一种葛根多糖及其制备方法和用途

摘要

本发明属中药领域，涉及葛根水提物中均一多糖的制备及其降脂活性。本发明从江西道地药材——葛根中分离得到均一多糖QL经体内实验证实葛根均一多糖具有显著的降脂活性，显著降低血清甘油三酯的含量及肝脏指数，可用于开发出潜在的安全有效降脂药物。

权利要求

1.一种葛根多糖QL，其特征在于：QL是由1种单糖葡萄糖组成的均多糖，分子量为10-60 KDa；蛋白含量：0.64%；无糖醛酸；糖含量98.7%；红外光谱IR显示典型的多糖吸收峰，包括

3300cm-1左右的羟基吸收峰，957cm-1左右的糖基吸收峰，且1700cm-1无羰基吸收峰，与所测糖醛酸含量一致；通过GC-MS分析证实葛根多糖QL由葡萄糖构成，葛根多糖QL单糖组其主要连接方式为α-1,3-Glu连接、少量的Terminal-Glu末端连接，经原子力显微AFM测试发现，空间结构呈现球状特性。

2.根据权利要求1所述的葛根多糖，其特征在于：通过以下步骤制备：葛根经粉碎后，用

90℃水按固液比1:20浸提3次，过滤，将水提液浓缩至密度为1.1-1.2，再加入2倍体积的无水乙醇，过滤得沉淀以水复溶后，经过活性碳除去色素后，离心得上清液，经冻干得粗多糖；

粗多糖加蒸馏水磁力搅拌溶解，离心，将上清液加入到大孔树脂柱HP-20中进行分离，以纯水、10%乙醇、20%乙醇溶液洗脱，收集各流分，根据硫酸苯酚法显色和490 nm检测结果合并相同流分，再进行浓缩，透析及冷冻干燥得3个次级组分；取10%乙醇洗脱的次级组分，蒸馏水溶解后再用1.5 m ×2.5 cm的Sephacryl S-200柱进行分离，蒸馏水洗脱，收集各流分；

根据硫酸苯酚法显色和490 nm检测结果合并相同流分，浓缩及冷冻干燥得多糖QL。

3.根据权利要求1或2所述的一种葛根多糖QL在制备降脂类药物中的应用。

说明书

一种葛根多糖及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属中药领域，涉及多糖，具体涉及葛根均一多糖的制备方法和在制备降脂药物中的用途。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的提高，对高脂食物过多的摄入，使得高脂血症有向年轻化发展的趋势，同时这也是形成冠心病的主要危险因素之一，在对胆固醇代谢调控的相关研究中，中医药正在发挥越来越重要的作用。在临床上，针对高血脂症，主要依靠西药他汀类（如辛伐他汀等）药物进行治疗，需要长期服药并且会出现显著的副作用，如横纹肌溶解症。因此，从传统中药中寻找安全有效的降脂药具有效率性和针对性。

[0003] 葛根是豆科植物葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的干燥根。葛根盛产于中国南方山区，是江西省的道地药材，为常用的清热药，并且能够清热生津、透疹，升阳止泻之功效，具有较高的营养和药用价值，素有“南葛北参”和“南方人参”的美誉，葛根在作为药食两用的中药，在日常饮食当中也具有显著的保健及降脂效果。葛根在临床上主要用于消渴症及高血脂患者，如葛根汤、葛根芩连汤等经典的复方制剂，在降脂方面具有显著的疗效，但是其具体的药效物质不清清楚。

[0004] 本研究从葛根提取物进行体外降脂活性试验筛选时发现，其提取物具有显著的降脂活性，采取活性导向分离方法，从葛根中分离得到具有显著降脂活性的葛根多糖QL，其结构明确，制备工艺简单，安全有效。可为葛根多糖用于高血脂病症的研究提供研究基础数据，后续可用于开发安全有效的降脂药物。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供具有降脂活性的成分，具体涉及从葛根得到的均一多糖（QL）的制备方法和在制备降脂药物中的用途。

[0006] 本发明从葛根提取物中进行导向分离得到均一多糖命名为QL。经体内实验证实葛根多糖具有较好的降脂活性，可显著降低血清内甘油三酯的含量，白色的脂肪粒明显减少，可作为降脂药物进行开发。

[0007] 本发明中，所述的中药葛根是豆科（Leguminosae）植物葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。

[0008] 其中，葛根多糖QL的结构特征描述如下：QL是主要由1种单糖组成的均多糖，分子量为10-60 KDa；比旋度[α]20 D-28.0 (c 0.5，H2O)，蛋白含量：0.64%；无糖醛酸；糖含量98.7%；红外光谱IR显示典型的多糖吸收峰，包括3300cm-1左右的羟基吸收峰，957cm-1左右的糖基吸收峰，且1700 cm-1无羰基吸收峰，与所测糖醛酸含量一致；通过完全酸水解及乙酰衍生化，通过GC-MS分析发现，葛根多糖QL主要由葡萄糖构成，另外，通过甲基化反应后，封闭游离羟基，再经完全酸水解和GC-MS分析，表明葛根多糖QL-1单糖组其主要连接方式为α-
1,3-Glu连接、少量的Terminal-Glu末端连接，该连接方式同时也通过核磁数据证实，13C-NMR低场区两个典型端基碳信号为δC97.1和100.9，其中δC100.9（C-1）为α-1,3-Glu端基碳信号, δC97.1（C-1’）为Terminal-Glu端基碳信号，δC61.8 为葡萄糖C-6信号峰，未向低场移动，说明C-6位置无连接取代，其余δC 60-80为葡萄糖C2-C5信号区域。1H-NMR 也给出主要的端基氢信δH 5.38，且耦合常数J = 2.0Hz，说明是α连接，δH3.3-3.9区域为葡萄糖H2-H5信号区域。

[0009] 其中，葛根多糖（QL）通过下述方法制备：葛根经粉碎后，用90℃水按固液比1:20浸提3次，过滤，将水提液浓缩至密度1.1-1.2，再加入2倍体积浓缩液的无水乙醇，过滤得沉淀以水复溶后，经过活性碳除去色素后，离心得上清液，经冻干得粗多糖。

[0010] 粗多糖加蒸馏水磁力搅拌溶解，离心，将上清液加入到大孔树脂柱HP-20中进行分离，以纯水、10%乙醇、20%乙醇溶液洗脱，收集各流分，根据硫酸苯酚法显色和490nm检测结果合并相同流分，再进行浓缩，透析及冷冻干燥得3个次级组分L1、L2和L3。并取有显著降脂活性且产率最高的10%乙醇洗脱液L2流分进一步分离。

[0011] 将L2加蒸馏水溶解，用Sephacryl S-200柱（1.5 m ×2.5 cm）进行分离。蒸馏水洗脱，收集各流分。根据硫酸-苯酚法显色，合并相同流分，浓缩及冷冻干燥得多糖QL。

[0012] 经体体内动物实验证实，葛根多糖QL能显著降低高脂血症大鼠的肝指数，可开发出安全有效的降脂药物。

附图说明

[0013] 图1是QL的HPGPC色谱图（TSK-GEL GMPWXL 凝胶柱 (300×7.6mm)；洗脱液：0.1% NaCl；流速：1.0 mL/min， DAD 210 nm 检测）；

[0014] 图2是葛根多糖QL核磁碳谱

[0015] 图3 是葛根多糖QL核磁氢谱

[0016] 图4是单糖标准品GC-MS图[单糖依次是鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）]；

[0017] 图5是葛根多糖单糖组成（QL）GC-MS图；

[0018] 图6是葛根多糖（QL）的原子力显微图。

具体实施方式

[0019] 实施例一：葛根多糖QL的制备

[0020] 葛根药材7.0Kg粉碎，用90℃水按固液比1:20浸提3次，过滤，合并提取液，浓缩至密度为1.1-1.2；再加入2倍体积的无水乙醇，静置3h左右，过滤得沉淀，将沉淀以水复溶，加入0.1%的活性碳进行除色素后，离心，上清液浓缩至0.5-1L，冷冻干燥后即得蓬松状葛根粗多糖100-244g；称取粗多糖200g加蒸馏水磁力搅拌溶解，离心，上清液加入到大孔树脂柱HP-20中进行分离，以纯水、10%乙醇、20%乙醇溶液洗脱，收集各流份，根据硫酸-苯酚法显色和490 nm检测结果合并相同流分，再进行浓缩，透析及冷冻干燥得3个次级组分L1、L2和L3。

[0021] 将10%乙醇洗脱的L2加蒸馏水溶解，用Sephacryl S-200柱（1.5 m × 2.5 cm）进行分离；以蒸馏水为洗脱液进行洗脱，恒流泵控制流速约为0.8 mL/min，收集各流分；硫酸-苯酚法隔管显色后，490 nm下检测吸光度值，根据检测结果合并相同流分，浓缩至0.1-0.5 L，冷冻干燥得多糖QL。

[0022] 经高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）和示差检测法检测QL，为均一的多糖（附图1）。

[0023] 实施例2： 葛根多糖（QL）的结构表征

[0024] （1）分子量的测定

[0025] 采用TSK-GEL GMPWXL 凝胶柱 （300×7.6 mm），流动相为0.01 mol/L NaNO3，流速0.8 mL/min，柱温25℃，由一系列分子量的右旋糖酐做标曲，所测得的葛根多糖QL的分子量为10-60 KDa。

[0026] （2）总糖、糖醛酸、蛋白含量测定

[0027] 硫酸-苯酚法测定QL总糖含量为98.7%；

[0028] 间羟联苯法测定QL的糖醛酸含量为0.0%；

[0029] 考马斯亮蓝法测定QL的蛋白含量为0.64%；

[0030] （3）糖组成分析

[0031] QL经2.0 mol/L TFA于100°C恒温水解6h，全水解得到的产物，加入适量NaBH4进行还原，醋酐乙酰化制备成阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行气相组成分析。

[0032] QL是主要由1种单糖葡萄糖组成的均多糖，也称为葡聚糖。

[0033] （4）甲基化分析

[0034] 对QL进行甲基化，甲基化后的产物用甲酸解聚4 h，然后用2 mol/L TFA在100℃水解6 h，用NaBH4还原和醋酐乙酰化制成部分甲基化的阿尔迪醇乙酸酯衍生物，然后再进行GC-MS分析。

[0035] 结合标准图谱判断，QL主要连接方式有：为α-1,3-Glu连接、少量的Terminal-Glu末端连接，该连接方式同时也通过核磁数据证实。

[0036] 实施例3 ：体内降脂实验方法

[0037] 56只雄性Wistar大鼠购自从北京维通利华实验动物技术有限公司（8周，体质量200±20 g）。所有动物均以正常饮食，适应性喂养1周。随后，以8只大鼠作为空白对照组简称空白组（1），以正常饮食喂养，其余48只大鼠以高脂饮食（HF，普通鼠饲料88.5%中添加
1.2%胆固醇，0.3%胆酸钠，10%猪油）饲养2个月，以建立高脂血症模型。

[0038] 每半个月抽样检测大鼠血浆TG，TC，LDL-C和HDL-C水平，2个月后，全部大鼠在异氟烷麻醉下使用毛细管从眼眶静脉收集血液样品。将血样离心（4°C；4,000 r×min-1；15 min）以获得血浆样品，用试剂盒（购自中国南京建生物技术有限公司）做标准曲线，按步骤显色进行测定血浆TG，TC，LDL-C和HDL-C水平，从而判断高脂血症模型是否成功建立。

[0039] 高脂血症模型建立成功后，随机分为5组：（2）模型组；高胆固醇饮食；（3）高剂量组：高胆固醇饮食+高剂量葛根灌胃组（100mg/kg）；（4）中剂量组：高胆固醇饮食+中剂量葛根灌胃组（50mg/kg）；（5）低剂量组：高胆固醇饮食+低剂量葛根灌胃组（25 mg/kg）；（6）阳性药组：高胆固醇饮食+辛伐他汀组（8mg/kg）。灌胃给药半个月，实验前一晚上禁食，实验当天大鼠称重并记录，在异氟烷麻醉后眼眶取血后置肝素钠离心管内，血样离心（4°C；4,000 r×min-1；15 min）以获得血浆样品，用试剂盒（购自中国南京建生物技术有限公司）做标准曲线，按实验步骤测定血浆TG，TC，LDL-C和HDL-C水平。大鼠脱颈处死后取肝脏组织进行称重，肝脏指数 = 肝脏重量(g)/大鼠重量(g)的比值计算。

[0040] 结果表明，高胆固醇饮食造模成功，模型组肝脏指数明显升高，与其它组比较有显著性差异（P<0.05），葛根多糖高中低剂量组中TC、TG、LDL-C与模型组比较有显著性差异，HDL-C无显著性差异，但葛根高中低剂量（100mg, 50mg. 25mg）间无明显量效关系。结果表明，葛根多糖可显著降低高脂血症大鼠血浆中TC、TG、LDL-C含量，且葛根多糖可显著降低高脂血症大鼠的肝指数。因此，葛根多糖QL可显著降低大鼠血浆中TC、TG、LDL-C含量及肝脏指数，可作为降脂药物进行开发。

[0041] 数据分析：本次实验采用SPSS11.5版本对数据进行分析（3次重复），采用方差分析及组间Duncan多重比较方法。

[0042] 表1各处理组中高胆固醇血症大鼠总胆固醇（TC）、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)及肝指数(Liver index)的变化。

[0043]

[0044] 注：组间采用Duncan多重比较（两两比较），不同字母具有显著性差异P<0.05。