与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，所述分子标记是以小麦京411基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增得到的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明提供的分子标记与qKl‑1BL紧密连锁，能够促进该位点在推广品种中转移应用，也有利于该位点与其它产量相关位点的聚合育种；本发明提供的分子标记为Indel标记，具有共显性，其引物对具有扩增稳定、检测快捷高效等优点，可以快速确定小麦资源中是否存在qKl‑1BL及存在型态，并预测小麦的粒长特性。

权利要求

1.与小麦粒长性状相关的分子标记1BL-16，其特征在于，所述分子标记1BL-16是以小麦京411的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增得到的DNA片段，该分子标记1BL-16的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.权利要求1所述的分子标记1BL-16在如下任意一项中的应用：（1）在鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状中的应用；

（2）在选育具有粒长基因型的小麦中的应用。

说明书

与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种分子标记及其应用，具体涉及与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，属于作物选种培育技术领域。

背景技术

[0002] 小麦（Triticum aestivum L.）是世界上主要的粮食作物之一，在我国粮食安全中发挥着重要作用。我国可用耕地面积少，与粮食需求量产生巨大矛盾，因此在有限的土地面积上需要通过增加单产来增加粮食总产量。有效穗数、穗粒数以及粒重是小麦产量构成的三要素。小麦粒型包括粒长、粒宽和粒厚等性状，与小麦粒重极显著正相关。此外，小麦粒型还影响加工与外观商品品质。因此，小麦粒型性状的遗传改良在培育高产、优质小麦品种中显得尤为重要。

[0003] 在传统的品种改良实践中，需要将不同品种（系）进行一系列杂交，通过多年多点的表型鉴定，不仅费时费力，而且难度大、成本高。分子标记辅助育种技术即利用与目标性状基因密切连锁的分子标记判断检测目的基因是否存在的方法。在育种初期对目标基因进行选择，可以有效提高目标性状改良的效率和准确性，缩短育种进程，在农业生物育种中逐步得到广泛应用。

[0004] 与大多数农艺性状一样，籽粒性状是典型的数量性状，受多基因调控，基因的分离和鉴定面临巨大挑战，限制了小麦分子标记的开发和分子育种应用。关于小麦粒长的QTL定位结果表明，小麦粒长QTL在21条染色体上均有分布。目前，利用多个作图群体在1BL染色体上已检测到一些与粒长相关的QTL位点。由于研究所用遗传群体和分子标记的差异，一些QTL区间较大，其连锁标记距离目标基因较远，导致粒长分子标记不能有效用于分子辅助育种。

发明内容

[0005] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，通过获得的与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记，来检测小麦品种（系）中是否含有增加粒长的QTL位点，进而来辅助选育高产、优质的小麦新品种。

[0006] 为了实现上述目标，本发明首先提供了用于鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状的引物对、制备上述引物对的方法以及用于鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状的产品。

[0007] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状的引物对，其特征在于，所述引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示的两条单链DNA组成。

[0008] 本发明所提供的制备上述引物对的方法，其特征在于，包括将上述的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

[0009] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状的产品，其特征在于，所述产品含有上述的引物对。

[0010] 为了实现上述目标，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状的方法。

[0011] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0012] 步骤1：提取待测小麦的基因组DNA；

[0013] 步骤2：以待测小麦的基因组DNA为模板，用前述的引物对进行PCR扩增；

[0014] 步骤3：将待测小麦的PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳结果确定待测小麦的粒长性状：如果出现了分子量大小为344bp的扩增片段，预测该小麦品种或品系具有增加小麦粒长的QTL位点，否则，该小麦品种或品系不具有增加小麦粒长的QTL位点。

[0015] 在步骤2中，PCR扩增反应体系为10μL，包括：

[0016] （1）0.5μL浓度为10μmol/l的SEQ ID NO:1所示的上游引物；

[0017] （2）0.5μL浓度为10μmol/l的SEQ ID NO:2所示的下游引物；

[0018] （3）1μL浓度为50ng/μl的DNA模板；

[0019] （4）5μL 2×Taq PCR StarMix；

[0020] （5）3μL ddH2O补足反应体系。

[0021] 在步骤2中，PCR扩增程序如下：

[0022] 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，34个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

[0023] 在步骤3中，凝胶选用的是6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，每100mL凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺。

[0024] 与此同时，本发明还提供了与小麦粒长性状相关的分子标记1BL-16。

[0025] 本发明所提供的与小麦粒长性状相关的分子标记1BL-16，其特征在于，所述分子标记1BL-16是以小麦京411的基因组DNA为模板，用前述的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0026] 本发明的有益之处在于：

[0027] （1）本发明提供的引物对，由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示的两条单链DNA组成，该引物对具有扩增稳定、检测快捷高效等优点，可以促进粒长主效QTL qKl-1BL在高产、优质小麦分子育种中的应用；

[0028] （2）本发明提供的分子标记1BL-16，与qKl-1BL紧密连锁，其能够促进该位点在推广品种中转移应用，也有利于该位点与其它产量相关位点的聚合育种；

[0029] （3）本发明提供的分子标记1BL-16为Indel标记，具有共显性，其引物对具有扩增稳定、检测快捷高效等优点，通过使用分子标记1BL-16，可以快速确定小麦资源中是否存在qKl-1BL以及存在型态，并预测小麦的粒长特性，进而有效筛选含有qKl-1BL位点的小麦品种（系）并用于小麦品种的改良；

[0030] （4）通过应用与qKl-1BL紧密连锁的分子标记1BL-16，可以大大减少表型鉴定的工作，并且在小麦苗期就可加以利用，从而淘汰非目标植株，既节约了育种成本，又提高了育种效率。

附图说明

[0031] 图1是本发明提供的分子标记1BL-16在部分KJ-RIL家系中的扩增带型，M为2000bp DNA Ladder，K为小麦品种科农9204的扩增带型，J为小麦品种京411的扩增带型；

[0032] 图2是利用MapQTL 6.0和IciMapping 4.1进行QTL-qKl-1BL定位分析的结果图；

[0033] 图3是小麦粒长主效QTL-qKl-1BL在染色体1B上的作图区间，空心长方形代表染色体，左侧是分子标记的名称，右侧数字是标记在染色体上的位置，单位是MB，左侧加粗分子标记为1BL-16，染色体右方黑色的长方形分别表示粒长在9个环境下的QTL作图区间；

[0034] 图4是在9个环境中188个KJ-RIL家系基于1BL-16的粒长的单标记分析结果图，AA表示来自科农9204的粒长减少等位基因，BB表示来自京411的粒长增加等位基因，**表示差异极显著（P<0.01），*表示差异显著（P<0.05）。

具体实施方式

[0035] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

[0036] 一、与小麦粒长主效QTL紧密连锁的分子标记

[0037] 小麦品种科农9204为2003年国审品种，品种审定号为国审麦2003037。

[0038] 小麦品种京411也为审定品种，可从国家农作物种质资源库索取，全国统一编号为ZM020984。

[0039] 利用QTL定位分析，将粒长主效QTL-qKl-1BL定位于1B染色体长臂AX-109370525～AX-110579468的区间内，利用科农9204和京411重测序数据，在qKl-1BL区段LOD预测峰值附近设计开发了一个在亲本间有多态性的InDel分子标记1BL-16。该分子标记1BL-16的上游引物的序列为：GGCCGCACAAAGGACAACAAA（SEQ ID  NO:1），下游引物的序列为：TCGGCCATAATAAACAACATCTCC（SEQ ID NO:2）。

[0040] 以小麦品种京411的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增。

[0041] PCR扩增反应体系为10μL，包括：

[0042] （1）0.5μL浓度为10μmol/l的SEQ ID NO:1所示的上游引物；

[0043] （2）0.5μL浓度为10μmol/l的SEQ ID NO:2所示的下游引物；

[0044] （3）1μL浓度为50ng/μl的DNA模板；

[0045] （4）5μlL2×Taq PCR StarMix；

[0046] （5）3μLddH2O补足反应体系。

[0047] PCR扩增程序如下：

[0048] 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，34个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

[0049] PCR仪的型号：T100TMThermal Cycler。

[0050] 所得扩增产物在6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（每100mL凝胶溶液中含有5.85g丙烯酰胺和0.15g甲叉丙烯酰胺）上进行电泳分离，最终扩增产物的分子量为631bp（如SEQ ID NO:3所示）。

[0051] 二、分子标记1BL-16的获取方法

[0052] 分子标记1BL-16的获取方法具体包括以下步骤：

[0053] 步骤1：形成含有188个家系的F6代RIL群体

[0054] 以粒长较短的小麦品种科农9204为母本、以粒长较长的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，杂种F1自交产生F2，F2逐代自交形成含有188个家系的F6代RIL群体；

[0055] 步骤2：用CTAB法提取小麦KJ-RIL群体叶片DNA

[0056] 取钢珠和0.2g左右的新鲜叶片放入2.0mL离心管中，将离心管放入液氮中，振荡使叶片呈粉末状，加CTAB提取液0.8mL，65℃水浴30min，其间反转4次摇匀，然后将离心管放置于室温冷却，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1），剧烈振荡1min，之后120000rpm离心10min，吸取上清500uL至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇（-20℃预冷）沉淀DNA，然后12000rpm离心5min，倒掉上清，加入适量70%乙醇洗涤沉淀2次，将离心管倒扣吸水纸上，晾干DNA，最后加400uL ddH2O溶解，置于-20℃冰箱保存。

[0057] 用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物对上述提取的所有DNA进行PCR扩增。

[0058] PCR扩增反应体系为10μL，包括：

[0059] （1）0.5μL浓度为10μmol/l的SEQ ID NO:1所示的上游引物；

[0060] （2）0.5μL浓度为10μmol/l的SEQ ID NO:2所示的下游引物；

[0061] （3）1μL浓度为50ng/μl的DNA模板；

[0062] （4）5μL 2×Taq PCR StarMix；

[0063] （5）3μL ddH2O补足反应体系。

[0064] PCR扩增程序如下：

[0065] 94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，34个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

[0066] PCR仪的型号：T100TMThermal Cycler。

[0067] 扩增产物采用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2h。

[0068] 硝酸银染色步骤：电泳完毕后，剥离胶块在固定液中固定3min，用去离子水快速冲洗3次，然后于银染液中染色8min，用去离子水冲洗2次，之后转入显影液中显影至扩增条带清晰可见，用水清洗2次。

[0069] 将显影后的胶块放至观片灯上，记录带型，拍照得到凝胶图片，如图1所示。

[0070] 带型读取结果显示：小麦品种科农9204扩增产物大小为312bp，小麦品种京411扩增产物大小为344bp，KJ-RIL共188个群体中带型与科农9204相同的有94个，带型与京411相同的有93个。

[0071] 步骤3：构建小麦分子标记遗传连锁图谱

[0072] 利用JoinMap 2.0作图软件，将获得的RIL群体基因型资料构建具有119566个标记位点的小麦分子标记遗传连锁图谱，以LOD≥2.5为标准。

[0073] 结果：119566个标记中包含119001个SNP 标记、287个DArTs标记、153个g-SSR标记、50个e-SSR标记、17个STS标记、45个SRAPs标记、5个ISSRs标记、7个功能性PCR标记和1个形态标记。

[0074] 步骤4：考察KJ-RIL群体188个家系各个株系的粒长及千粒重

[0075] 将KJ-RIL群体188个家系种植在10个不同的环境下进行田间表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的粒长及千粒重。

[0076] 不同的环境包括：2011～2012年、2012～2013年、2013～2014年连续3年在中国科学院栾城农业生态系统试验站（T1、T2及T3：37°53’N，114°41’E）、2012～2013年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场（T4：40°06’N，116°24’E）及河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地（T5：35°27’N，113°48’E）种植，每个环境设置低氮和高氮两种氮水平处理，一共10个环境，其中，低氮处理是全年不施肥，高氮处理是于每年播前施300kg·hm-2磷酸二胺和225 kg·hm -2尿素作为底肥、于拔节期再施150 kg·hm -2尿素追肥。

[0077] 10个不同环境下小麦种植方法：每个株系种2行，40粒/行；行长3m，株距7.5cm，行距25cm。

[0078] 粒长测定方法：收获后每个株系随机选取5株，分出主茎穗，脱粒后选择10粒用游标卡尺进行测量，以5株的平均值为最终所测株系粒长。

[0079] 步骤5：进行加性QTL定位分析

[0080] 利用上述188个KJ-RIL高密度遗传连锁图谱以及基因型和表型值，采用 MapQTL 6.0和IciMapping 4.1进行加性QTL定位分析，分析结果见表1、图2和图3。

[0081] 表1基于不同环境下粒长主效QTL-qKl-1BL的定位结果

[0082] 性状-环境 位直（MB） 左侧标记 右侧标记 LOD值 PVE(%) 加性效应粒长-El 698.71 AX-109370525 AX-110979003 2.27 5.54 -0.05粒长-E2 703.31 AX-111496745 AX-110579468 5.86 13.47 -0.10
粒长-E3 695.01 AX-86178495 AX-109370525 3.18 7.19 -0.10
粒长-E4 698.31 AX-86178495 AX-109370525 5.95 14.05 -0.12
粒长-E5 696.61 AX-86178495 AX-109370525 2.24 5.16 -0.08
粒长-E6 698.81 AX-109370525 AX-110979003 4.34 10.45 -0.09
粒长-E7 704.61 AX-111496745 AX-110579468 2.15 5.23 -0.07
粒长-E9 700.41 AX-110979003 AX-111496745 2.41 5.78 -0.06
粒长-E10 699.21 AX-109370525 AX-110979003 4.24 9.89 -0.09

[0083] QTL分析结果表明：10个环境均能稳定检测到控制粒长主效QTL-qKl-1BL，其中，有9个环境LOD值≥ 2，有1个环境LOD值＜2（粒长-E8，故未列入表1中），区间定位在1B染色体的长臂上AX-86178495～AX-110579468（物理位置：KN1B:687.193291-710.238150）23MB区段内，LOD峰值出现在物理位置为KN1B: 695.01-704.61MB的区段内。所定位粒长QTL能够解释粒长表型变异的5.16～14.05%，其中来自京411的等位基因增加粒长0.5～1.3mm。

[0084] 步骤6：基于单标记1BL-16的粒长差异显著性分析

[0085] 采用1BL-16对KJ-RIL188个家系进行基因型分型的结果，对不同基因型粒长进行差异显著性分析。

[0086] 在9个环境中188个KJ-RIL家系基于1BL-16的粒长的单标记分析结果图见图4。

[0087] 结果表明，与来自科农9204等位基因降低粒长的效应相比，来自京411的等位基因均可增加粒长。

[0088] 这说明：SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物在小麦品种京411的DNA中获得的分子量为344bp的扩增产物，即为与小麦粒长QTL紧密连锁的分子标记（即分子标记1BL-16）。

[0089] 三、分子标记1BL-16的应用

[0090] 基于前面的试验和分析可知：

[0091] （1）由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成的引物对，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状中，还可以应用在获取与小麦粒长相关的分子标记中；

[0092] （2）分子标记1BL-16，可以应用在鉴定或辅助鉴定小麦粒长性状中，还可以应用在选育具有粒长基因型的小麦中。

[0093] 综上，本发明提供的引物对以及分子标记1BL-16，可大大加快小麦粒长分子标记辅助选择育种进程，对小麦粒型遗传改良和培育高产、优质小麦品种具有重要应用价值。

[0094] 需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。