本发明公开了一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，包括以下步骤：(1)采用乙腈对样品进行前处理；(2)离子色谱测定前处理所得样品中各种还原性单糖的浓度；(3)显色后，紫外‑可见光谱测定各种还原性单糖在562nm的摩尔吸光系数及待测样品在该波长的总吸光度值；(4)基于上述步骤测定的参数值，同时以牛血清蛋白作为花生蛋白的参考标准品，扣除还原性单糖对562nm波长处总吸光度值的贡献，计算得到前处理所得样品中水溶性花生蛋白质的浓度。本发明排除了样品中不同还原性单糖对水溶性花生蛋白质浓度测定的干扰，实验结果可知，由还原性单糖造成水溶性花生蛋白质浓度的偏高率达到22％～50％。
1.一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取一份含有还原性单糖的溶液样品，用乙腈或丙酮进行稀释，加入乙腈或丙酮的体积是溶液样品体积的2～4倍，待溶液样品中的蛋白质沉淀后，将此溶液样品离心，离心后取上清液用于后续离子色谱的测定；
将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准物分别溶于超纯水中，稀释成一系列浓度梯度，糖的浓度范围为0.1～2mg/L；
采用离子色谱确定各种糖的出峰时间、并测定其峰面积，根据已配置糖浓度建立阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准曲线；
离子色谱所用检测器、色谱柱和电极分别为脉冲安培电化学检测器、碳水化合物分析柱和金电极，淋洗液由超纯水和200～250mmol/L NaOH溶液组成，采用梯度洗脱的方式对过滤液中的各种糖进行分离和定量测定；
用去离子水稀释上清液，然后对上清液进行过滤，按照步骤(2)中离子色谱方法测定过滤液中多种单糖的峰面积；
(4)基于步骤(2)建立的标准曲线，根据步骤(3)色谱图中各种糖的峰面积、去离子水稀释倍数和乙腈稀释倍数，计算出溶液样品中各种还原性单糖的浓度；
将商品化的BCA试剂盒中A试剂和B试剂按体积比45∶1～50∶1进行混合，得到的BCA试剂用作蛋白质和还原性单糖的显色剂；
取浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液0.1～0.15mL、BCA试剂3～4.5mL混合后，置于30～37℃条件下中反应30～45min，反应后倒入宽度为1cm的石英比色皿中，静置后进行紫外-可见光谱的背景扫描，记录562nm波长处的吸光度值；
(6)将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准物分别溶于浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，糖的浓度范围为0.1～8g/L；
按照步骤(5)中的方法进行紫外-可见光谱的样品扫描，记录各种还原性单糖溶液在
根据朗伯比尔定律，建立标准物溶液的浓度及其在562nm波长处吸光度值之间的线性标准曲线：其中， 为某种糖在562nm处的吸光度值； 为某种糖在562nm处的摩尔吸光系数，L/g；CSugar为配置的某种糖的浓度，g/L；
根据测定的吸光度值和配置的糖浓度，某种糖在562nm处的摩尔吸光系数 根据等式1进行计算；
(7)紫外-可见光谱测定溶液样品中花生蛋白质的浓度：
另取一份含有还原性单糖的花生蛋白质溶液样品，经浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～
6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5～20倍后，根据步骤(5)和(6)的方法测定溶液样品中水溶性花生蛋白质和还原性单糖在562nm处的总吸光度值在某一波长处，根据不同物质对吸光度所产生的贡献存在叠加原理可知：其中， 为溶液样品在562nm处的总吸光度值； 和
分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和水溶性花生蛋白质在562nm处的吸光度值；
根据步骤(4)所测定出溶液样品中各种还原性单糖的浓度及等式1，溶液样品中水溶性花生蛋白质在562nm处的净吸光度值计算如下：其中， 和 分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖在
562nm处的摩尔吸光系数；CAra、CGal、CXyl、CGlu和CMan分别为步骤(4)所测定出溶液样品中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的浓度；
将一定质量的牛血清蛋白溶于浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并经相同的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释一定倍数，采用步骤(5)和(6)的方法测定不同浓度牛血清蛋白溶液在562nm处的吸光度值，根据朗伯比尔定律建立其标准曲线，计算其摩尔吸光系数在未扣除单糖干扰的情况下，基于牛血清蛋白的摩尔吸光系数 溶液样品中水溶性花生蛋白质浓度采用下式进行计算：为避免单糖的干扰，结合等式3及牛血清蛋白的摩尔吸光系数，溶液样品中水溶性花生蛋白质浓度根据下式进行计算：其中，CPP为溶液样品中水溶性花生蛋白的浓度，g/L； 为牛血清蛋白在562nm处摩尔吸光系数，L/g；
所述含有还原性单糖的溶液为脱脂花生粉提取液；所述脱脂花生粉提取液的制备，包括以下步骤：(a)将一定体积的醋酸-醋酸钠缓冲液和一定质量的半纤维素酶加入到容器中溶解；
(b)往容器中加入一定质量的脱脂花生粉，置于45～55℃环境中进行蛋白质提取；提取结束后进行离心分离，取上清液作为脱脂花生粉的粗提取液；
(c)将步骤(b)中的粗提取液在85℃条件下加热15min，然后离心去除变性沉淀的半纤维素酶，取上清液作为脱脂花生粉提取液；
提取花生粕中水溶性花生蛋白质所用溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液浓度和pH值范围分别为40～50mmol/L、4.5～6.0。
2.根据权利要求1所述含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，上述步骤(1)中离心的工艺条件为：离心转速和时间范围分别为10000～12000转/min和15～20min。
3.根据权利要求1所述含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，上述步骤(3)中用去离子水稀释上清液，稀释倍数范围为1000～3000倍。
4.根据权利要求1所述含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，上述步骤(3)中所述过滤采用0.22～0.45μm孔径的水性微孔滤膜。
5.根据权利要求1所述含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，所述脱脂花生粉为干法热压榨或干法冷压榨花生油后的花生粕，经磨粉后过
6.根据权利要求5所述含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，以绝干质量计的脱脂花生粉质量与醋酸-醋酸钠缓冲液体积比的范围为1∶8～
7.根据权利要求5所述含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，其特征在于，辅助提取花生粕中水溶性花生蛋白质所用酶为半纤维素酶，半纤维素酶用量范围为5～30mg蛋白/g绝干脱脂花生粉。
一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定
方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法。
背景技术
[0002] 花生是我国产食用油的六大重要原料之一。目前，我国花生的年产量居世界首位，占全球花生总产量的40％以上。除用于食用、出口及作物种子外，每年大约有50～60％的花生用于制备食用油。花生经压榨产油后的剩余物称之为花生粕，其年产量已达到300万吨以上。除碳水化合物和少量脂肪类物质外，花生粕中蛋白质的含量高达50％以上。经有效提取、纯化和精制后，花生蛋白可直接作为淀粉类和肉类制品的天然添加剂，提升食品的营养价值；经蛋白酶水解、分离纯化和精制后，除产生人体所需的8种必需氨基酸外，还可产生多种活性多肽物质，具备增强人体免疫力的显著功效。
[0003] 水溶性蛋白是花生蛋白质中最易提取和利用的蛋白质。为增加水溶性花生蛋白质的提取率，通常采用生物酶(如半纤维素酶、纤维素酶和脂肪酶等)水解花生粕中的聚糖和寡糖，增加花生粕的可及性。然而，酶法辅助提取技术所产生的提取液成分较为复杂，除水溶性蛋白纯化和精制技术较为缺乏外，现有蛋白质浓度测定方法涉及步骤繁琐或准确度低的缺陷，导致对水溶性花生蛋白自身酶水解、分离纯化和精制的价值也难以准确评价，大部分花生粕或其提取物直接作为鱼类和家禽的饲料添加剂，显著影响我国水溶性花生蛋白的高值化转化和利用，造成资源的严重浪费。
[0004] 前期，研究者主要采用凯氏定氮法测定花生粕提取液中水溶性蛋白的浓度(李晓刚,张永丹.花生粕的酶解新工艺研究[J].食品工业科技,2004,25(2):102-103.)。但该方法涉及浓硫酸消化样品、氨的蒸馏及盐酸滴定等繁琐的操作步骤，且分析滴定人为操作误差较大，影响测定的准确性。此外，尽管部分研究者采用BCA试剂测定血清(周祖钊,朱文雅,彭小玲,等.BCA法测定微量蛋白质的初步评价[J].临床检验杂志,1992(3):134-135.)、蜂蜜(邹泽红.BCA法测定蜜蜂变应原中的蛋白含量[J].化学分析计量,2004,13(05):000052-53.)及酶制剂(尚雁,李娜,覃小焕,等.介孔分子筛SBA-15的脂肪酶固定量分析测定[J].分析化学,2009,37(8):1173-1177.)中蛋白质的浓度，但还原性单糖可与BCA试剂发生显色反应，增大特定波长下的吸光度值，影响检测的准确性。
[0005] 尽管已公开的中国发明专利(一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，申请号：201710213757.2)利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法排除还原糖对烟叶提取液、苹果果肉提取液及糖尿样品中蛋白质含量测定的干扰。一方面，前期研究(Differential behaviour of the dinitrosalicylic acid(DNS)reagent towards mono-and di-saccharide sugars,Biomass and Bioenergy,2011,35,4748-4750)表明，相同浓度单糖(如葡萄糖)和寡糖(如纤维二糖)与DNS溶剂显色反应后，其产生的吸光度值不同，即特定波长处单糖和寡糖的摩尔吸光系数不同。而植物提取液(如中国发明专利，一种烟叶多糖提取物及其提取方法以及应用，申请号：201710076652.7；一种同时提取桑叶蛋白和桑叶多糖的方法，申请号：201811481746.3)中基本均含有单糖和寡糖，DNS法测得总可溶性糖的准确性较差。另一方面，本发明发现，相同浓度但不同种类单糖(如葡萄糖和木糖)与BCA试剂显色后反应后，其产生的吸光度值不同，即特定波长处不同种类单糖的摩尔吸光系数不同(见附图2、3和4)；同时，纤维二糖基本不与BCA试剂发生显色反应。因此，根据已公开发明专利(申请号：201710213757.2)的方法，首先，由于葡萄糖和纤维二糖与DNS显色反应后在特定波长处的摩尔吸光系数不同，采用DNS法所测得样品中还原糖浓度本身不准确；其次，由于葡萄糖和木糖与BCA试剂显色反应后在特定波长处的摩尔吸光系数差异较大，以葡萄糖为标准物来测定还原糖(包括不同单糖)在特定波长处的摩尔吸光系数，进而根据DNS法测得还原糖浓度来计算还原糖对样品总吸光度值所产生干扰的准确性更不准确。总体而言，已公开发明专利(申请号：201710213757.2)存在以下显著不足：(1)DNS法测得还原糖浓度不准确；(2)与BCA试剂显色反应后，忽略不同单糖(如葡萄糖和木糖)在特定波长处摩尔吸光系数的较大差异。
发明内容
[0006] 为了解决上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] 一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，包括以下步骤：
[0009] (1)取一份含有还原性单糖的溶液样品，用乙腈或丙酮进行稀释，加入乙腈或丙酮的体积是溶液样品体积的2～4倍，待溶液样品中的蛋白质沉淀后，将此溶液样品离心，离心后取上清液用于后续离子色谱的测定；
[0010] (2)离子色谱测定各种糖的标准曲线：
[0011] 将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准物分别溶于超纯水中，稀释成一系列浓度梯度，糖的浓度范围为0.1～2mg/L；
[0012] 采用离子色谱确定各种糖的出峰时间、并测定其峰面积，根据已配置糖浓度建立阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准曲线；
[0013] 离子色谱所用检测器、色谱柱和电极分别为脉冲安培电化学检测器、碳水化合物分析柱和金电极，淋洗液由超纯水和200～250mmol/L NaOH溶液组成，采用梯度洗脱的方式对过滤液中的各种糖进行分离和定量测定；
[0014] (3)离子色谱测定上清液中多种单糖的浓度：
[0015] 用去离子水稀释上清液，然后对上清液进行过滤，按照步骤(2)中离子色谱方法测定过滤液中多种单糖的峰面积；
[0016] (4)基于步骤(2)建立的标准曲线，根据步骤(3)色谱图中各种糖的峰面积、去离子水稀释倍数和乙腈稀释倍数，计算出溶液样品中各种还原性单糖的浓度；
[0017] (5)紫外-可见光谱测定标准糖溶液的吸光度值：
[0018] 将商品化的BCA试剂盒中A试剂和B试剂按体积比45:1～50:1进行混合，得到的BCA试剂用作蛋白质和还原性单糖的显色剂；
[0019] 取浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液0.1～0.15mL、BCA试剂3～4.5mL混合后，置于30～37℃条件下中反应30～45min，反应后倒入宽度为1cm的石英比色皿中，静置后进行紫外-可见光谱的背景扫描，记录562nm波长处的吸光度值；
[0020] (6)将阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖的标准物分别溶于浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，糖的浓度范围为0.1～8g/L；
[0021] 按照步骤(5)中的方法进行紫外-可见光谱的样品扫描，记录各种还原性单糖溶液在562nm波长处的吸光度值；
[0022] 根据朗伯比尔定律，建立标准物溶液的浓度及其在562nm波长处吸光度值之间的线性标准曲线：
[0023]
[0024] 其中， 为某种糖在562nm处的吸光度值； 为某种糖在562nm处的摩尔吸光系数，L/g；CSugar为配置的某种糖的浓度，g/L；
[0025] 根据测定的吸光度值和配置的糖浓度，某种糖在562nm处的摩尔吸光系数 根据等式1进行计算；
[0026] (7)紫外-可见光谱测定溶液样品中花生蛋白质的浓度：
[0027] 另取一份含有还原性单糖的花生蛋白质溶液样品，经浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5～20倍后，根据步骤(5)和(6)的方法测定溶液样品中水溶性花生蛋白质和还原性单糖在562nm处的总吸光度值 ；
[0028] 在某一波长处，根据不同物质对吸光度所产生的贡献存在叠加原理可知：
[0029]
[0030] 其中， 为溶液样品在562nm处的总吸光度值； 和分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和水溶性花生蛋白质在562nm处的吸光度值；
[0031] 根据步骤(4)所测定出溶液样品中各种还原性单糖的浓度及等式1，溶液样品中水溶性花生蛋白质在562nm处的净吸光度值可计算如下：
[0032]
[0033] 其中， 和 分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖在562nm处的摩尔吸光系数；CAra、CGal、CXyl、CGlu和CMan分别为步骤(4)所测定出溶液样品中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的浓度；
[0034] (8)溶液样品中水溶性花生蛋白质的浓度：
[0035] 将一定质量的牛血清蛋白溶于浓度为40～50mmol/L且pH 5.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并经相同的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释一定倍数，采用步骤(5)和(6)的方法测定不同浓度牛血清蛋白溶液在562nm处的吸光度值，根据朗伯比尔定律建立其标准曲线，计算其摩尔吸光系数 ；
[0036] 在未扣除单糖干扰的情况下，基于牛血清蛋白的摩尔吸光系数 ，溶液样品中水溶性花生蛋白质浓度采用下式进行计算：
[0037]
[0038] 为避免单糖的干扰，结合等式3及牛血清蛋白的摩尔吸光系数，溶液样品中水溶性花生蛋白质浓度可根据下式进行计算：
[0039]
[0040] 其中，CPP为溶液样品中水溶性花生蛋白的浓度，g/L； 为牛血清蛋白在562nm处摩尔吸光系数，L/g。
[0041] 通常，牛血清蛋白(BSA)常作为各种蛋白质浓度测定的标准物。
[0042] 优选地，上述步骤(1)中离心的工艺条件为：离心转速和时间范围分别为10000～12000转/min和15～20min。
[0043] 优选地，上述步骤(3)中用去离子水稀释上清液，稀释倍数范围为1000～3000倍。
[0044] 优选地，上述步骤(3)中所述过滤采用0.22～0.45μm孔径的水性微孔滤膜。
[0045] 优选地，上述步骤(2)和(3)中，梯度洗脱条件为：0～18min 1mmol/L NaOH溶液、18.1～23min 50mmol/L NaOH溶液、23.1～30min 50～250mmol/L NaOH溶液、30.1～55min
250mmol/L NaOH溶液、55.1～70min 1mmol/L NaOH溶液；
[0046] 柱箱温度为25～30℃；检测器温度为30～35℃；淋洗液流速为0.4～0.5mL/min；进样体积为20～25μL。
[0047] 优选地，所述含有还原性单糖的溶液为脱脂花生粉提取液；所述脱脂花生粉为干法热压榨或干法冷压榨花生油后的花生粕，经磨粉后过60～80目筛网。
[0048] 优选地，所述脱脂花生粉提取液的制备，包括以下步骤：
[0049] (a)将一定体积的醋酸-醋酸钠缓冲液和一定质量的半纤维素酶加入到容器中溶解；
[0050] (b)往容器中加入一定质量的脱脂花生粉，置于45～55℃环境中进行蛋白质提取；提取结束后进行离心分离，取上清液作为脱脂花生粉的粗提取液；
[0051] (c)将步骤(b)中的粗提取液在85℃条件下加热15min，然后离心去除变性沉淀的半纤维素酶、纤维素酶和纤维二糖酶，取上清液作为脱脂花生粉提取液。
[0052] 优选地，上述步骤(a)中，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度和pH值范围分别为40～50mmol/L、4.5～6.0；以绝干质量计的脱脂花生粉质量与醋酸-醋酸钠缓冲液体积比的范围为1:8～1:12。
[0053] 优选地，上述步骤(a)中，半纤维素酶用量范围为5～30mg蛋白/g绝干脱脂花生粉。
[0054] 优选地，上述步骤(b)中，提取结束后对固液混合物进行离心分离，离心转速及时间范围分别为5000～8000转/min和10～15min。
[0055] 优选地，将步骤(c)中的粗提取液在85℃条件下加热15min的具体步骤为：
[0056] 将步骤(b)中的粗提取液倒入圆底烧瓶中，圆底烧瓶上部配蛇形冷凝管，蛇形冷凝管上下接入自来水进行冷却，圆底烧瓶置于油浴锅中，在85℃加热15min。
[0057] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0058] 本发明采用半纤维素酶辅助水解的方法提高脱脂花生粉中水溶性花生蛋白质的溶出率。
[0059] 测定单糖标准物在特定波长下的摩尔吸光系数、离子色谱测定提取液中各种单糖浓度，进而根据已知摩尔吸光系数及浓度计算出单糖对特定波长吸光度值的贡献，排除提取液中单糖对蛋白质测定的干扰，利用BCA试剂准确测定脱脂花生粉提取液中水溶性花生蛋白质的浓度。
[0060] 由于还原性单糖的存在，对脱脂花生粉提取液样品中水溶性花生蛋白质浓度的影响非常显著，造成浓度的偏高率达到22.2％～49.7％。
附图说明
[0061] 图1为不同浓度牛血清蛋白(BSA)与BCA试剂反应后的紫外-可见光谱；
[0062] 图2为不同浓度葡萄糖与BCA试剂反应后的紫外-可见光谱；
[0063] 图3为不同浓度木糖与BCA试剂反应后的紫外-可见光谱；
[0064] 图4为与BCA试剂反应后不同物质浓度与其吸光度值的对应关系。
具体实施方式
[0065] 下面给出实施例以对本发明进行具体的描述，实施例及对比例所用的原材料均为市购。
[0066] 商品化的BCA试剂盒：购自于美国Thermo Scientific公司，包含PierceTM BCA Protein Assay Reagent A和Reagent B。
[0067] 实施例1～5和对比例1～5
[0068] 一种含有还原性单糖的溶液中水溶性花生蛋白质浓度的测定方法，以脱脂花生粉提取液为测试样品，包括以下步骤：
[0069] (1)脱脂花生粉提取液的制备：
[0070] 首先，将一定体积的醋酸-醋酸钠缓冲液和一定质量的半纤维素酶加入到三角瓶中，充分摇晃使三种酶完全溶解；
[0071] 然后，往此三角瓶中加入一定质量的脱脂花生粉，用橡皮塞将三角瓶塞紧；
[0072] 最终，将塞紧瓶口的三角瓶置于空气浴摇床中进行蛋白质提取。
[0073] 提取结束后，将固液混合物进行离心分离，取上清液作为脱脂花生粉的粗提取液。
[0074] 其中，脱脂花生粉为干法压榨花生油后的花生粕，经磨粉后过80目筛网。
[0075] 其中，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度和pH值范围分别为40～50mmol/L、4.5～6.0；
[0076] 以绝干质量计的脱脂花生粉质量与醋酸-醋酸钠缓冲液体积比(简称固液比，g:ml)的范围为1:8～1:12。
[0077] 其中，半纤维素酶、纤维素酶和纤维二糖酶用量分别为5～30mg蛋白/g绝干脱脂花生粉。
[0078] 其中，空气浴摇床的运行温度、时间和转速分别为45～55℃、12～48h和150～250转/min。
[0079] 其中，提取所得固液混合物离心分离的转速和时间分别为5000～8000转/min和10～15min。
[0080] (2)提取液的预处理：
[0081] 将步骤(1)中的粗提取液倒入圆底烧瓶中，圆底烧瓶上部配蛇形冷凝管，蛇形冷凝管上下接入自来水进行冷却，圆底烧瓶置于油浴锅中，在85℃加热15min，然后离心去除变性沉淀的半纤维素酶，离心转速和时间范围分别为10000～12000转/min和15～20min，取上清液作为脱脂花生粉的提取液。
[0082] 按体积将上述提取液分成两等份(简称提取液E1和提取液E2)，分别装入玻璃小瓶中；
[0083] 经醋酸-醋酸钠缓冲液(40～50mmol/L、pH 5.0～6.0)稀释5～20倍后，提取液E1直接用于紫外-可见光谱的测定；
[0084] 提取液E2用乙腈进行稀释，加入乙腈的体积是提取液E2体积的2～4倍，此时脱脂花生粉中提取出的水溶性花生蛋白质发生沉淀，将此稀释液进一步离心，离心转速和时间范围分别为10000～12000转/min和15～20min，离心后取上清液(E2-1溶液)于另一干净的带盖玻璃小瓶中，用于后续离子色谱的测定。
[0085] (3)离子色谱测定E2-1溶液中糖浓度：
[0086] 用去离子水进一步稀释E2-1溶液，稀释倍数范围为1000～3000倍，然后采用0.45μm孔径的水性微孔滤膜对稀释液进行过滤，进而利用离子色谱测定过滤液中糖浓度；
[0087] 离子色谱所用检测器、色谱柱和电极分别为脉冲安培电化学检测器、碳水化合物分析柱和金电极，淋洗液由超纯水和250mmol/L NaOH溶液组成，采用梯度洗脱的方式对E2-1溶液中的多种糖进行分离和定量测定。
[0088] 其中，梯度洗脱条件为：0-18min 1mmol/L NaOH溶液、18.1-23min 50mmol/L NaOH溶液、23.1-30min 50-250mmol/L NaOH溶液、30.1-55min 250mmol/L NaOH溶液、55.1-70min 1mmol/L NaOH溶液。
[0089] 其中，柱箱温度为25～30℃；检测器温度为30～35℃；淋洗液流速为0.4～0.5mL/min；进样体积为20～25μL。
[0090] 此外，在上述离子色谱条件下，E2-1溶液中仅检测出阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、木二塘、木三塘、木四糖、木五糖和木六糖。
[0091] 根据色谱峰面积与糖浓度呈线性关系，将各种糖的标准物溶于超纯水中，稀释成一系列浓度梯度(0.1～2mg/L)，建立阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、木二塘、木三塘、木四糖、木五糖和木六糖的标准曲线；
[0092] 然后，基于已建立的标准曲线，根据色谱图中各种糖的峰面积、去离子水稀释倍数和乙腈稀释倍数，可计算出提取液E2中各种糖的浓度。
[0093] (4)紫外-可见光谱测定标准糖溶液的吸光度值：
[0094] 首先，将商品化的BCA试剂盒(购自于美国Thermo Scientific公司，包含TMPierce BCA ProteinAssay ReagentA和Reagent B)中A试剂和B试剂按体积比50∶1(mL∶mL)进行混合，混合试剂(称为BCA试剂)用作蛋白质和糖的显色剂；
[0095] 取醋酸-醋酸钠缓冲液(40～50mmol/L、pH 5.0～6.0)0.1mL、BCA试剂3mL于玻璃样品瓶中，将样品瓶置于37℃水浴锅中反应30min，反应后将此反应液倒入宽度为1cm的石英比色皿中，静置1min后进行紫外-可见光谱的背景扫描；
[0096] 然后，将各种糖的标准物分别溶于醋酸-醋酸钠缓冲液(40～50mmol/L、pH 5.0～6.0)中，糖的浓度范围为0.1～8g/L，取糖溶液0.1mL、BCA试剂3mL于玻璃样品瓶中，采用上述相同方法进行显色反应和紫外-可见光谱的样品扫描，记录562nm波长处的吸光度值。
[0097] 根据朗伯比尔定律，建立特定标准糖溶液的浓度及其在562nm波长处吸光度值之间的线性标准曲线：
[0098]
[0099] 其中， 为某种糖在562nm处的吸光度值； 为某种糖在562nm处的摩尔吸光系数(L/g)；CSugar为配置的某种标准糖的浓度(g/L)。
[0100] 根据测定的吸光度值和配置的糖浓度，特定糖在562nm处的摩尔吸光系数则可根据等式1进行计算 此外，经紫外-可见光谱扫描可知，仅拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖在562nm处具有吸收，木寡糖未见吸收。
[0101] (5)紫外-可见光谱测定提取液E1中花生蛋白质的浓度：
[0102] 按照步骤(4)的方法测定提取液E1中蛋白质和单糖在562nm处的总吸光度值。在特定波长(如562nm)处，根据不同物质对吸光度所产生的贡献存在叠加原理可知：
[0103]
[0104] 其中， 为混合物在562nm处吸光度值的总和； 和分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和提取出发花生蛋白在562nm处的吸光度值。
[0105] 根据步骤(3)所测定出提取液E2中各种糖的浓度及等式1，提取液E1中花生蛋白在562nm处的净吸光度值可计算如下：
[0106]
[0107] 其中， 和 分别为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖在562nm处的摩尔吸光系数(L/g)；CAra、CGal、CXyl、CGlu和CMan分别为离子色谱测定提取液E2中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的浓度(g/L)。
[0108] 通常，牛血清蛋白(BSA)常作为各种蛋白质浓度测定的标准物。
[0109] 将一定质量的BSA溶于醋酸-醋酸钠缓冲液(40～50mmol/L、pH 5.0～6.0)中，经相同的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释一定倍数，采用步骤(4)的方法测定不同浓度BSA溶液在562nm处的吸光度值，根据朗伯比尔定律建立其标准曲线，计算其摩尔吸光系数( ，L/g)。
[0110] 在未扣除单糖干扰的情况下，基于BSA的摩尔吸光系数，提取液E1中花生蛋白质浓度通常采用下式进行计算：
[0111]
[0112] 为避免单糖的干扰，结合等式3及BSA的摩尔吸光系数，提取液E1中花生蛋白质浓度可根据下式进行计算：
[0113]
[0114] 其中，CPP为脱脂花生粉提取液中水溶性花生蛋白质的浓度(g/L)； 为牛血清蛋白在562nm处摩尔吸光系数(L/g)。
[0115] 不同浓度牛血清蛋白(BSA)、葡萄糖、木糖与BCA试剂反应后的紫外-可见光谱，见图1～3。与BCA试剂反应后不同物质浓度与其吸光度值的对应关系如图4所示。
[0116] 实施例和对比例的测定条件如表1所示：
[0117] 表1在扣除单糖干扰前后不同提取液中花生蛋白质浓度的测定值
[0118]
[0119]
[0120] 注：所有对比例和实施例，所用缓冲液均为醋酸-醋酸钠缓冲液，除pH不同外，其浓度均为50mmol/L；每组实验所采用的离心转速和离心时间相同。在未扣除单糖干扰时，提取液中花生蛋白质浓度根据等式4进行计算；扣除单糖干扰时，提取液中花生蛋白质浓度根据等式5进行计算。
[0121] 从表1可知，还原性单糖的存在，对脱脂花生粉提取液样品中水溶性花生蛋白质浓度的影响非常显著，造成浓度的偏高率达到22％～50％。
