一种黑曲霉孢子的稳定剂及其应用

摘要

本发明提供一种黑曲霉孢子的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含L‑肌肽、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖、聚乙二醇和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。本发明的黑曲霉质控菌的稳定剂，可使质控菌冻干存活率达到80％以上，且能够在长期储存过程中保持菌含量的稳定性。

权利要求

1.一种黑曲霉孢子的稳定剂，溶剂为水，其特征在于：其溶质的质量百分数为：3%‑5% L‑肌肽、0.5%‑1%4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、5%‑10%蔗糖、1%‑5%聚乙二醇、0.05%‑0.3%聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。

2.一种黑曲霉孢子定量化质控品，其特征在于：由黑曲霉孢子与权利要求1所述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。

3.根据权利要求2所述的黑曲霉孢子定量化质控品，其特征在于：所述黑曲霉孢子的含量为300‑1000CFU/瓶。

4.一种黑曲霉孢子定量化质控品的制备方法，包括如下步骤：（1）菌株复苏：黑曲霉接种至复苏培养基，复苏传代；

（2）增菌：复苏的黑曲霉接种至增殖培养基中，培养增殖；

（3）计数：洗脱黑曲霉孢子，过滤掉菌丝，加入权利要求1所述的稳定剂，混匀，计数后分装，得定量化黑曲霉孢子菌液；

（4）冻干：将定量化黑曲霉孢子菌液冷冻干燥，密封得到黑曲霉孢子定量化质控品。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）还可为：洗脱黑曲霉孢子，加入权利要求1所述的稳定剂，过滤掉菌丝，混匀，计数后分装，得定量化黑曲霉孢子菌液。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至‑30℃至‑40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0‑3%。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述真空干燥的条件为：真空度10Pa‑

100Pa，干燥温度‑35℃至‑15℃，干燥时间20h‑48h；所述解析干燥的条件为：干燥温度0℃‑

25℃。

8.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中计数的方法为细胞计数仪计数。

说明书

一种黑曲霉孢子的稳定剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物质量控制领域，尤其涉及一种黑曲霉孢子的稳定剂及其应用。

背景技术

[0002] 黑曲霉是曲霉属真菌中的一个常见种，广泛存在于粮食、土壤和植物性产品中，可引起食物、谷物和谷蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素，此外黑曲霉极易通过空气扩散污染环境，对产品的生产和检验构成威胁。因此现行的食品微生物检验以及中国药典等多项国家标准均需进行霉菌的检验。而质控菌株作为微生物检验中的阳性对照，能够验证检验方法、对检验人员进行能力验证、验收微生物培养基，保证微生物实验过程的质量控制，是微生物检验过程中的标准物质。

[0003] 市场上关于黑曲霉的质控菌株多为定性菌株，没有固定的含菌量，使用者需进行复苏、传代稳定后进行稀释菌液，制备符合实验菌含量的菌悬液。大大增加了使用者的检验时间，且受专业技术等因素影响，部分使用者需多次实验才能稀释到所需菌细胞的数量，加大了人工成本以及时间成本，故提供定量的质控菌株能够提高使用者的检验效率，减少不必要的重复实验,保障质控过程的顺利进行。现有定量的黑曲霉质控菌种产品，因为技术有限，保质期较短，无法避免在运输和储存期间菌细胞数量发生变化，影响微生物检验过程质量的控制。如中国专利CN106929421A，制备出的定量微生物在‑20℃条件下保存期限为至少3个月，无法满足长时间的需求。又如中国专利CN109797108A所述的黑曲霉适用性试验菌株的制备方法，菌含量范围为500‑2000CFU/支，范围较大不利于使用，此外该制备方法使用营养琼脂产孢能力差，洗脱的菌苔未进行菌丝体处理，该方法不可持续生产定量质控菌。此外，稳定剂是菌株在冷冻干燥过程保护细胞的有效物质，由于不同的菌株生理代谢特性不同，在冷冻干燥过程中抗逆能力不同，因此在保护剂选择上有各自的偏好，因此需对不同种类的菌株进行筛选，以便得到效果最好的稳定剂。目前还未有一种稳定剂能够使黑曲霉孢子粉在冻干过程不受损失，且提高孢子粉在长期储存以及短期运输过程的稳定性。因此，提供一种黑曲霉冻干孢子粉的稳定剂及黑曲霉定量质控菌的制备方法，具有重要意义。

发明内容

[0004] 为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种黑曲霉孢子的稳定剂及其应用。

[0005] 本发明所采用的技术方案为：

[0006] 本发明的第一个方面，提供：

[0007] 一种黑曲霉孢子的稳定剂，溶剂为水，其溶质包含以下原料：L‑肌肽、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、蔗糖、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。

[0008] 在一些实施例中，其溶质的质量组成为：3‑5份L‑肌肽、0.5‑1份4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、5‑10份蔗糖、1‑5份聚乙二醇、0.05‑0.3份聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。

[0009] 在一些实施例中，其溶质的质量组成为：3％‑5％L‑肌肽、0.5％‑1％4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、5％‑10％蔗糖、1％‑5％聚乙二醇、0.05％‑0.3％聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。

[0010] 本发明的第二个方面，提供：

[0011] 一种黑曲霉孢子定量化质控品，由黑曲霉孢子与上述的稳定剂混匀后，定量后分装、冻干得到。

[0012] 在一些实施例中，黑曲霉孢子与稳定剂(干重)的混合比为300‑1000CFU/(0.1‑0.3)g稳定剂(干重)。这样可以保证细菌可以充分被稳定剂保护，同时也不会过于浪费稳定剂。

[0013] 在一些实施例中，上述的定量化质控品中黑曲霉的含量为300‑1000CFU/瓶。当然，也可以根据实际的需要，选择其他的含量。该孢子含量的偏差不大于20％。

[0014] 本发明的第三个方面，提供：

[0015] 一种黑曲霉定量质控品的制备方法，包括如下步骤：

[0016] (1)菌株复苏，黑曲霉接种至复苏培养基，复苏传代；

[0017] (2)增菌，复苏的黑曲霉接种至增殖培养基中，培养增殖；

[0018] (3)计数，过滤菌丝，加入上述的稳定剂，混匀，确定黑曲霉浓度后计数分装，得定量化黑曲霉菌液；

[0019] (4)冻干，将定量化黑曲霉菌液冷冻干燥，密封得到黑曲霉定量质控品。

[0020] 在一些实施例中，上述制备方法步骤(3)中所述计数还可为：加入上述的稳定剂，过滤菌丝，混匀，确定黑曲霉浓度后计数分装，得定量化黑曲霉菌液。

[0021] 在一些实施例中，步骤(2)中的增殖培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

[0022] 在一些实施例中，步骤(4)中冷冻干燥为采用液氮快速冷冻后，置于已预冷至‑30℃至‑40℃的冷冻干燥箱中平衡，真空干燥后解析干燥至样品含水量为0‑3％。

[0023] 在一些实施例中，真空干燥的条件为：真空度10Pa‑100Pa，干燥温度‑35℃至‑15℃，干燥时间20h‑48h；解析干燥条件为：干燥温度0℃‑25℃。

[0024] 在一些实施例中，步骤(3)中的计数方法为细胞计数仪计数。

[0025] 本发明的有益效果为：

[0026] 本发明的黑曲霉质控菌的稳定剂，使质控菌冻干存活率达到80％以上，且能够在长期储存过程中保持菌含量的稳定性。

附图说明

[0027] 图1为实施例与对比例中各组成中黑曲霉孢子含量随时间的变化图。

具体实施方式

[0028] 为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

[0029] 方便比较起见，菌株复苏、增菌、计数和冻干的操作如下：

[0030] 菌株复苏

[0031] 取黑曲霉(编号为CMCC98003购自：中国医学细菌保藏中心)划线接种到SDA培养基中进行复苏培养，培养温度30±1℃，并进行鉴定。

[0032] 增菌

[0033] 复苏并鉴定后的黑曲霉接种于马铃薯琼脂培养基中，并置于30±1℃培养5‑7天。

[0034] 计数

[0035] 将黑曲霉孢子洗脱至三角瓶，过滤菌丝，以洗脱液与稳定剂体积比为1:9的比例加入稳定剂得孢子混悬液，使用细胞计数仪测定黑曲霉孢子含量。

[0036] 冻干

[0037] 用稳定剂将孢子混悬液稀释至合适的浓度，分装至西林瓶，半加塞后采用液氮进行快速冷冻，置于已预冷至‑40℃的冷冻干燥箱中，平衡30min后，开启真空泵，真空干燥条件为：真空度15Pa，干燥温度‑25℃，干燥时间23h，真空干燥后进行解析干燥，解析干燥条件为：干燥温度20℃，干燥时间约10h，干燥至样品含水量小于3％，真空压塞。

[0038] 当然，上述操作也可以使用本领域周知的方法进行。

[0039] 表1不同组成的稳定剂(质量百分数，％)

[0040]

[0041] 黑曲霉定量质控菌的均匀性和稳定性检验：

[0042] 将上述冻干好的定量质控黑曲霉孢子置于2‑8℃的冰箱内储存。每个月随机抽取其中3瓶，每瓶涂布两个平板计数，其平均数为每个月的活菌数。

[0043] 按照GB/T15000.3‑2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》对实施例所制备的黑曲霉定量质控菌均匀性和稳定性进行检验，采用SPSS单因素方差分析验证数据是否有显著性差异。其中均匀性检验随机抽取10瓶样品进行计数，稳定性选取12个月检验数据进行检验，在95％的置信区间下，P值均>0.05，表明数据没有统计学差异，即所制备的质控菌均匀性和稳定性符合要求。

[0044] 不同组成稳定剂对黑曲霉孢子冻干及储存的影响

[0045] 采用不同组成稳定剂对黑曲霉孢子进行稳定保护。各稳定剂组成如表1所示。

[0046] 采用平板计数法，分别计算冻干前和冻干后西林瓶内孢子含量，并计算冻干存活率，其中冻干前孢子含量计算方法：吸取西林瓶内100uL孢子悬液，涂布至SDA琼脂培养基上，30℃下培养36h‑48h后进行计数；冻干后孢子含量计算方法：添加冻干前等体积的无菌生理盐水进行溶解并振荡均匀，吸取100uL菌悬液涂布于对应琼脂培养基上培养后进行计数。

[0047] 冻干存活率的计算公式为：

[0048]

[0049] 结果如表2所示：

[0050] 表2不同组成稳定剂中的黑曲霉孢子冻干存活率

[0051]

[0052] 由表2可看出，采用实施例的稳定剂，可使冻干存活率提高至80％以上，而采用组成B或组成C的稳定剂，冻干存活率也比采用组成D的稳定剂明显较高。

[0053] 不同组成稳定剂对黑曲霉孢子冻干储存的影响

[0054] 采用不同组成稳定剂对黑曲霉孢子进行稳定保护，各稳定剂组成如表1所示。为使对比试验初期的孢子数量接近，保持对比基础状态一致，根据表2测得的不同组成稳定剂中黑曲霉孢子的冻干存活率，用细胞计数仪对冻干前活菌数进行即时测定，按冻干存活率计算冻干前黑曲霉孢子的用量，并配制成冻干后含活菌数约为1000CFU/瓶的黑曲霉孢子产品。

[0055] 对使用不同稳定剂制备而成的黑曲霉孢子冻干产品进行长期储存(储存温度：2℃‑8℃，储存时间：12个月)，每月测定各冻干产品中孢子含量，各组成中黑曲霉孢子含量随时间的变化如图1所示。

[0056] 从图1可看出，使用组成A1(实施例1)和组成A2(实施例2)制备得到的黑曲霉孢子产品在12个月的储存期内，其孢子含量在1000CFU/瓶上下摆动，变化范围较小；而组成B‑D则在储存初期(第1‑3个月)孢子含量能保持在较高的水平，但在储存第4个月后，黑曲霉孢子含量开始显著下降。

[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。