一种单纯疱疹病毒及其用途

摘要

本发明涉及一种1型单纯疱疹病毒，其为保藏号为CCTCC NO：V201810的病毒株，及其减毒株或后代培养物。本发明还涉及包含该单纯疱疹病毒的组合物和由该单纯疱疹病毒侵染的宿主细胞。

权利要求

1.一种1型单纯疱疹病毒，其是保藏号为 CCTCC NO：V201810的病毒株。

2.一种1型单纯疱疹病毒，其是保藏号为CCTCC NO：V201810的病毒株的减毒株或后代培养物。

3.包含权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒的组合物。

4.权利要求3所述的组合物，其为病毒培养物。

5.由权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒侵染的宿主细胞。

6.包含权利要求5所述的宿主细胞的组合物。

7.权利要求6所述的组合物，其为细胞培养物。

说明书

一种单纯疱疹病毒及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种单纯疱疹病毒，具体是单纯疱疹病毒的非实验室病毒株。与实验室病毒株相比，本发明非实验室病毒株具有增强的溶瘤能力和/或基因传递能力。

背景技术

[0002] 单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）属于疱疹病毒科，是有包膜的双链DNA病毒，包括I型（HSV-1）和II型（HSV-2）两个亚型。

[0003] 单纯疱疹病毒由核心、衣壳、间层蛋白和囊膜四部分组成。病毒核心由浓厚的双链DNA构成，缠绕成纤丝卷轴。DNA外包围的衣壳呈二十面体结构，直径为100-110 nm，由162个壳粒组成。衣壳外由排列无规则、不定形的间层蛋白覆盖。病毒最外层是带短小突起的脂质双层囊膜，包裹囊膜的病毒直径为150-200 nm。病毒囊膜由11种糖蛋白和至少两种非糖基化蛋白质组成，包括病毒糖蛋白B（gB）、病毒糖蛋白C（gC）、病毒糖蛋白D（gD）、病毒糖蛋白G（gG）和病毒糖蛋白M（gM）等。病毒囊膜糖蛋白的立体结构对病毒的细胞侵染能力有关，其决定了病毒能否进入宿主细胞及进入宿主细胞的病毒量。

[0004] 目前，HSV-1病毒己经用于肿瘤、神经系统退行性疾病、遗传性疾病和免疫系统疾病等重大疾病的基因治疗，相比其它基因治疗病毒载体，HSV-1病毒具有众多优势。

[0005] 首先，HSV-1的基因组较大，可携带较大或多个外源基因。HSV-1基因组长达152 kb，而腺病毒基因组仅有35 kb。HSV-1基因组的80多个已知基因中，约半数在体外培养中为非必需基因，可以被多个外源性治疗基因所替换，它的最大外源基因插入量可以达到30-40kb。这对于治疗许多疾病，尤其是多个基因相关的疾病尤其重要。

[0006] HSV-1侵染力强，溶瘤谱广，溶瘤效率高。HSV-1为有包膜病毒，具有高度感染性，侵染细胞的能力明显强于无包膜的腺病毒。HSV-1溶瘤谱广，可侵染广泛种类的肿瘤细胞。HSV-1复制周期短，溶瘤速度快，通常在12小时内完成一个复制周期。HSV-1转染的肿瘤细胞溶解后，可以释放数千个子代病毒体，这些病毒可以继续转染其它的肿瘤细胞。用Vero细胞系比较测定HSV-1与腺病毒的溶瘤活性，发现HSV-1的溶瘤活性比腺病毒高近10倍[Kasuya H,Takeda S, Nomoto S, et al.The potential of oncolytic virus therapy for pancreatic cancer.[J]. Cancer Gene Therapy, 2005, 12(9):725-36]。腺病毒载体临床人体用量为109-1012 pfu，而HSV-1载体临床人体用量为105-108 pfu，比腺病毒人体用量小1000倍。HSV-1除了通过细胞间隙扩展外，还可以通过细胞连接直接从一个细胞扩展到另一个细胞。这使得溶瘤病毒在实体瘤内既可有效渗透，同时几乎不伴有全身传播[Shen Y, Nemunaitis J. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) for cancer treatment[J]. Cancer Gene Therapy, 2006, 13(11):975-992]。

[0007] HSV-1与细胞DNA不整合，复制可控制，安全性高。HSV-1在有免疫能力的成人几乎不产生威胁生命的疾病。HSV-1的许多非必需基因与其神经毒性有关。去掉HSV-1中某些非必需基因，如ICP34.5基因，使HSV-1只选择性在肿瘤细胞内复制，正常组织细胞不受其影响[Chou J,Kern E,Whitley R,et  al.Mapping  of  herpes  simplex virus-1 neurovirulence to gamma 34.5, a gene nonessential for growth in culture[J]. Science, 1990, 250(4985):1262-1266]。

[0008] 基于以上众多优点，HSV-1已成为现今基因治疗应用最广泛的病毒载体之一。 在基因治疗研究中，HSV-1通常是通过基因改造的手段被改造成为溶瘤型I型单纯疱疹病毒(Oncolytic herpes simplex virus type 1，oHSV-1)，主要方法包括删除某些基因和插入肿瘤治疗相关基因等。目前已有多种oHSV-1进行了临床前及临床试验研究，大量结果显示其具有良好的安全性和有效性。

[0009] 基因缺失的oHSV-1构建的一般策略为突变或缺失病毒的单个或多个基因以实现其对肿瘤的特异性杀伤作用，如ICP34.5、ICP6、ICP0、TK和UNG等基因。目前已经上市和进入临床试验的Talimogene laherparepvec、HSV1716、NV1020、G207、G47Δ等都删除了HSV-1中的ICP34.5基因。溶瘤病毒HSV1716仅删除了双拷贝的ICP34.5基因，在针对难治或复发的高级别脑胶质瘤治疗的临床试验中显示肿瘤消退并且没有发现明显的毒性或副作用。G207在删除双拷贝ICP34.5基因的同时使ICP6基因突变，在针对复发和进展的恶性胶质瘤治疗的临床试验中显示，在瘤内注射109pfu的G207后未出现严重不良反应，具有良好的安全性[Markert JM, Liechty PG, Wang W, et al. Phase Ib trial of mutant herpes simplex virus G207 inoculated pre-andpost-tumor resection for recurrent GBM[J]. Molecular Therapy, 2009, 17(1):199-207]。 Talimogene laherparepvec是美国第一个批准上市的溶瘤病毒，其删除了HSV-1的ICP34.5和ICP47基因，Ⅲ期临床试验数据显示在恶性黑色素瘤治疗上客观缓解率为26.4%，具有较为显著的治疗效果和良好的安全性[Andtbacka R H I  , Kaufman H L  , Collichio F  , et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma[J]. Journal of Clinical Oncology, 2015, 33(25):2780-2788]。这些临床数据表明HSV-1在肿瘤的基因治疗具有良好安全性和巨大潜力。

[0010] 由于单纯疱疹病毒良好的复制能力和安全性，在肿瘤治疗中受到广泛重视。但目前使用的大多数用于基因传递/治疗或者用于溶瘤作用治疗肿瘤的单纯疱疹病毒是已经在组织培养细胞内传代多年的实验室病毒株。这些病毒虽然可以进入细胞传递基因，但是在溶瘤能力和基因传递效率等治疗所需特性方面有待改进。

发明内容

[0011] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种新的HSV分离株，相对先前一直使用的连续传代的标准模式株HSV-1病毒17株（简称17病毒株或17株），本发明的HSV-1病毒株体内感染人细胞的能力大大改进、细胞内复制/裂解的能力显著增强，适于作为溶瘤病毒或作为载体通过溶瘤作用破坏肿瘤细胞。

[0012] 与标准模式株HSV-1病毒17株相比，本发明提供的新的HSV-1分离株(简称毒株HL-1、HL-1株或HL-1) 增强了在人肿瘤细胞系内的复制。在缺失ICP34.5和/或ICP47的情况下，毒株HL-1与其中也缺失ICP34.5和/或ICP47的HSV-1病毒17株相比，在人肿瘤细胞系内的复制能力、对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强。

[0013] 将本发明的经修饰的HL-1病毒随后用来传递具有抗肿瘤活性的基因，证明可进一步增强抗肿瘤免疫应答活性和溶瘤效果。

[0014] 因此本发明提供

[0015] 1. 一种1型单纯疱疹病毒（HSV-1），其具有选自如下的一种或多种特性：

[0016] （a）与参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力；

[0017] （b）与参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力；

[0018] （c）与参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力；

[0019] （d）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力；

[0020] （e）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力；和

[0021] （f）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力，

[0022] 其中，所述参比实验室毒株为标准模式株HSV-1病毒17株。

[0023] 2. 项1的1型单纯疱疹病毒，其CCTCC保藏号为：V201810（CCTCC NO：V201810）。

[0024] 3. 项1的单纯疱疹病毒，其为CCTCC保藏号为V201810（CCTCC NO：V201810）的单纯疱疹病毒的减毒修饰变体。

[0025] 4. 项3的单纯疱疹病毒，其中所述单纯疱疹病毒中功能性ICP34.5编码基因、功能性ICP6编码基因、功能性ICP0基因、功能性ICP47基因、功能性US3基因、功能性UL56基因、功能性VP16基因、功能性VHS基因、功能性UNG基因、功能性糖蛋白H编码基因、功能性胸苷激酶编码基因中的一个或多个被破坏或删除。

[0026] 5. 项1的单纯疱疹病毒，其为CCTCC保藏号为V201810（CCTCC NO：V201810）的后代培养物。

[0027] 6. 包含项1-5的单纯疱疹病毒的组合物。

[0028] 7. 项6的组合物，其为病毒培养物。

[0029] 8. 由项1-5任一项的单纯疱疹病毒侵染的宿主细胞。

[0030] 9. 包含项8的宿主细胞的组合物。

[0031] 10. 项9的组合物，其为细胞培养物。

[0032] 11. 一种制备1型单纯疱疹病毒（HSV-1）的方法，包括

[0033] 1）临床采集单纯疱疹病毒株；

[0034] 2）筛选具有选自如下的一种或多种特性的病毒株：

[0035] （a）与参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力；

[0036] （b）与参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力；

[0037] （c）与参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力；

[0038] （d）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力；

[0039] （e）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力；和

[0040] （f）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力，

[0041] 其中，所述参比实验室毒株为标准模式株HSV-1病毒17株。

[0042] 12. 项11的制备1型单纯疱疹病毒（HSV-1）的方法，包括

[0043] 1）临床采集单纯疱疹病毒株；

[0044] 2）筛选具有如下特性的病毒株：

[0045] （a）与参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力；

[0046] （b）与参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力；和

[0047] （c）与参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力。

[0048] 13. 通过项11或12的制备方法获得的1型单纯疱疹病毒（HSV-1）。

附图说明

[0049] 图1：HL-1株病毒25000倍电镜图。

[0050] 图2：HL-1和HSV（17）不同MOI转染HepG2细胞。

[0051] 图3：HL-1和HSV（17）不同MOI转染A375细胞。

[0052] 图4：HL-1和HSV（17）不同MOI转染A549细胞。

[0053] 图5：HL-1和HSV（17）不同MOI转染MCF-7细胞。

[0054] 图6：HL-1和HSV（17）不同MOI转染Hela细胞。

[0055] 图7：HL-1和HSV（17）不同MOI转染U251细胞。

[0056] 图8：HL-1和HSV（17）不同MOI转染Vero细胞。

[0057] 图9：HL-1和HSV（17）分别转染不同细胞的IC50比较。

[0058] 图10：敲除ICP34.5和ICP47基因的CCTCC NO：V201810病毒株和对照病毒17病毒株转染不同细胞的IC50测定结果。

[0059] 图11：表达IL-12外源基因的CCTCC NO：V201810病毒株和对照病毒17病毒株转染肿瘤细胞的IC50测定结果。

[0060] 图12：插入IL-12基因和PD1单抗基因后HL-1病毒株重组病毒和17病毒株重组病毒转染肿瘤细胞的IC50测定结果。

具体实施方式

[0061] 本申请涉及一种与实验室模式病毒株相比性能改善的溶瘤病毒。

[0062] 本申请所述“溶瘤病毒”是指一类感染和杀死癌细胞的病毒，该病毒感染癌细胞后通过溶瘤作用破坏受感染的癌细胞，同时释放出新的感染性病毒颗粒或病毒体，破坏剩余的癌细胞。此类病毒因其溶瘤作用而得名。

[0063] “单纯疱疹病毒（HSV）”因其研究基础深厚并且在其天然状态下相对无害，因此是最先选择用于选择性攻击癌细胞的病毒（溶瘤病毒）之一。当本发明的病毒为单纯疱疹病毒时，所述病毒可以来源于例如 HSV-1毒株或HSV-2毒株或者它们的衍生毒株，优选是HSV-1。

[0064] 本申请一些实施方案涉及CCTCC保藏号为：V201810（CCTCC NO：V201810）的病毒株。在本申请中，该病毒株称为HSV-1病毒HL-1毒株、或简称HL-1株、HL-1或HL1。

[0065] 本申请一些实施方案涉及HSV-1毒株的衍生毒株，例如与CCTCC保藏号为：V201810（CCTCC NO：V201810）的病毒株基因组序列同源性为至少70%，更优选至少80%、85%、90%、95%、98%序列同源性的病毒株。

[0066] “单纯疱疹病毒载体”指携带外源基因的单纯疱疹病毒。

[0067] 空斑形成单位（plaque forming unit），缩写pfu，指在单层培养的动物细胞上形成空斑(噬斑)对应的病毒数。

[0068] “免疫检查点阻断（抑制）性抗体”或“免疫检查点阻断（抑制）性单克隆抗体”指抑制或阻断抑制性免疫检查点分子的单克隆抗体。“免疫检查点刺激（激动）性抗体”或“免疫检查点刺激（激动）性单克隆抗体”指刺激或激动刺激性免疫检查点分子的单克隆抗体。免疫检查点是免疫系统的监管者，它们的作用体现在增强免疫系统的清除异己能力或者阻止免疫系统不加选择地攻击细胞，从而对免疫调节至关重要。免疫检查点分抑制性检查点分子和刺激性检查点分子。抑制性检查点分子包括但不限于：A2AR、B7-H3（CD276)、B7-H4、BTLA（CD272)、CTLA-4（CD152)、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD1、TIM3、VISTA、CD47；刺激性检查点分子包括但不限于：CD27、CD40、OX40、GITR、CD137、CD28、ICOS。抑制性检查点分子和刺激性检查点分子是癌症免疫疗法的靶标，因为它们可能用于多种类型的癌症。

[0069] 本申请筛选的单纯疱疹病毒野生株HL-1及其经修饰的毒株

[0070] 本申请在第一方面涉及一种单纯疱疹病毒， 该单纯疱疹病毒为保藏号为CCTCC NO：V201810的1型单纯疱疹病毒（HSV-1）。在一些实施方案中，本申请涉及保藏号为CCTCC NO：V201810的1型单纯疱疹病毒的减毒变体。

[0071] 在一些实施方案中，本申请涉及1型单纯疱疹病毒（HSV-1），该单纯疱疹病毒具有选自如下的一种或多种特性：

[0072] （a）与参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力，

[0073] （b）与参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力，

[0074] （c）与参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力；

[0075] （d）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的感染肿瘤细胞能力，

[0076] （e）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的肿瘤细胞内复制能力，和

[0077] （f）该单纯疱疹病毒经修饰后，与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，具有增强的杀伤肿瘤细胞能力。

[0078] 本发明病毒株是“非实验室”毒株，可以被称为“临床”毒株。本领域技术人员能够容易地将实验室毒株和非实验室毒株或临床毒株区分开来。实验室毒株和非实验室毒株之间的关键区别在于目前常用的实验室毒株已经在培养物中保持了相当长时间。为了使病毒生长和保持，用病毒感染合适的细胞，病毒在细胞内复制，然后收获病毒；然后重新感染新鲜细胞。该过程构成连续传代的一个周期。就HSV而论，每个这样的周期可能需要例如几天，这种连续传代可能导致病毒株特性的改变，例如发生有利于在培养物中生长的特性(例如快速复制)的选择，而不是选择与有利于实际应用的特性。

[0079] 本发明病毒株是非实验室毒株，因为它们来源于从受感染个体中最新分离的毒株。本发明毒株经过修饰，消除了毒性但基本上保留了它们所来源的原始临床分离株的理想特性。

[0080] 本发明的病毒能够有效感染人类靶细胞。这样的病毒刚从受感染个体中分离，然后根据与标准实验室毒株相比增强在体外和/或体内在肿瘤细胞和/或其它细胞内复制的所需能力进行筛选。与实验室病毒株相比，具有改进特性的这类病毒是本发明的病毒。然后可以对具有这种所需改进特性、经鉴定的病毒通过合适基因的突变进行工程改造，使它们可以选择性地杀伤肿瘤细胞，或者将其突变，使它们可以在非溶瘤性应用中将基因传递至靶组织而没有毒性效应。这些经修饰的病毒也是本发明的病毒。

[0081] 本发明病毒与具有等同修饰的参比实验室毒株相比，本发明的病毒株比具有等同修饰的参比实验室毒株感染任何肿瘤细胞或在其中复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力强。优选这种更强的能力是具统计学显著性的更强的能力。例如，按照本发明，就待测特性而论，本发明的病毒株的能力可以是所述参比毒株的能力的至多1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、50倍或100倍。

[0082] 本发明的病毒基本上具有(即保留)其未经修饰的临床前体毒株的能力。例如，就计划用来治疗肿瘤的溶瘤病毒而论，本发明的病毒株优选基本上具有其未经修饰的临床前体毒株感染任何肿瘤细胞或在其中复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力。

[0083] 本申请涵盖经修饰的病毒，其中改变的病毒区域或者可以被消除(完全或部分)或者成为无功能的、或者被其它序列取代、尤其是被异源基因序列取代。可以使一种或多种基因成为无功能基因，并且可以插入一种或多种异源基因。

[0084] 在一些实施方案中，本申请的病毒是经修饰的非实验室溶瘤病毒。这些病毒可用于溶瘤法治疗癌症。这类病毒感染肿瘤细胞并在所述肿瘤细胞内复制，随后杀伤所述肿瘤细胞。因此，这类病毒是具有复制能力的病毒。最好是它们选择性在肿瘤细胞内具有复制能力。这意味着它们在肿瘤细胞内复制而在非肿瘤细胞内不复制，或者它们在肿瘤细胞内比在非肿瘤细胞内更为有效地复制。选择性复制能力的测定可以通过本文所述用测定复制能力和肿瘤细胞杀伤能力的试验来进行。

[0085] 优选本发明的溶瘤病毒比具有相同修饰的参比实验室毒株感染肿瘤细胞或在肿瘤细胞内复制、杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力强（优选具有统计学显著性）。

[0086] 病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过测量感染一定百分比细胞(例如50%或80%细胞)所需的病毒剂量进行定量。在肿瘤细胞内复制的能力可以通过测定病毒在细胞中的生长来确定，例如通过测量在6小时、12小时、24小时、36小时、48小时或72小时或更长时间的时间周期内在细胞内的病毒生长。病毒杀伤肿瘤细胞的能力可以通过对在规定时间内对于给定细胞类型在给定时间点和MOI(multiplicity of infection)下保留的活细胞数进行计数来定量。可以使用本申请实施例中的细胞或细胞组合，也可以使用其它肿瘤细胞类型。为了对在给定时间点保留的活细胞数进行计数，可以对排除锥虫蓝的细胞(即活细胞)的数目进行计数。也可用流式细胞计数(FACS)、MTT、CCK-8或CTG方法分析进行定量测定。也可以体内测定肿瘤细胞杀伤能力，例如通过测量由于特定病毒引起的肿瘤体积的减小。

[0087] 为了测定本发明病毒的特性，一般而言，最好使用标准实验室参比毒株进行比较。可以使用任何合适的标准实验室参比毒株。就HSV而论，最好使用HSV-1毒株17、HSV-1毒株F或HSV-1毒株KOS中的一种或多种。所述参比毒株通常具有与本发明待测毒株等同的修饰，例如基因缺失和/或异源基因插入。例如，就HSV毒株而论，如果在本发明的病毒中已经使ICP34.5、ICP6和/或胸苷激酶(TK)编码基因变成无功能的，则在参比毒株中也使它们变成无功能的。

[0088] 在本申请实施例中，参比毒株为实验室标准模式株HSV-1病毒17株，或称HSV-1病毒17株、HSV（17）、17病毒株、17株。

[0089] 本申请涉及在2019年7月30日，在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（地址：中国、武汉、武汉大学）、用于专利程序保藏的人疱疹病毒I型HL-1株、保藏号为CCTCC  NO：V201810。

[0090] 在本申请中，疱疹病毒I型（1型）、I型（1型）疱疹病毒、单纯疱疹病毒I型（1型）、I型（1型）单纯疱疹病毒、HSV-1含义相同，可互换使用。人疱疹病毒I型HL-1株在本申请中可以简写为HL-1株、HL1株、HL-1或HL1。

[0091] 单纯疱疹病毒(HSV)既可用作神经系统和其它系统中的基因传递载体，又可用于溶瘤法治疗癌症。然而，在这两种应用中，必须使病毒成为缺陷型的，使它不再具有致病性，但是使它仍能进入细胞并执行所需功能。

[0092] HSV-1基因组具有许多可以删除或突变的基因赋予安全性和/或肿瘤靶向特异性。例如，将癌细胞与大部分正常细胞（有丝分裂后）相区别的普遍特征之一是癌细胞的持续增殖并因此维持足够的核苷酸用于DNA复制。HSV-1包含涉及核苷酸代谢的相关基因（胸苷激酶，核糖核苷酸还原酶和尿嘧啶DNA糖基化酶等）允许病毒在缺乏足够的核苷酸的非分裂细胞中复制。将这些基因进行删除或突变可以赋予病毒对分裂细胞（肿瘤细胞）的特异性，并且也经常减弱病毒的致病性。此外，细胞中具有多种机制检测和失活入侵的病毒，病毒的部分基因（ICP34.5、ICP0和UL56等）可以逃避或者阻断细胞的抗病毒机制，该部分基因的删除或突变同样可以赋予病毒对分裂细胞（肿瘤细胞）的特异性。

[0093] 在一些实施方案中，对本发明HSV毒株进行修饰，使其缺失功能性ICP34.5编码基因、功能性ICP6编码基因、功能性糖蛋白H编码基因、功能性胸苷激酶编码基因中的一个或多个。在一些实施方案中，所述病毒缺失功能性ICP34.5编码基因。在一些实施方案中，可以对所述病毒进行进一步修饰，使其缺失功能性ICP47基因。在一些实施方案中，突变ICP34.5、ICP47、Us3、ICP0、UL56基因中的一个或多个，制备溶瘤型I型单纯疱疹病毒 (Oncolytic herpes simplex virus type 1，oHSV-1)。

[0094] 对于溶瘤法治疗癌症(该疗法也可以包括传递增强所述治疗效应的基因)，已经鉴定出HSV的许多突变（Peters C  . Designing Herpes Viruses as Oncolytics. Molecular Therapy Oncolytics, 2015.），HSV的这些突变仍允许病毒在培养物或在体内活跃分裂的细胞内(例如肿瘤内)复制，但是阻止其在正常组织内的有效复制。这样的突变包括破坏ICP34.5、ICP6和胸苷激酶的编码基因。迄今为止，在这些突变病毒中，具有ICP34.5突变或者ICP34.5突变以及例如ICP6突变的病毒已经显示最为有利的安全性。已经显示仅缺失ICP34.5的病毒在体外许多肿瘤细胞类型中复制并且在小鼠脑肿瘤内选择性复制，而不伤害周围组织。

[0095] 提供溶瘤特性(即与周围组织相比在肿瘤内选择性复制)的任何其它基因缺失/突变的病毒也是本申请涵盖的病毒。

[0096] 可用本领域已知的技术和/或本文描述的技术，将异源基因插入到本发明的这类病毒中，例如CCTCC保藏号为V201810（CCTCC NO：V201810）的病毒中。在溶瘤病毒中，所述异源基因通常是增强所述病毒对抗肿瘤的能力的基因。因此可以插入赋予病毒抗肿瘤特性的任何基因。具体地说，所述异源基因可以是能够以有益方式改进针对肿瘤细胞的免疫应答的基因，尤其是免疫刺激多肽。

[0097] 本申请HL-1病毒的药物组合物、制品及其用途

[0098] 本发明的溶瘤病毒可以用于制备用于治疗癌症的药品。具体地说，本发明的溶瘤病毒制剂可以用于癌症的治疗中，例如通过直接肿瘤内注射。本发明的溶瘤病毒制剂可以用来治疗哺乳动物、优选人体内的任何实体瘤。例如，可以将本发明的病毒给予患有以下疾病的受试者：肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、肉瘤、肺癌、结直肠癌、头颈部肿瘤、乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、淋巴瘤、胰腺癌和膀胱癌。

[0099] 在一些实施方案中，本申请涉及重组溶瘤病毒或称为经修饰的溶瘤病毒，其特征在于，该重组溶瘤病毒或经修饰的溶瘤病毒来源于CCTCC保藏号为：V201810（CCTCC NO：V201810）的1型单纯疱疹病毒，其中对该CCTCC NO：V201810病毒进行基因改造，使其功能性ICP34.5编码基因、功能性ICP6编码基因、功能性ICP0基因、功能性ICP47基因、功能性US3基因、功能性UL56基因、功能性VP16基因、功能性VHS基因、功能性UNG基因、功能性糖蛋白H编码基因、功能性胸苷激酶编码基因中的一个或多个被删除，从而在上述一处或多处基因删除的位置插入外源基因，例如编码刺激免疫应答的细胞因子多肽或能够促进免疫应答的抗体多肽，例如刺激免疫应答的细胞因子多肽是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、IL-
2，IL12，IFN-γ或TNFa，能够促进免疫应答的抗体多肽为免疫检查点抗体。

[0100] 本发明的重组溶瘤病毒或称为经修饰的溶瘤病毒可以用于制备用于治疗癌症的药品。具体地说，本发明的溶瘤病毒制剂可以用于癌症的治疗中，例如通过直接肿瘤内注射。本发明的溶瘤病毒制剂可以用来治疗哺乳动物、优选人体内的任何实体瘤。例如，可以将本发明的病毒给予患有以下疾病的受试者：肝癌、黑色素瘤、脑胶质瘤、肉瘤、肺癌、结直肠癌、头颈部肿瘤、乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、淋巴瘤、胰腺癌和膀胱癌。

[0101] 本申请的一些实施方案涉及包含本申请的病毒和药学上可接受的载体或稀释剂药物组合物。合适的载体和稀释剂是本领域已知的，包括但不限于磷酸缓冲盐溶液。

[0102] 在一些实施方案中，本申请涉及制品或试剂盒，包含内装有前述药物组合物的小瓶和包装插页，所述包装插页包括如何使用该制品或试剂盒治疗疾病的使用说明书。

[0103] 可以将所述本申请的药物组合物直接注射到靶组织中，例如癌症组织中，进行溶瘤法治疗和/或将基因传递至细胞内以实现治疗目的。本申请包含病毒或重组病毒的药物组合物给予的病毒剂量范围为10^4-10^12pfu/ml、优选10^5-10^8pfu/ml、更优选10^6-10^8pfu/ml。对于溶瘤法治疗或非溶瘤法治疗，当注射时，基本上由所述病毒和一种药学上可接受的合适载体或稀释剂组成的药用组合物的注射用量通常至多10ml、通常1-5ml、优选1-
3ml。然而，对于某些溶瘤法治疗应用，根据所述肿瘤和接种部位，也可以使用高于10ml的较大体积。

[0104] 本领域技术人员根据受试者和疾病情况能够容易地确定最佳给药途径和剂量。所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症、疾病或病症的严重程度以及给药途径来确定。对于癌症患者优选的给药途径是直接注射到肿瘤内。也可以系统给予所述病毒，例如静脉注射，或通过注射将所述病毒给予给所述肿瘤供血的血管内。最适给药途径将取决于所述肿瘤的位置和大小。所述剂量可以根据各种参数、尤其是根据肿瘤的位置、肿瘤的大小、待治疗患者的年龄、体重和病症以及给药途径来确定。实施例

[0105] 实施例1 溶瘤效果的HL-1株病毒的获得

[0106] a)病毒的采集

[0107] 招募63位患有复发性唇疱疹的健康志愿者，对疱疹液进行无菌采集。

[0108] b) 病毒的筛选

[0109] 本部分的目的是测试和筛选HSV-1初级临床分离株，选择溶瘤能力最强的病毒株。

[0110] 每次使用5至8个病毒株同时进行实验。以HSV-1病毒17株为对照，将病毒株以相同的MOI感染六孔板中的细胞，平行试验，并在感染48小时之后观察病毒引起的CPE(cytopathic effect)现象并评价结晶紫染色后的空斑数量。CPE应为典型HSV-1感染引起，细胞变圆并由感染中心往外逐步脱落形成空斑。对CPE现象明显且染色后空斑数量高的病毒株进行评估。

[0111] 经过如此方法评价并筛选出具有最佳溶瘤效果的病毒株为HL-1株。

[0112] c) HL-1病毒株的生物学特性分析

[0113] 1）电镜观察

[0114] HL-1株病毒感染细胞后去除细胞碎片，在25000倍电镜下观察。图中显示病毒呈典型HSV-1外形，可观察到基因组DNA、衣壳、间层蛋白和囊膜四个组分（参见图1）。

[0115] 2）HL-1病毒株基因组DNA测序结果分析

[0116] 将 I 型单纯疱疹病毒（HSV-1）HL-1 株基因组 DNA 交由上海欧易生物进行三代测序分析，比对HL-1株与标准模式株HSV-1病毒17株（NC_001806.2）的病毒基因组序列，结果显示两者的基因组序列存在 1700 多个碱基的差异，多个重要编码基因包括膜蛋白和立早基因等的氨基酸序列都存在较大差异，比对结果参见下表 1 和表 2。

[0117] 表 1 HL-1株与17株膜蛋白氨基酸序列比对结果

[0118]

[0119] 表 2 HL-1株与17株病毒重要基因的氨基酸序列比对结果

[0120]

[0121] HL-1株与17株的包膜蛋白中gD、gG、gI、gJ、gL、gM和gN氨基酸序列差异超过1%，尤其是gG和gI的氨基酸序列差异超过3%，其中gG达到5.46%。单纯疱疹病毒包膜的膜蛋白与病毒侵入、释放、细胞间的直接传播有关，提示HL-1株与17株的侵染性差异。

[0122] 对比立早基因ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47以及重要基因ICP6、ICP34.5的氨基酸序列发现，HL-1株与17株的立早基因ICP4、ICP22和ICP47序列差异较大，氨基酸序列差异均超过1%。ICP4和ICP22作为HSV-1的立早基因，可以刺激病毒早期基因的表达和DNA合成，诱导晚期基因的表达，是HSV-1基因表达从而引发感染的关键因子。ICP34.5也是HL-1株和17株基因中差异较大的一个基因，其氨基酸差异达到6.25%。ICP34.5是HSV-1病毒重要的神经毒性因子，对病毒的复制和致病性起到了关键作用。

[0123] d) HL-1病毒株的保藏

[0124] 将HL-1病毒株保藏于中国典型培养物保藏中心，名称为“人疱疹病毒I型HL-1株”，保藏编号为CCTCC NO：V201810。

[0125] 实施例2 HL-1野生株和17株溶瘤效果的对比

[0126] 本实施例提供HL-1和17株在不同细胞上的复制对比实验和结果以及它们转染肿瘤细胞的能力。实验细胞包括：Hep G2人肝癌细胞、A375人皮肤癌细胞、A549人肺癌细胞、MCF7 人乳腺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞、U251人胶质瘤细胞、Vero猴肾细胞。

[0127] 实验方法如下：

[0128] 1．HL-1和HSV（17）分别转染不同细胞后镜检观察

[0129] 取处于对数生长期的上述细胞，消化后传代至六孔板中培养。24小时后弃去旧培养基，每孔加入培养基2ml。按照不同MOI数量的病毒进行转染，加入病毒后放入37℃二氧化碳培养箱培养48小时后取出镜下观察，拍照记录。

[0130] 2．HL-1和HSV（17）分别转染不同细胞的IC50测定

[0131] 取处于对数生长期的细胞，消化后传代至96孔板中。24小时后弃去旧培养基，分别加入9个稀释度的HL-1和HSV（17）病毒，100μl/孔，使得MOI为20、5、1.25、0.3125、0.0781、0.0195、0.0049、0.0012和0.0003，设空白对照。37℃培养3天后弃去孔内所有液体，加入10% CCK-8试剂（Cell Counting Kit-8、Dojindo），100μl/孔，37℃孵育1-2 h，在450 nm处测定样品OD值，根据拟合曲线计算IC50。

[0132] 实验结果：

[0133] 1．HL-1和HSV（17）分别转染不同细胞后镜检观察

[0134] 1.1 HL-1和HSV（17）转染HepG2细胞镜检结果

[0135] HL-1和HSV（17）转染HepG2细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，在各相同的MOI条件下，HL-1的转染效率都高于HSV（17）的转染效率（参见图2）。

[0136] 1.2 HL-1和HSV（17）转染A375细胞镜检结果

[0137] HL-1和HSV（17）转染A375细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，在各相同的MOI条件下，HL-1的转染效率都明显高于HSV（17）。甚至可在镜下观察到在转染病毒MOI 0.1的条件下，HL-1转染的细胞形态已经全部变圆，而在HSV（17）转染的细胞中仍可见正常细胞（参见图3）。

[0138] 1.3 HL-1和HSV（17）转染A549细胞镜检结果

[0139] HL-1和HSV（17）转染A549细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，在各相同的MOI条件下，HL-1的转染效率都明显高于HSV（17）。可在镜下观察到HL-1转染的细胞数量明显多于HSV（17）转染的细胞数量，在MOI 0.1时几乎没有观察到正常细胞，而HSV（17）转染的细胞中仍可见正常细胞，且数量随着MOI的减少而递增（参见图4）。

[0140] 1.4 HL-1和HSV（17）转染MCF-7细胞镜检结果

[0141] 根据以上实验中病毒转染细胞效果对比的经验，对于之后的实验只选取了MOI 0.1和MOI 0.01两个病毒浓度进行比较。

[0142] HL-1和HSV（17）转染MCF-7细胞48小时后显微镜下观察的结果显示HL-1的转染效率明显高于HSV（17）。HL-1转染的MCF-7细胞在MOI 0.1的情况下细胞形态全部变圆，而HSV（17）转染的MCF-7细胞仍有部分正常细胞（参见图5）。

[0143] 1.5 HL-1和HSV（17）转染Hela细胞镜检结果

[0144] HL-1和HSV（17）转染Hela细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，在MOI 0.1条件下，HL-1的转染效率都明显高于HSV（17）。HL-1转染的Hela细胞在MOI 0.1的情况下细胞形态大部分变圆，而HSV（17）转染的Hela细胞仍有一定数量的正常细胞（参见图6）。

[0145] 1.6 HL-1和HSV（17）转染U251细胞镜检结果

[0146] HL-1和HSV（17）转染U251细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，HL-1的转染效率明显高于HSV（17）。HL-1转染的U251细胞在MOI 0.01的情况下细胞形态大部分变圆，而HSV（17）转染的U251细胞只有很少细胞被病毒转染形态变圆（参见图7）。

[0147] 1.7 HL-1和HSV（17）转染Vero细胞镜检结果

[0148] Vero细胞非肿瘤细胞，为HSV病毒的敏感细胞系，是常用的生产细胞之一，故比较HL-1和HSV（17）对Vero细胞的侵染情况对于生产产能来说具有重要意义。

[0149] HL-1和HSV（17）转染Vero细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，在MOI 0.1和0.01的条件下，HL-1的转染效率都明显高于HSV（17）。HL-1转染的Vero细胞在病毒MOI 0.1的情况下细胞形态全部变圆，而HSV（17）转染的Vero细胞在MOI 0.1的情况下仍有部分正常细胞（参见图8）。

[0150] 2. HL-1和HSV（17）分别转染不同细胞的IC50测定

[0151] HL-1和HSV（17）分别转染不同细胞的IC50比较参见图9。图中结果显示HL-1相比HSV（17）的IC50（MOI）均要小，表明HL-1针对细胞的杀伤能力强于HSV（17）。

[0152] 本实施例旨在比较HL-1和HSV（17）两种病毒株转染肿瘤细胞能力的差异。HL-1和HSV（17）转染不同的肿瘤细胞（HepG2、A375、A549、MCF-7、Hela和U251）以及正常传代细胞Vero细胞，在转染细胞48小时后显微镜下观察的结果显示，尽管各类细胞对病毒的敏感性不同，但在相同的MOI下HL-1的转染效率明显高于HSV（17）的转染效率。进一步通过CCK-8法测定HL-1和HSV（17）转染不同细胞的IC50值，结果显示HL-1转染细胞的IC50值均比HSV（17）小。综上所述，相比HSV（17）病毒株，HL-1病毒株在细胞中具有更好的侵染效率和复制能力，溶瘤效果强，作为溶瘤病毒具有更好的应用前景。

[0153] 实施例3 HSV（HL-1）重组病毒和HSV（17）重组病毒溶瘤效果对比

[0154] 通过基因工程方法将本发明CCTCC保藏号为V201810（CCTCC：201810）的病毒株和对照病毒17病毒株的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，比较基因敲除后的重组病毒HL1-△34.5-△47和17-△34.5-△47转染肿瘤细胞能力差异。实验细胞包括Hep G2人肝癌细胞、A375人皮肤癌细胞、A549人肺癌细胞、MCF7 人乳腺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞、U251人胶质瘤细胞、Vero猴肾细胞。

[0155] 取处于对数生长期的细胞，消化后传代至96孔板中。24小时后弃去旧培养基，分别加入9个稀释度的不同病毒，100μl/孔，使得MOI为20、5、1.25、0.3125、0.0781、0.0195、0.0049、0.0012和0.0003，设空白对照。37℃培养3天后弃去孔内所有液体，加入10% CCK-8试剂，100μl/孔，37℃孵育1-2 h，在450 nm处测定样品OD值，根据拟合曲线计算IC50值。

[0156] 两种重组病毒分别转染不同细胞的IC50比较结果参见图10。实验结果显示HL1-△34.5-△47转染细胞的IC50值均比17-△34.5-△47小，表明HL-1病毒株经过基因重组改构后，相比HSV（17）病毒株重组病毒在细胞中具有更好的侵染效率和复制能力，溶瘤效果强，作为溶瘤病毒具有更好的应用前景。

[0157] 实施例4 HL-1病毒株作为载体携带外源基因对肿瘤细胞的溶瘤作用

[0158] 本实施例旨在比较HL-1重组病毒和17病毒株重组病毒携带外源基因的溶瘤作用。实验细胞包括A375人皮肤癌细胞、A549人肺癌细胞、AGS 人胃癌细胞、AsPC-1 人胰腺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞、Hep G2 人肝癌细胞、HT-29 人大肠结直肠癌细胞、MCF7 人乳腺癌细胞、PC-3 人前列腺癌细胞、T24 人膀胱癌细胞、U-2 OS 人骨癌细胞和U-87 人脑胶质瘤细胞。

[0159] 表达IL-12外源基因的溶瘤病毒的溶瘤作用比较

[0160] 通过基因工程方法将本发明CCTCC保藏号为V201810（CCTCC NO：V201810）的病毒株和对照病毒17病毒株的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，并在敲除ICP34.5基因的位置插入人工化学合成的外源基因。该外源基因从5’端至3’端依次包括：EF1α启动子、编码IL-12的基因（Gene ID：16159,16160）和TK PolyA。在北京擎科新业公司测序鉴定上述编码基因正确插入到单纯疱疹病毒载体中。构建成功的重组病毒载体与上述细胞株，在37℃、5%CO2条件下增殖。

[0161] 取处于对数生长期的细胞，消化后传代至96孔板中。24小时后弃去旧培养基，分别加入9个稀释度的不同病毒，100μl/孔，使得MOI为20、5、1.25、0.3125、0.0781、0.0195、0.0049、0.0012和0.0003，设空白对照。37℃培养3天后弃去孔内所有液体，加入10% CCK-8试剂，100μl/孔，37℃孵育1-2 h，在450 nm处测定样品OD值，根据拟合曲线计算IC50值。

[0162] 不同病毒转染肿瘤细胞的IC50测定结果参见图11。实验结果显示了插入IL-12基因后HL-1重组病毒（HL1-IL12）和17株重组病毒（17-IL12）转染肿瘤细胞能力的差异，插入IL-12基因的HL-1重组病毒相比插入IL-12基因的17株重组病毒转染肿瘤细胞的IC50值均要小，表明插入IL-12基因的HL-1病毒株重组病毒在肿瘤细胞中具有更好的侵染效率和复制能力，溶瘤效果强，作为溶瘤病毒具有更好的应用前景。

[0163] 导入外源基因IL-12的溶瘤病毒对黑色素瘤小鼠的溶瘤作用

[0164] 按照实施例3和4的方法构建HL1-IL12和HL1-mock(HL1-△34.5-△47)，评估溶瘤病毒对黑色素瘤小鼠的溶瘤作用。C57BL/6J小鼠皮下接种B16F10肿瘤细胞，建立同种移植黑色素瘤模型。对照组为磷酸盐溶液，治疗组分别为奥沙利铂（10mg/kg）、受试溶瘤病毒HL1-mock（107 pfu），HL1-IL12（107 pfu），HL1-IL12（106 pfu）和HL1-IL12（105 pfu），每组10只小鼠；对照组和受试溶瘤病毒给药组瘤内注射给药，奥沙利铂给药组腹腔注射给药。

[0165] 相对肿瘤抑制率TGI（%）：TGI%=（1-T/C）×100%。T/C % 为相对肿瘤增殖率，即特定时间点治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在特定时间点的相对肿瘤体积（RTV）。RTV=治疗后动物瘤体积/对照组瘤体积。根据肿瘤抑制率（TGI）进行疗效评价。

[0166] 研究结果：通过对小鼠在给药后第10天肿瘤平均体积分析，HL1-IL12 (107 PFU)6 7
肿瘤抑制率为76%、HL1-IL12 (10 PFU)肿瘤抑制率为47%、HL1-mock (10 PFU)肿瘤抑制率为52%，三者相较于对照组在抗肿瘤作用上均具有统计学上的显著性差异（P<0.05）；而HL1-IL12 ( 105 PFU)与奥沙利铂(10mg/kg)单独给药组相较于对照组在抗肿瘤作用上没有统计学上的显著性差异（P > 0.05），肿瘤抑制率分别为6%和20%。对照组在第14天全部死亡，HL1-IL12 (107 PFU)给药组有3只小鼠肿瘤消失持续生存。除上述3只小鼠外，给药组其他小鼠均在第21天死亡。

[0167] 剩余HL1-IL12 (107 PFU)组的3只小鼠肿瘤消失，持续存活至91天，再次在小鼠对侧接种B16F10肿瘤细胞进行再挑战，对照组设5只C57BL/6J小鼠皮下接种B16F10肿瘤细胞，观察肿瘤生长情况。

[0168] 小鼠接种后对照组于第10天长出肿瘤且持续增大，再挑战组未长出肿瘤，持续观察仍未长出肿瘤，证明小鼠经HL1-IL12治疗后具有肿瘤免疫力。

[0169] 表达GM-CSF和IL-2外源基因的溶瘤病毒的溶瘤作用

[0170] 通过基因工程方法将本发明CCTCC保藏号为V201810（CCTCC NO：V201810）的病毒株和对照病毒17病毒株的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，并在敲除ICP34.5基因的位置插入人工化学合成的外源基因。该外源基因从5’端至3’端依次包括：CMV启动子、编码GM-CSF的基因（Gene ID：12981）、BGH PolyA、EF1α启动子、编码IL-2的基因（Gene ID：16183）和TK PolyA。在北京三博远志公司测序鉴定上述编码基因正确插入到单纯疱疹病毒载体中。

[0171] 在C57BL/6小鼠皮下接种鼠源黑色素瘤B16F10细胞株构建动物模型。选取建模成功的小鼠，设置9组，每组5只小鼠，其中HL-1重组病毒治疗组：给予导入外源基因GM-CSF和IL-2的HL-1重组病毒；17病毒株重组病毒治疗组：给予导入外源基因GM-CSF和IL-2的17病毒株重组病毒；HSV-mock组：为不插入外源基因且敲除ICP34.5基因、ICP47基因的溶瘤病毒；阴性对照：给予PBS。各组给予病毒的总pfu均为106pfu。采用给药14天后的相对肿瘤抑制率作为判断标准。

[0172] 相对肿瘤抑制率TGI（%）：TGI%=（1-T/C）×100%。T/C % 为相对肿瘤增殖率，即特定时间点治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在特定时间点的相对肿瘤体积（RTV）。RTV=治疗后动物瘤体积/对照组瘤体积。

[0173] 实验结果：HL-1重组病毒治疗组相对肿瘤抑制率为79%；17病毒株重组病毒治疗组相对肿瘤抑制率为58%；HSV-mock组相对肿瘤抑制率为39%。

[0174] 表达抗PD1单克隆抗体外源基因的溶瘤病毒的溶瘤作用

[0175] 如上所述构建插入抗PD1抗体外源基因的溶瘤病毒，外源基因从5’端至3’端依次包括：CMV启动子、编码抗PD1抗体（J43, BioXCell）的基因、BGHPolyA序列。在C57BL/6J小鼠皮下接种B16F10肿瘤细胞，建立同种移植黑色素瘤模型。对照组为磷酸盐溶液，治疗组分别为PD1单抗（5mg/kg）、受试溶瘤病毒HL1-mock（107 pfu），HL1-PD1（107 pfu），HL1-PD1（106 pfu）和HL1-PD1（105 pfu），每组10只小鼠；对照组和受试溶瘤病毒给药组瘤内注射给药，PD1单抗给药组腹腔注射给药，如上所述计算相对肿瘤抑制率。

[0176] 研究结果：通过对小鼠在给药后第13天肿瘤平均体积分析，HL1- PD1各剂量组溶瘤病毒单独给药组相较于对照组在抗肿瘤作用上具有统计学上的显著性差异（P<0.05）；HL1- PD1高、中和低剂量组具有明显的剂量效应，肿瘤抑制率分别为86%、65%和51%，HL1-mock组和PD1单抗组的肿瘤抑制率分别为34%和42%。

[0177] 表达IL-12和PD1单抗外源基因的溶瘤病毒的溶瘤作用

[0178] 如上所述删除了ICP34.5和ICP47基因的HL-1株和17株HSV病毒，分别在ICP34.5和ICP47基因处插入IL-12基因和PD1单抗基因，测定HL1-IL12+PD1（HL-1插入IL-12基因和PD1单抗基因）、17-IL12+PD1（17株插入IL-12基因和PD1单抗基因）分别转染不同细胞的IC50。实验细胞包括A375人皮肤癌细胞、A549人肺癌细胞、AGS 人胃癌细胞、AsPC-1 人胰腺癌细胞、HeLa人宫颈癌细胞、Hep G2 人肝癌细胞、HT-29 人大肠结直肠癌细胞、MCF7 人乳腺癌细胞、PC-3 人前列腺癌细胞、T24 人膀胱癌细胞、U-2 OS 人骨癌细胞和U-87 人脑胶质瘤细胞。

[0179] 取处于对数生长期的细胞，消化后传代至96孔板中。24小时后弃去旧培养基，分别加入9个稀释度的不同病毒，100μl/孔，使得MOI为20、5、1.25、0.3125、0.0781、0.0195、0.0049、0.0012和0.0003，设空白对照。37℃培养3天后弃去孔内所有液体，加入10% CCK-8试剂，100μl/孔，37℃孵育约1-2 h，在450 nm处测定样品OD值，根据拟合曲线计算IC50值。

[0180] 本实施例旨在比较插入IL-12基因和PD1单抗基因后HL-1病毒株重组病毒和17病毒株重组病毒转染肿瘤细胞能力的差异。通过CCK-8法测定病毒转染肿瘤细胞的IC50值，不同病毒转染肿瘤细胞的IC50测定结果参见图12。结果显示插入IL-12基因和PD1单抗基因的HL-1重组病毒相比插入IL-12基因和PD1单抗基因的17株重组病毒转染肿瘤细胞的IC50值均要小，表明插入IL-12基因和PD1单抗基因的HL-1病毒株重组病毒在肿瘤细胞中具有更好的侵染效率和复制能力，溶瘤效果强。

[0181] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。