将1.0eq.的化合物H‑8溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品H‑9。

[0185] 化合物H‑10的合成:

[0186] 将1.0eq.的H‑9溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到H‑9反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品H‑10。ESI‑MS:1878.71

[0187] 实施施例9

[0188] 反应路线9

[0189]

[0190] 化合物J‑1的合成:

[0191] 在0℃，将1.0eq.的ODN和1.1eq.的三乙胺溶于二氯甲烷中，然后加入1.1eq.的Z‑3，这个反应体系保持在此条件下反应12小时，TLC监测反应完全后，加入水稀释，二氯甲烷
萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备
色谱柱分离纯化得到纯品J‑1。

[0192] 化合物J‑2的合成:

[0193] 向三口反应瓶中，投入1.0eq.的J‑1，加入四氢呋喃溶液，投入10％的钯碳，通入氢气置换三次，并保持氢气源与反应系统相通，常温条件搅拌反应12小时，TLC监测反应完全
后，过滤除去钯碳，加入水稀释，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸
钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品J‑2。

[0194] 化合物J‑3的合成:

[0195] 将1.0eq.的化合物J‑2溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8‑NHFmoc，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到J‑2反应消失完全，将
有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠
干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品J‑3。

[0196] 化合物J‑4的合成：

[0197] 将1.0eq.的化合物J‑3溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品J‑4。

[0198] 化合物J‑5的合成:

[0199] 将1.0eq.的J‑4溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到J‑4反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品J‑5。ESI‑MS:1559.35。

[0200] 实施施例10

[0201] 反应路线10

[0202]

[0203] 化合物K‑1的合成:

[0204] 在0℃条件下，将1.0eq.的ODN和1.5eq.的三乙胺溶于二氯甲烷中，然后加入1.1eq.的Z‑4，这个反应体系保持在此条件下反应12小时，TLC监测反应完全后，加入水稀
释，二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗
品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品K‑1。

[0205] 化合物K‑2的合成:

[0206] 向三口反应瓶中，投入1.0eq.的K‑1，加入四氢呋喃溶液，投入10％的钯碳，通入氢气置换三次，并保持氢气源与反应系统相通，常温条件搅拌反应12小时，TLC监测反应完全
后，过滤除去钯碳，加入水稀释，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸
钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品K‑2。

[0207] 化合物K‑3的合成:

[0208] 将1.0eq.的化合物K‑2溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8‑NHFmoc，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到K‑2反应消失完全，将
有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠
干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品K‑3。

[0209] 化合物K‑4的合成：

[0210] 将1.0eq.的化合物K‑3溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品K‑4。

[0211] 化合物K‑5的合成:

[0212] 将1.0eq.的K‑4溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到K‑4反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品K‑5。ESI‑MS:1642.42

[0213] 实施施例11

[0214] 反应路线11

[0215]

[0216]

[0217] 化合物L‑1的合成：

[0218] 将1.0eq.的Fmoc‑Lys‑OH溶于碳酸氢钠水溶液和四氢呋喃的混合溶液中，在0℃条件下缓慢加入1.1eq的烯丙基氯甲酸。在此温度下反应1小时后，将反应体系自然升至室温
过夜反应，TLC监测反应完全后，将反应液到入水中，将水溶液冷却后，稀盐酸进行酸化后，
再用乙酸乙酯萃取三次，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶
剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品L‑1。

[0219] 化合物L‑2的合成：

[0220] 将化合物1.0eq.L‑1溶于四氢呋喃溶液后，在0℃条件下加入1.1eq.的NHS和1.1eq.的二环己基碳二亚胺(DCC)，将反应体系自然升至室温过夜反应，TLC监测反应完全
后，过滤除去不溶的二环己基脲(DCU),再用冷却的四氢呋喃洗涤沉淀，合并有机溶液，在减
压条件下除去所得的有机溶液后可以得到粗品L‑2，直接用于下一步。

[0221] 化合物L‑3的合成：

[0222] 将1.0eq.的化合物L‑2溶于乙二醇二甲醚(DME)后，加入溶于碳酸氢钠水溶液的1.1eq.的Phe。再加入四氢呋喃提高溶解度。在反应在常温条件下搅拌16小时后，加入柠檬
酸水溶液，异丙醇/乙酸乙酯体系萃取两次后，合并有机相，减压除去有机溶剂，将所得到的
固体真空干燥6小时后，加入乙醚后，超声振荡后，过滤，干燥得到化合物L‑3。

[0223] 化合物L‑4的合成：

[0224] 将1.0eq.的化合物L‑3和2.0eq.的对氨基苯甲醇溶于体积比2:1的二氯甲烷和甲醇溶液中，再加入2.0eq.的2‑乙氧基‑1‑乙氧碳酰基‑1,2‑二氢喹啉(EEDQ)。整个反应体系
保持在常温条件避光反应36小时后，在40℃下减压除去有机溶剂，将所得到的固体置于乙
醚溶液中，超声振荡后过滤，冷却乙醚洗涤固体后，即得到化合物L‑4。

[0225] 化合物L‑5的合成：

[0226] 将1.0eq.的化合物L‑4和2.0eq.的吡啶溶于四氢呋喃溶液中，在‑40℃，氮气保护的条件下，加入2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯后，自然升至室温反应。溶液分别搅拌12小时，
24小时后再次冷却到‑40℃，补加2.0eq.的吡啶和2.0eq.对硝基苯基氯甲酸酯，最终反应36
小时后，加入乙酸乙酯，依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤后，将有机相用无水硫酸钠干
燥，过滤后除去有机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品L‑5。

[0227] 化合物L‑6的合成：

[0228] 将1.0eq.的化合物L‑5，1.1eq.的ODN以及1.1eq.的N,N‑二甲基苯胺溶于干燥的二氯甲烷中，在室温条件下避光过夜反应，TLC监测反应完全后，加入二氯甲烷稀释后，依次用
水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶剂，所得粗品经过制备
色谱柱分离纯化得到纯品L‑6。

[0229] 化合物L‑7的合成：

[0230] 将1.0eq.的化合物L‑6，1.1eq.的1,3‑二甲基巴比妥酸以及0.1eq.的四三苯基膦钯溶于干燥的四氢呋喃中，在室温条件下氮气保护反应48h，TLC监测反应完全后，加入二氯
甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有机溶
剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品L‑7。

[0231] 化合物L‑8的合成:

[0232] 将1.0eq.的化合物L‑7溶于DMF中，加入1.2eq.的HATU和2.0eq.的DIPEA，然后加入1.1eq.的(Asp‑tBu)8‑NHFmoc，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到L‑7反应消失完全，将
有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠
干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品L‑8。

[0233] 化合物L‑9的合成：

[0234] 将1.0eq.的化合物L‑8溶于DMF溶液中，加入3.8eq.的哌啶，常温反应1小时后，加入二氯甲烷稀释后，依次用水，饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去有
机溶剂，所得粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品L‑9。

[0235] 化合物L‑10的合成:

[0236] 将1.0eq.的L‑9溶于MeOH中，加入TFA，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到L‑9反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到
纯品L‑10。ESI‑MS:1897.75

[0237] 实施施例12

[0238] 反应路线12

[0239]

[0240] 化合物M‑1的合成:

[0241] 在室温条件下，将1.0eq.的ODN溶于乙腈中，再加入1.2eq.的溴乙酸苄酯和2.0eq.的碳酸钾。将反应体系温度升至60℃，并在此温度下反应24小时，TLC监测反应完全后，加入
水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将
粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品M‑1。

[0242] 化合物M‑2的合成:

[0243] 将1.0eq.的M‑1溶于四氢呋喃中，加入1M的氢氧化锂水溶液，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到M‑1反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，加入水，乙酸乙酯萃取，后合
并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，将粗品经过制备色谱柱分
离纯化得到纯品M‑2。

[0244] 化合物M‑3的合成:

[0245] 将1.0eq.的M‑2溶于DCM中，加入1.2eq.的NHS和2.0eq.的DCC，然后加入0.1eq.的DMAP，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到M‑2反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，加
入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，
将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品M‑3。

[0246] 化合物M‑4的合成:

[0247] 将1.0eq.的化合物M‑3溶于DMF中，加入2.0eq.的DIPEA，然后加入1.5eq.的(Asp)8，常温条件下反应，LC‑MS监测反应，直到(Asp)8反应消失完全，将有机溶剂减压除去后，加
入水，乙酸乙酯萃取，后合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，
将粗品经过制备色谱柱分离纯化得到纯品M‑4。

[0248] 试验例1、(Asp)8‑ODN偶合物对组织蛋白酶K的选择性试验

[0249] 2.1试剂

[0250] 试剂:人源组织蛋白酶K活性检测试剂盒，人源组织蛋白酶S活性检测试剂盒，人源组织蛋白酶B活性检测试剂盒，人源组织蛋白酶L活性检测试剂盒；ODN；(Asp)8‑ODN偶合物
实施施例12制备。

[0251] 2.2试验方法

[0252] 组织蛋白酶活性测试试剂盒的原理为具有活性的组织蛋白酶可以切割链接AFC荧光基团的酶底物，根据检测到的AFC荧光基团强度定量样品内的组织蛋白酶活性。基于以上
原理，将(Asp)8‑ODN偶合物和ODN分别与不同组织蛋白酶特异性的底物进行孵育，终止反应
后分别检测AFC荧光强度，并计算IC50(半抑制浓度)值。

[0253] 2.2试验结果

[0254] 结果显示(Asp)8‑ODN偶合物能显著地抑制组织蛋白酶K活性，且不产生对其他组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、S和L)的脱靶效应，这种酶活性抑制力的选择性与ODN没有差
异(见表1)。

[0255] 表1：

[0256]

[0257] 试验例2、(Asp)8‑ODN偶合物对破骨细胞分泌的组织蛋白酶K及其介导的骨吸收的体外抑制试验

[0258] 2.1试剂及细胞

[0259] 试剂:小鼠骨髓巨噬细胞系细胞RAW264.7；ODN；(Asp)8‑ODN偶合物实施施例12制备；磷酸盐缓冲液(PBS)；核因子kappa‑B配体受体激活剂(RANKL)；Dulbecco's Modified 
Eagle Medium培养基；小鼠源组织蛋白酶K活性检测试剂盒；软骨片；CTX‑I ELISA试剂盒；
甲苯胺蓝染色液。

[0260] 2.2试验方法

[0261] RAW264.7细胞生长于软骨片上，于培养基中加入50ng/ml的RANKL使细胞诱导形成破骨细胞，诱导时间为7天。在诱导开始后，给予细胞(Asp)8‑ODN偶合物、ODN或空白试剂
(PBS)。7天后，提取上清液，应用小鼠源组织蛋白酶K活性检测试剂盒检测破骨细胞分泌的
组织蛋白酶活性。应用CTX‑I ELISA试剂盒检测上清液中的骨吸收标志物CTX‑I水平。应用
甲苯胺蓝染色方法检测破骨细胞对软骨片的骨吸收面积。

[0262] 2.3试验结果

[0263] (Asp)8‑ODN偶合物能显著地抑制体外培养诱导的破骨细胞的组织蛋白酶K活性及其介导的骨吸收能力，显著地降低了骨吸收生化标志物CTX‑I的水平，且与ODN没有差异(参
见图1)。

[0264] 试验例3、(Asp)8‑ODN偶合物在体内的器官组织分布试验

[0265] 2.1试剂及动物

[0266] 3月龄雌性C57/BL6小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养；FAM荧光基团标记的ODN；FAM荧光基团标记的(Asp)8‑ODN偶合物(由实施施例12制备)；磷酸盐缓冲液(PBS)；
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒。

[0267] 2.2试验方法

[0268] 小鼠在去势后1个月时，接受FAM荧光基团标记的(Asp)8‑ODN偶合物及ODN注射(10μM)，注射4小时后，处死小鼠，取材两侧股骨以及非骨器官组织(心脏及主动脉、脑组织、肾
脏、肝脏、肺)。针对器官水平上的选择性分布研究，通过IVIS生物成像系统观察FAM荧光信
号在左侧股骨及非骨器官上的分布情况，通过荧光分析仪定量FAM荧光信号在左侧股骨及
非骨器官上的积累情况；针对组织水平的选择性分布研究，剖开左侧股骨，树脂包埋切片，
通过TRAP染色标记骨吸收表面，分析FAM荧光信号和骨吸收表面在切片上的共定位。

[0269] 2.3试验结果

[0270] 结果显示：注射(Asp)8‑ODN偶合物的小鼠骨组织内的荧光信号强度显著高于注射ODN的小鼠，而其心血管组织(包括心脏和主动脉)及脑组织内的荧光信号强度则显著低于
对照组小鼠。组织学分析显示，注射(Asp)8‑ODN偶合物的小鼠骨吸收表面上FAM荧光素标记
药物的共定位数量显著多于注射ODN的小鼠(参见图2)。

[0271] 试验例4、(Asp)8‑ODN偶合物对体内不同器官组织的组织蛋白酶K活性的选择性试验

[0272] 2.1试剂及动物

[0273] 3月龄雌性C57/BL6小鼠接受去势手术后放回笼子里正常饲养；ODN；(Asp)8‑ODN偶合物(由实施施例12制备)；磷酸盐缓冲液(PBS)；小鼠源组织蛋白酶K活性测试试剂盒。

[0274] 2.2试验方法

[0275] 小鼠在去势后1个月时，接受(Asp)8‑ODN偶合物及ODN注射(10μM)，注射24小时后，处死小鼠，取材两侧股骨以及非骨器官组织(脑组织、心脏及主动脉、肝脏、肺、肾脏)。各组
织经过液氮研磨匀浆后，通过小鼠源组织蛋白酶K活性测试试剂盒分析骨与非骨器官组织
内的组织蛋白酶K活性水平。

[0276] 2.2试验结果

[0277] 结果显示注射(Asp)8‑ODN偶合物的小鼠骨组织内组织蛋白酶K活性水平显著低于注射ODN的小鼠，而其非骨器官组织内的组织蛋白酶K活性水平则显著高于注射ODN的小鼠
(参见图3)。

[0278] 试验例5、(Asp)8‑ODN偶合物体外毒性试验和体内毒性试验结果

[0279] 按试验例3方法体外诱导破骨细胞。诱导7天后，与不同浓度单位的(Asp)8‑ODN偶合物分别孵育72小时后，加入MTT(5mg/ml)10ul，37℃孵育4小时后用150ul DMSO溶液溶解
紫色结晶后放置于酶标仪以570nm吸收度检测。按试验例4方法，取小鼠在去势后1个月时，
接受高低剂量的(Asp)8‑ODN偶合物(10μM和50μM)，注射24小时后，取血样分析治疗前后各
血生化指标结果。

[0280] 结果显示，(Asp)8‑ODN偶合物(实施例12制备)在不同浓度下未对破骨细胞造成显著的毒性作用(参见图4)。从治疗前后各血生化指标结果得出(Asp)8‑ODN偶合物对小鼠无
明显毒性(见表2)。

[0281] 表2(Asp)8‑ODN偶合物的体内毒性试验结果

[0282]

[0283] ALT:丙氨酸氨基转移酶；AST：门冬氨酸氨基转移酶；BUN:血尿素；WBC:白细胞；HGB:血红蛋白；RBC:红细胞；HCT:红细胞比容；PLT:血小板；

[0284] 试验例6、(Asp)8‑ODN偶合物对去势后骨质疏松小鼠的治疗效果

[0285] 按试验例4方法，48只3月龄雌性C57/BL6小鼠，随机取16只小鼠做假手术，剩余32只做卵巢切除手术，放回笼子里正常饲养至4月龄以备实验用。接受卵巢切除手术的小鼠随
机均分成如下几组：OVX Baseline组(n＝8)、OVX+PBS组(n＝8)、OVX+(Asp)8‑ODN组(n＝8)
与OVX+ODN组(n＝8)。接受假手术的小鼠随机均分成如下几组：Sham Baseline组(n＝8)与
Sham+PBS组(n＝8)。实验前，显微CT对小鼠股骨和椎体骨量进行测定，验证骨质疏松的发
生。给药前，处死OVX Baseline组和Sham Baseline组的小鼠分别作为基线。随后，各组小鼠
分别通过尾静脉注射的方式给予10μM的(Asp)8‑ODN偶合物(实施施例12制备)、ODN和相同
体积的溶剂对照(PBS)，每周给药一次，共计给药6周。同时，Sham+PBS组的小鼠通过尾静脉
注射的方式给予PBS作为对照。六周后，处死所有小鼠，分离双侧股骨及第5腰椎，清除骨表
面的软组织后，接受显微CT分析骨量及骨显微结构相关参数(包括骨密度BMD和相对骨体积
BV/TV等)。收集血清用于ELISA检测骨吸收生化标志物CTX‑I的水平。

[0286] 结果显示，(Asp)8‑ODN偶合物治疗6周后小鼠血清骨吸收标志物CTX‑I的水平显著降低，且骨密度BMD和相对骨体积BV/TV显著高于PBS组，且与ODN组没有差异(参见图5)。

[0287] 试验例7、(Asp)8‑ODN偶合物对前交叉韧带切断小鼠的治疗效果

[0288] 48只3月龄雌性C57/BL6小鼠，随机取16只小鼠做假手术，剩余32只接受前交叉韧带切断手术。接受前交叉韧带切断手术的小鼠随机均分成如下几组：ACLT Baseline组(n＝
8)、ACLT+PBS组(n＝8)、ACLT+(Asp)8‑ODN组(n＝8)与ALCT+ODN组(n＝8)。接受假手术的小
鼠随机均分成如下几组：Sham Baseline组(n＝8)与Sham+PBS组(n＝8)。给药前，处死ACLT 
Baseline组和Sham Baseline组的小鼠分别作为基线。随后，各组小鼠分别通过尾静脉注射
的方式给予10μM的(Asp)8‑ODN偶合物(实施例12制备)、ODN和相同体积的溶剂对照(PBS)，
每周给药一次，共计给药6周。同时，Sham+PBS组的小鼠通过尾静脉注射的方式给予PBS作为
对照。六周后，处死所有小鼠，分离两侧膝关节，清除骨表面的软组织后，进行病理组织学分
析，并计算骨关节炎病理评分OARSI分数。

[0289] 结果显示，(Asp)8‑ODN偶合物治疗一个月后小鼠骨关节炎病理评分显著降低，显著低于PBS组，与ODN组没有差异(参见图6)。