兼具抗肿瘤及载体作用的胆固醇双胍偶联物及其盐在微粒型给药制剂中的应用

摘要

本发明针对现有技术中的胆固醇双胍偶联物的制备存在副产物多，产率低，纯化困难且胆固醇双胍偶联物在包载药物时，应用范围狭窄等技术问题，提供一种胆固醇双胍偶联物及其盐、其微粒型给药制剂制备方法及应用，该胆固醇双胍偶联物及其盐可自组装成纳米粒或微粒，或者该胆固醇双胍偶联物及其盐作为载体或与其他药用辅料共用包载药物并制备成微粒型给药制剂。本发明通过乳化溶剂挥发法可以得到包封率高、稳定性好、粒径较为均匀的纳米制剂，开发潜力大。

权利要求

1.一种胆固醇双胍偶联物或其盐的自组装纳米粒的混悬液的制备方法，其特征在于，按照以下方法及配比进行制备：称取胆固醇双胍偶联物或其盐0.01‑300mg，溶于0.1‑5mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，超声或搅拌分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，即得胆固醇双胍偶联物或其盐的自组装纳米粒的混悬液；

所述胆固醇双胍偶联物的化学结构通式为：

胆固醇双胍偶联物盐的化学结构通式为：

其中，X为CnH2n、CnH2n‑O‑CmH2m、CnH2n‑S‑CmH2m或CnH2n‑S‑S‑CmH2m，n为2至22，m为1至22；Y为盐酸根、醋酸根、硫酸根、磷酸根、碳酸根或硝酸根。

2.一种包载有脂溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒或微粒的混悬液的制备方法，其特征在于，按照以下方法及配比进行制备：称取胆固醇双胍偶联物或其盐1‑

300mg以及质量为所称取的胆固醇双胍偶联物或其盐质量的0.0001‑50％的脂溶性药物，溶于0.1‑5mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，即得包载有脂溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒或微粒的混悬液；

所述胆固醇双胍偶联物的化学结构通式为：

胆固醇双胍偶联物盐的化学结构通式为：

其中，X为CnH2n、CnH2n‑O‑CmH2m、CnH2n‑S‑CmH2m或CnH2n‑S‑S‑CmH2m，n为2至22，m为1至22；Y为盐酸根、醋酸根、硫酸根、磷酸根、碳酸根或硝酸根。

3.一种包载水溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒的混悬液的制备方法，其特征在于：按照以下方法及配比进行制备：称取胆固醇双胍偶联物或其盐1‑300mg，溶于

0.1‑5mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，再将质量为所称取的胆固醇双胍偶联物或其盐质量的0.0000001‑10％的带负电的水溶性药物加入其中，再次分散均匀，即得包载水溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒的混悬液；

所述胆固醇双胍偶联物的化学结构通式为：

胆固醇双胍偶联物盐的化学结构通式为：

其中，X为CnH2n、CnH2n‑O‑CmH2m、CnH2n‑S‑CmH2m或CnH2n‑S‑S‑CmH2m，n为2至22，m为1至22；Y为盐酸根、醋酸根、硫酸根、磷酸根、碳酸根或硝酸根。

4.根据权利要求1～3任一项所述的混悬液的制备方法，其特征在于，所述水系溶液为水或溶解有水溶性辅料的水溶液。

5.根据权利要求4所述的混悬液的制备方法，其特征在于，所述水溶性辅料包括PVA、PEG、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、透明质酸或吐温80。

6.根据权利要求1～3任一项所述的混悬液的制备方法，其特征在于，所述胆固醇双胍偶联物及其盐的合成方法如下：第一步：在‑20‑10℃、不断搅拌的条件下，将胆固醇甲酰氯溶液滴加在双胺溶液中，氮气保护下室温搅拌反应12‑24h，旋蒸后的残留物，采用饱和氯化钠溶液或者去离子水洗涤，干燥，得到中间产物；

其中胆固醇甲酰氯与双胺的摩尔比大于1：10；

第二步，将中间产物、双氰胺及三氯化铁分散在溶剂中，75‑120℃、氮气保护并搅拌反应15‑24h后，离心去除红色沉淀，保留上清液，纯化上清液即可得到胆固醇双胍偶联物；

其中，所述中间产物与双氢胺的摩尔比为1：2.5‑10；所述中间产物与三氯化铁的摩尔比为1：0.3‑0.9；

第三步，于所得上清液中通入酸的气体或溶液，即得到胆固醇双胍偶联物盐。

说明书

兼具抗肿瘤及载体作用的胆固醇双胍偶联物及其盐在微粒型

给药制剂中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗肿瘤药物制剂技术领域，具体涉及一种两亲性胆固醇双胍偶联物及其盐、其制备方法及应用。

背景技术

[0002] 目前很多市售抗肿瘤药物为脂溶性药物，水溶性差，口服吸收率不高，即使部分水溶性较好的药物，通常存在给药后对肿瘤细胞的靶向性不佳的问题。而将药物制成微粒型给药制剂，尤其是纳米制剂，可以满足各种给药途径对制剂粒径的要求，还可以达到提高制剂的长循环性、靶向性、膜透过性，减少药物毒副作用等目的。

[0003] 常见抗肿瘤药物的纳米粒制剂，多采用体内可生物降解的类脂或高分子聚合物作为载体，药物被包裹在纳米粒中或吸附在纳米粒的表面。但是，采用这种载体时，纳米粒子作为异物，可能引起体内的毒副作用，因此，从安全性角度考虑，在满足载药量的前提下，载体的用量越少越好。采用本身具有抗肿瘤活性的载体，可以满足这一要求。

[0004] 胆固醇是一种生理相容性非常好的物质，对肿瘤细胞具有较高的亲和力，但是本身脂溶性强，一般作为辅助成分，用于脂质体制剂的制备。将其与某些极性大的基团相连，可以自组装成纳米粒。双胍基团极性较强，由于结构中胍基的存在而带正电。一些双胍类药物陆续被发现具有抗肿瘤活性，例如二甲双胍是广泛应用于治疗二型糖尿病的临床药物，
研究发现，二甲双胍治疗的糖尿病人群中，癌症发病率明显下降，因此二甲双胍被认为是潜在的抗癌药物。但是二甲双胍的抗肿瘤活性并不高，且水溶性强，将其制备成纳米制剂存在诸多难题。目前有很多学者尝试将双胍基团与亲脂性基团相连，制成脂质前药、药质体等
【梅兴国等，含胍基的药物的脂质前药及其药质体，授权号CN 101723857B】，获得了不错的抗肿瘤、降血糖以及减少毒副作用等效果。进一步有学者将双胍与胆固醇甲酰氯通过乙二
胺反应相连，形成偶联物，但是仅用于包载一种EGFR siRNA药物形成的纳米粒，主要采用薄膜分散‑挤出法制备，该偶联物存在于脂质双分子层中，制成的剂型实际上为脂质体【Shi K,et al.Functional LipoMET Mediates Envelope‑type Nanoparticles  to 
Combinational Oncogene Silencing and Tumor Growth Inhibition.(2017)
.Mol.Ther.25,1567‑1579.】；另外，该文献中的具体合成方法存在以下缺陷：该合成方法的第一步需要将乙二胺滴加到胆固醇甲酰氯的溶液中，在前期滴加过程中，溶液中的胆固醇
甲酰氯过量，因此先滴入的乙二胺，其两端的胺基非常容易与胆固醇甲酰氯反应，生成较多的副产物，如果反过来滴加，预期的纯度会更高；在第二步中，中间产物与双氢胺、三氯化铁的比例为1：2：3，我们实践后发现，该反应中双氰胺的比例过小，产率不高，三氯化铁的比例过大，不利于后期去除。另外其反应温度仅为70℃，反应时间较短，产率也不高，升高温度以及延长反应时间更有利于该反应的正向进行。在最终产品的纯化中，该文献中采用的是加
入盐酸水溶液，以去除过量的双氰胺和氯化铁。实践表明，这样制备出的产品在水中是粘稠的一坨，极难将杂质彻底清洗出，且每次清洗都会将部分偶联物洗掉，造成实际产率低下，得到的产物为褐色。

[0005] 该反应中的乙二胺，如果替换成不同的二胺，如丙二胺、丁二胺等，同样具有载体及抗肿瘤的双重作用，这将有利于扩大对不同性质药物的包载。相关研究尚未见报导。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术中的胆固醇双胍偶联物的制备存在副产物多，产率低，纯化困难且胆固醇双胍偶联物在包载药物时，应用范围狭窄等技术问题，提供一种胆固醇双胍
偶联物及其盐、其微粒型给药制剂制备方法及应用。

[0007] 本发明采用如下技术方案：

[0008] 胆固醇双胍偶联物及其盐的应用，该胆固醇双胍偶联物及其盐自组装成纳米粒或微粒，或者该胆固醇双胍偶联物及其盐作为载体或与其他药用辅料共用包载药物并制备成
微粒型给药制剂；所述微粒型给药剂型为药剂学范畴里，粒径在微米级别和纳米级别的剂
型，主要包括微粒、纳米粒、脂质体、乳剂、聚合物胶束；所述药物包括脂溶性药物和带负电的水溶性药物，当X(见后述)为C2H4时不包括表皮生长因子小干扰RNA(EGFR siRNA)。

[0009] 胆固醇双胍偶联物及其盐在自组装纳米粒制剂中的应用，按照以下方法及配比进行自组装纳米粒的制备：称取所述胆固醇双胍偶联物或其盐0.01‑300mg，溶于0.1‑5mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，超声或搅拌分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，即得到胆固醇双胍偶联物或其盐的自组装纳米粒混悬液。

[0010] 胆固醇双胍偶联物及其盐在脂溶性药物包载脂溶性药物纳米粒制剂、微粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束中的应用，按照以下方法及配比进行脂溶性药物包载脂溶性药物微
粒或纳米粒制剂的制备：称取所述胆固醇双胍偶联物或其盐1‑300mg以及质量为所称取的
胆固醇双胍偶联物或其盐质量的0.0001‑50％的脂溶性药物，溶于0.1‑5mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，即得到包载有脂溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的微粒或纳米粒混悬液；或者，按照以下方法进行脂溶性药物包载脂溶
性药物纳米粒制剂纳米粒、微粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束的制备：称取所述胆固醇双胍偶联物或其盐以及与所述胆固醇双胍偶联物或其盐共用的脂溶性辅料a，所述胆固醇双胍
偶联物或其盐与所述脂溶性辅料a的质量总和为1‑300mg且所述胆固醇双胍偶联物或其盐
与所述脂溶性辅料a以任意质量比共用，同时称取质量为所称取的胆固醇双胍偶联物或其
盐质量的0.0001‑50％的脂溶性药物，共同溶于0.1‑2mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，即得到包载脂溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒、微粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束纳米粒混悬液。

[0011] 胆固醇双胍偶联物及其盐在水溶性药物包载水溶性药物纳米粒、微粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束制剂中的应用，按照以下方法进行水溶性药物包载水溶性药物纳米粒制剂的制备：称取所述胆固醇双胍偶联物或其盐1‑300mg，溶于0.1‑5mL有机溶剂中，然后加入
5mL水系溶液，分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，再将质量为所称取的胆固醇双胍偶联物或其盐质量的0.0000001‑10％的带负电的水溶性药物加入其中，再次分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，即得到包载水溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒混悬液；或者，按照以下方法进行水溶性药物包载水溶性药物纳米粒、微粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束制剂的制备：称取所述胆固醇双胍偶联物或其盐以及与所述胆固醇双胍偶联物或其盐共用的脂溶
性辅料a，所述胆固醇双胍偶联物或其盐与所述脂溶性辅料a的质量总和为1‑300mg且所述
胆固醇双胍偶联物或其盐与所述脂溶性辅料a以任意质量比共用，共同溶于0.5‑2mL有机溶剂中，然后加入5mL水系溶液，分散均匀后，蒸发除去有机溶剂，再将质量为所称取的胆固醇双胍偶联物或其盐质量的0.000001‑10％的带负电的水溶性药物加入其中，再次分散均匀
后，蒸发除去有机溶剂，即得到包载水溶性药物的胆固醇双胍偶联物或其盐的纳米粒、微
粒、脂质体、乳剂或聚合物胶束混悬液。

[0012] 进一步地，所述脂溶性辅料a为脂肪酸单甘油酯、脂肪酸二甘油酯、脂肪酸三甘油酯、脂肪酸、磷脂、PLA、PLGA、PCL、mPEG－PLGA、mPEG‑PCL、mPEG‑PLA以及以上述辅料为主与小分子功能基团合成的产物中的一种或多种的混合物。

[0013] 进一步地，所述水系溶液为水或溶解有水溶性辅料的水溶液。

[0014] 进一步地，所述水溶性辅料包括PVA、PEG、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、透明质酸或吐温80。

[0015] 进一步地，所述胆固醇双胍偶联物的化学结构为：

[0016]

[0017] 所述胆固醇双胍偶联物盐的化学结构为：

[0018]

[0019] 其中，X为CnH2n、CnH2n‑O‑CmH2m、CnH2n‑S‑CmH2m或CnH2n‑S‑S‑CmH2m，n为2至22，m为1至22；

[0020] Y为盐酸根、醋酸根、硫酸根、磷酸根、碳酸根或硝酸根。

[0021] 进一步地，所述胆固醇双胍偶联物及其盐的合成方法如下：第一步：在‑20‑10℃、不断搅拌的条件下，将胆固醇甲酰氯溶液滴加在双胺溶液中，氮气保护下室温搅拌反应12‑24h，旋蒸后的残留物，采用饱和氯化钠溶液或者去离子水洗涤，干燥，得到中间产物；

[0022] 其中胆固醇甲酰氯与双胺的摩尔比大于1：10；

[0023] 第二步，将中间产物、双氰胺及三氯化铁分散在溶剂中，75‑120℃、氮气保护并搅拌反应15‑24h后，离心去除红色沉淀，保留上清液，纯化上清液即可得到胆固醇双胍偶联物；

[0024] 其中，所述中间产物与双氢胺的摩尔比为1：2.5‑10；所述中间产物与三氯化铁的摩尔比为1：0.3‑0.9；

[0025] 第三步，于所得上清液中通入酸的气体或溶液，即得到胆固醇双胍偶联物盐；如向胆固醇双胍偶联物的盐中加入等摩尔的碱，也可以得到胆固醇双胍偶联物。

[0026] 本发明提供了一种具有载药功能的胆固醇双胍偶联物微粒型给药体系，可以通过乳化溶剂挥发法制备，概括来说，基本制备步骤如下：1)将偶联物溶于有机溶剂中，如有待包载的脂溶性药物或脂溶性辅料，也一同溶于有机溶剂中；2)将水溶性辅料溶于水系溶剂
中；3)将这两个步骤得到的液体混和，得到混浊液；4)将混浊液通过超声、搅拌或高压均质等方法分散到适宜的粒径；5)通风橱中开口搅拌6‑36h，或者减压旋转蒸发去除有机溶剂。
通过上述步骤可得到单一的胆固醇双胍偶联物的微粒型给药体系，也可以得到载脂溶性药
物的体系，还可以得到与其他脂溶性载体共同载药的微粒型给药体系；5)如需包裹带负电
的水溶性药物，则将水溶性药物加入到步骤5中制得的液体中，通过搅拌孵育一段时间，即得载水溶性药物微粒型制剂体系。

[0027] 其中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO中一种或两种以上的混合溶剂；优选为二氯甲烷与乙醇的混合溶剂。

[0028] 所述水系溶剂为水或含有液体制剂中常用的稳定剂、pH调节剂等物质的水溶液。

[0029] 所述的脂溶性辅料为常用的微粒制剂载体辅料或者脂溶性抗氧化剂等辅料，如PLGA、mPEG－PLGA、AEAA‑PEG‑PLGA、脂肪酸单甘油酯、脂肪酸二甘油酯、脂肪酸三甘油酯、脂肪酸、磷脂、PEG与/或靶向作用基团修饰的上述辅料的一种或者混合物。

[0030] 所述的水溶性辅料包括PVP 1788、PEG、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407，吐温80、SDS等符合给药途径要求的辅料或增加物理稳定性或化学稳定性的辅料。

[0031] 很多药物都可以被该胆固醇双胍偶联物及其盐包载，如厚朴酚、和厚朴酚、紫杉醇、姜黄素、葫芦素、SN‑38，多西他赛、喜树碱、5‑氟尿嘧啶，阿霉素、靛玉红、IR‑780碘化物，
5‑氨基乙酰丙酸、醋酸棉酚、花氰荧光素、替尼泊苷、甲氨喋呤、冬凌草甲素、血红素、水飞蓟宾、siRNA等。

[0032] 本发明中，我们采用改进的方法偶联双胍与胆固醇，不仅降低了副产物的生成，提高目标物的产率，而且简化了目标物的纯化过程。该化合物一方面能够包载中等至强脂溶性的药物；另一方面，由于双胍基团的存在，化合物带正电，也可以通过静电吸附的方式包载带负电的水溶性药物，还有利于药物的细胞膜内转运，因此双胍胆固醇偶联物可以作为
优良的载体包载药物。另外，据文献报道，双胍衍生物的药理作用在很多方面与二甲双胍类似，比如都可以通过AMPK抑制mTOR的活性等。因此，双胍胆固醇偶联物，并不局限于用于治疗肿瘤的药物制备，由于双胍基团还有降血糖等广泛作用，因此也可以作为载体用于其他
适应症疾病的微粒型制剂的制备。

[0033] 双胍胆固醇偶联物本身可以包载药物，还可以与其他的载体配合包载药物，通常配合脂溶性较强的纳米制剂载体较为适宜，如固体脂质类、液体脂质类、PLGA(聚乳酸‑羟基乙酸共聚物)等。也可以与磷脂合用。此外，载体里还可以加入具有长循环作用的辅料，如一端为聚乙二醇(PEG)另一端为PLGA的mPEG－PLGA等辅料。同样，载体中也可以加入具有肿瘤靶向性等作用的辅料，如可靶向σ受体的氨乙基苯甲酰胺基团(AEAA)以及PEG修饰的PLGA，即AEAA‑PEG‑PLGA等。胆固醇双胍偶联物或其盐为载体的纳米粒，通过乳化溶剂挥发法可以得到包封率高、稳定性好、粒径较为均匀的纳米粒制剂，两者没有显著差别。

[0034] 从制剂学角度来说，如果能够成功制备纳米粒，那么只需要简单改变制备参数，如降低分散功率、减少有机溶剂的用量等，就可以轻松制备出粒径更大的微粒、微球等剂型。脂质体、乳剂和胶束也可以采用乳化溶剂蒸发法制备，另外，也可以将制备的纳米粒或微粒等液体制剂进行后处理，制备成凝胶剂、口服固体制剂等剂型。因此，在本发明微粒制备技术的基础上，结合常规的制剂技术，即可进一步拓宽本发明所制备的胆固醇双胍偶联物及
以其为载体的微粒的应用范围，开发潜力较大。

附图说明

[0035] 图1为应用例1‑13制剂外观图；

[0036] 图2为荷瘤鼠活体成像结果图。

具体实施方式

[0037] 为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明。

[0038] 实施例1：胆固醇双胍偶联物Big‑Chol‑1及其盐酸盐的合成

[0039] 1、中间产物的合成

[0040] (1)取6mL无水二氯甲烷加入6mL乙二胺并滴加0.3mL吡啶，配成溶液1；

[0041] (2)称取0.45g胆固醇甲酰氯加入4mL无水二氯甲烷溶解，配成溶液2；

[0042] (3)冰浴下将溶液2滴加到溶液1中，然后氮气保护下室温搅拌20h，离心吸取下层液体，加入40mL乙腈并旋蒸至干燥，用饱和氯化钠溶液洗干燥物，并干燥，得到中间产物，产率为98％，其结构式如下：

[0043]

[0044] 氢谱结果(400MHz,DMSO‑d6)：7.14(T，1H，‑N31‑H)，5.34(T，1H,＝C11‑H)，4.32(m，1H，‑O‑C17‑H)3.12(dd，2H，‑N‑C32H2‑)，2.74(T，2H，N‑C33H2‑)，0.65‑2.4(m，45H，余下的45个H)。

[0045] 2、Big‑Chol‑1及其盐酸盐的合成

[0046] (1)取中间产物236.2mg,双氰胺126.1mg，无水FeCl3 40.55mg，称好置于圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇溶解；

[0047] (2)在上述圆底烧瓶上装配冷凝管，置于90℃油浴锅中磁力搅拌，充氮气保护回流反应20h后结束；

[0048] (3)离心去除底部的红色沉淀，即得到含有Big‑Chol‑1的上清液。在上清液中通入氯化氢气体，使生成物成盐酸盐的细小沉淀，干燥后，即得终产物Big‑Chol‑1盐酸盐，产率约为92％，高纯产物可通过硅胶柱层析得到(氯仿：甲醇＝10：1)。

[0049] 其结构式如下：

[0050]

[0051] 氢谱结果(400MHz,DMSO‑d6)：7.02(s，2H，＝N40‑H,＝N39‑H,)，6.02(s,3H,‑N34H‑,‑N38H2),5.33(s，1H,＝C11‑H)，4.32(m,1H,‑O‑C17‑H)2.99(m,4H,‑C32H2‑，‑C33H2‑)，0.65‑2.5(m,45H,余下的45个H)

[0052] 碳谱结果：(100MHz,CDCl3):160.07，157.03，139.77，122.51，74.66，56.71，56.26，50.00，42.33，41.29，40.48，39.77，39.52，38.59，37.02，36.57，36.23，35.8，31.87，
28.25，28.17，24.3，23.94，22.82，22.57，21.07，19.36，18.74，11.88。

[0053] 实施例2胆固醇双胍偶联物Big‑Chol‑2及其盐酸盐的合成

[0054] 1、中间产物的合成

[0055] (1)取8mL无水二氯甲烷加入8mL丁二胺并滴加0.3mL吡啶，配成溶液1；

[0056] (2)称取0.45g胆固醇甲酰氯加入4mL无水二氯甲烷溶解，配成溶液2；

[0057] (3)冰浴下将溶液2滴加到溶液1中，然后氮气保护下室温搅拌20h，离心，取上清液，加入50mL乙腈并旋蒸至干燥，用饱和氯化钠水溶液洗干燥物，并干燥，得到中间产物，产率为97％，其结构式如下：

[0058]

[0059] 氢谱结果(400MHz，DMSO‑d6),δ(ppm)：7.04(T，1H，‑N31‑H)，5.34(T，1H,＝C11‑H)，4.30(m，1H，‑O‑C17‑H)2.94(dd，2H，‑N‑C33‑H2‑)，2.54(T，2H，N‑C36H2‑)，0.65‑2.4(m，49H，分子中余下的49个H)。

[0060] 2、终产物的合成

[0061] (1)取中间产物236.2mg,双氢胺168.1mg，无水FeCl3 40.55mg，称好置于圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇溶解；

[0062] (2)在上述圆底烧瓶上装配冷凝管，置于85℃油浴锅中磁力搅拌，充氮气保护回流反应21h后结束；

[0063] (3)离心去除底部的红色沉淀，即得到含有Big‑Chol‑1的上清液。在上清液中通入氯化氢气体，离心得到沉淀，干燥后，即得终产物Big‑Chol‑2盐，产率为90％，高纯度产物可通过硅胶柱层析得到(氯仿：甲醇＝10：1)，其结构式如下：

[0064]

[0065] 氢谱结果(400MHz,DMSO‑d6),δ(ppm)：7.85(s，2H，＝N42‑H，＝N41‑H)，7.09(s，1H，N31‑H)，5.74(s,2H,‑N40H2),5.32(s，1H,＝C11‑H)，4.30(m,1H,‑O‑C17‑H),2.96(dd,2H,‑C32H2‑)，2.75(t,2H,,‑C36H2‑),0.65‑2.4(m,49H,余下的49个H)。

[0066] 应用例1：单纯Big‑Chol‑1盐纳米粒的制备与表征

[0067] 精密称取Big‑Chol‑1盐5mg，溶于1mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(二氯甲烷与无水乙醇的体积比V:V＝4:1)，然后加入5mL超纯水，细胞粉碎机超声分散后(200W,
3min,后面皆为此条件)，旋蒸除去有机溶剂，过0.22μm孔径的滤膜，得到Big‑Chol‑1盐纳米粒混悬液，测得的Z均粒径为111.2nm，多分散系数(PDI)0.21，zeta电位+20mV，且所制备的Big‑Chol‑1盐纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。

[0068] 应用例2：包载厚朴酚的Big‑Chol‑1盐纳米粒的制备与表征

[0069] 精密称取Big‑Chol‑1盐10mg，厚朴酚5mg，溶于2mL二氯甲烷与甲醇的混合溶液中(V:V＝5:1)，然后加入10mL质量分数为1.5％的泊洛沙姆188水溶液，细胞粉碎机超声分散后，磁力搅拌12h，过0.45μm孔径的微孔滤膜，得到包载厚朴酚的Big‑Chol‑1盐纳米粒，测得Z均粒径为167.4nm，PDI为0.25，zeta电位+21.3mV，且所制备的纳米粒4℃放置6个月无显著变化，稳定性较好。

[0070] 应用例3：包载醋酸棉酚的Big‑Chol‑2盐纳米粒的制备与表征

[0071] 精密称取Big‑Chol‑2盐5mg，醋酸棉酚1mg，溶于0.8mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝3:1)，然后加入5mL质量分数为1.5％的PVA 1788水溶液，细胞粉碎机超声分散后，磁力搅拌15h，过0.45μm的滤膜，得到包载醋酸棉酚的纳米粒，测得的Z均粒径为
203.5nm，PDI为0.18，zeta电位+2.09mV。

[0072] 应用例4：包载和厚朴酚的Big‑Chol‑2盐纳米粒的制备与表征

[0073] 精密称取Big‑Chol‑1盐15mg，和厚朴酚7.5mg，单硬脂酸甘油酯5mg，溶于2mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝4:1)，然后加入15mL质量分数为1.0％的泊洛沙姆407水溶液，细胞粉碎机超声分散，旋转蒸发除去有机溶剂，过0.22μm的滤膜，得到包载和厚朴酚的纳米粒，Z均粒径为138.7nm，PDI为0.30，zeta电位+27.9mV。

[0074] 应用例5：Big‑Chol‑2盐脂质微粒的制备与表征

[0075] 精密称取Big‑Chol‑2盐500mg，棕榈酸脂肪酸甘油酯250mg，溶于1mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝3:1)，然后加入5mL超纯水中，搅拌分散后，旋蒸除去有机溶剂，得到Big‑Chol‑2盐脂质微粒，Z均粒径为2217.6nm，PDI为0.35。

[0076] 应用例6：包载阿霉素的Big‑Chol‑1盐脂质体的制备与表征

[0077] 精密称取Big‑Chol‑1盐7.5mg，阿霉素1.5mg，大豆磷脂15mg，胆固醇2mg，溶于3mL氯仿与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝6:1)，然后加入20mL质量分数为2.0％的吐温80水溶液，细胞粉碎机超声分散，磁力搅拌14h，过0.45μm的滤膜，得到包载阿霉素的脂质体混悬液，Z均粒径为124.6nm，PDI为0.31，zeta电位+28.6mV。

[0078] 应用例7：包载STAT‑siRNA的Big‑Chol‑1盐纳米粒的制备与表征

[0079] 精密称取Big‑Chol‑1盐50mg溶于2.0mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝4:1)，然后加入10mL质量分数为1.5％的PVA1788水溶液，细胞粉碎机超声分散后，磁力搅拌
12h，挥发掉有机溶剂，过0.45μm的滤膜，得到纳米粒混悬液，然后加入1微克的STAT‑siRNA，涡旋混合10s，静置1h，即得到包载siRNA的Big‑Chol‑1盐纳米粒混悬液。其Z均粒径为
126.3nm，PDI为0.23，zeta电位+25.3mV。

[0080] 应用例8：包载SN‑38的Big‑Chol‑2盐纳米粒的制备与表征

[0081] 精密称取Big‑Chol‑2盐5mg，SN‑38(7‑乙基‑10‑羟基喜树碱)1mg，溶于1mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝4:1)，然后加入5mL质量分数为1.5％的PVA1788水溶液，细胞粉碎机超声分散后，磁力搅拌12h，过0.45μm的滤膜，得到包载SN‑38的Big‑Chol‑2盐纳米粒混悬液，Z均粒径为130.7nm，PDI为0.28，zeta电位+24.0mV。

[0082] 应用例9：包载多西他赛Big‑Chol‑1盐PEG‑PLA胶束的制备与表征

[0083] 精密称取Big‑Chol‑1盐2mg，多西他赛1mg，PEG3.5K‑PLA2K 10mg溶于1mL三氯甲烷与甲醇的混合溶液中(V：V＝4:1)，然后加入5mL质量分数为1.5％的PVA1788水溶液，搅拌均匀，然后用细胞粉碎机超声分散，磁力搅拌12h，过0.45μm的滤膜，得到包载多西他赛的胶束混悬液。Z均粒径为102.9nm，PDI为0.21，zeta电位+32.5mV。

[0084] 应用例10：含有厚朴酚、Big‑Chol‑1盐及PLGA的纳米粒的制备与表征

[0085] 精密称取Big‑Chol‑1盐3mg、厚朴酚2mg，PLGA9k 5mg，溶于1mL二氯甲烷：无水乙醇的有机相中(V:V＝4:1)，待溶解完全后，加入质量分数为2％泊洛沙姆188水溶液5ml，细胞粉碎机超声分散后，通风橱中开口磁力搅拌12h，过0.45μm的滤膜，得到含有厚朴酚的纳米粒混悬液，Z均粒径为112nm，PDI为0.20，zeta电位+20.5mV。

[0086] 应用例11：含有厚朴酚、Big‑Chol‑1盐和mPEG‑PLGA的纳米粒的制备与表征

[0087] 称取Big‑Chol‑1盐3mg，厚朴酚2mg，mPEG3.5k‑PLGA9k 5mg，溶于1mL二氯甲烷：无水乙醇(V:V＝3:1)的有机相中，待溶解完全后，加入质量百分数为2％泊洛沙姆407水溶液5ml，细胞粉碎机超声分散后，磁力搅拌12h，过0.22μm的滤膜，得到含有厚朴酚、Big‑Chol‑1盐及mPEG‑PLGA的纳米粒混悬液，Z均粒径为115nm，PDI为0.18，zeta电位+18.5mV。

[0088] 应用例12：含有厚朴酚、Big‑Chol‑1盐及AEAA‑PEG‑PLGA的纳米粒的制备与表征[0089] 称取Big‑Chol‑1盐3mg，厚朴酚2mg，mPEG3.5K‑PLGA9k 1.0mg，AEAA‑PEG3.5K‑PLGA9k 4.0mg，溶于1mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝4:1)，加入5ml质量百分数为
1.5％的PVA1788水溶液，冰浴下细胞粉碎机超声分散，磁力搅拌14h，过0.22μm滤膜，得到最终制剂。其Z均粒径为120nm，PDI为0.22，zeta电位+14.5mV。

[0090] 其中AEAA‑PEG3.5K‑PLGA9K的合成方法为：称取0.5g对甲氧基苯甲酰氯和0.66g 2‑溴乙胺氢溴酸盐分别溶解于5mL乙腈中，混合，加入1.74mL N,N‑二异丙基乙胺,磁力搅拌下室温避光反应6h。将400mg BOC‑PEG3.5K‑NH2加入到上述体系中，磁力搅拌下反应12h。将反应液滴加到40mL冰乙醚中，离心，将沉淀干燥，加少量水溶解，用3KD的超滤管超滤，将残留液冻干，加入4.5mL 33％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，磁力搅拌下反应2h，旋蒸，残留物中加入5mL二氯甲烷溶解，冷乙醚沉降，离心，干燥，称重。上步干燥产物中加入5mL二氯甲烷溶解，再称取与该产物等摩尔质量的PLGA9K‑COOH，加入5mL DCM中溶解，两者混合，分别加入20倍摩尔质量的DIPEA以及N,N'‑二异丙基碳二亚胺，室温搅拌48h。滴加于冷乙醚中沉降，离心，干燥后得到终产物AEAA‑PEG3.5K‑PLGA9K。

[0091] 应用例13：Big‑Chol‑2盐乳剂的制备与表征

[0092] 精密称取Big‑Chol‑2盐5mg，大豆油10mg,大豆磷脂2mg，溶于0.8mL二氯甲烷与无水乙醇的混合溶液中(V:V＝5:1)，然后加入5mL质量百分数为1.5％的泊洛沙姆188，搅拌30min，细胞粉碎机超声分散后，旋蒸除去有机溶剂，过0.22μm孔径的滤膜，得到Big‑Chol‑2盐乳剂，测得的Z均粒径为120.2nm，PDI为0.19，zeta电位+19mV。

[0093] MTT法测定应用例1所制备的单纯Big‑Chol‑1盐纳米粒对人乳腺癌MCF‑7细胞活性影响

[0094] 取对数期生长的MCF‑7细胞，经胰蛋白酶消化后接种到96孔板上，每孔150mL，8×3
10个细胞。待细胞培养24h后，除去旧的培养液后加药。每孔200μL，分别设置空白对照组和不含细胞的调零组，每组设置6个浓度，分别为5，10，15，20，25，30和35μg/mL，每个浓度设置
6个复孔，采用MTT法，测定药物制剂与细胞共培养24h的细胞抑制率。结果显示，随浓度升高，应用例1所制备的单纯Big‑Chol‑1盐纳米粒对MCF‑7细胞的细胞毒性增加，IC50值约为
25.7μg/mL。

[0095] MTT法测定应用例13所制备的Big‑Chol‑2盐乳剂对人食管癌ECA‑109细胞活性影响

[0096] 取对数期生长的ECA‑109细胞，经胰蛋白酶消化后接种到96孔板上，每孔150mL，83
×10个细胞。待细胞培养24h后，除去旧的培养液后加药。每孔200μL，分别设置空白对照组和不含细胞的调零组，Big‑Chol‑2的实验组，每组设置6个浓度，分别为1.56，3.12，6.25，
12.5，25，50，100和105μg/mL，每个浓度设置6个复孔，采用MTT法，测定药物制剂与细胞共培养24h的细胞抑制率。结果显示，随浓度升高，应用例13所制备的Big‑Chol‑2盐乳剂对ECA‑
109细胞的细胞毒性增加，IC50值约为98.7μg/mL。

[0097] 制剂体内药效学研究

[0098] 此处以应用例1，10，11，12为例，说明制剂的药效优势。从‑80℃冰箱中取出冻存的S180细胞，快速放置于37℃水浴中解冻后，接种于雄性昆明种小鼠腹腔中。一周后用10mL注射器抽取荷瘤小鼠腹水，每只小鼠吸取0.2mL腹水接种于雄性昆明种小鼠右腋窝皮下。将体重与肿瘤体积相近的小鼠分为6组，每组6只。具体实验分组如下：(1)5％葡萄糖溶液对照组；(2)应用例1；(3)厚朴酚溶液组；(4)应用例10；(5)应用例11；(6)应用例12，采用尾静脉注射方式给药，隔天给药，每组给药总剂量均为5mg/kg(制剂中如同时含有BIG‑Chol‑1盐和厚朴酚，则两者的比例为3：2)，共给药7次。每日测量体重，观察一般状态，末次给药后次日，处死小鼠，剥取瘤组织。计算瘤重抑瘤率＝(1‑给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)。

[0099] 结果表明，上述各组的体重均无显著差异，小鼠状态较好，说明制剂的毒性较低。与对照组1相比，2‑6组的瘤重抑瘤率分别为68％、25％，57％，87％和93.12％，这一方面说明Big‑Chol‑1盐纳米粒自身对S180肿瘤具有抑制作用，同时也说明以本发明制备的Big‑Chol‑1盐作为载体，包载厚朴酚制成长循环或σ受体靶向纳米粒后，均有助于提高厚朴酚的治疗效果。

[0100] 包裹IR780碘化物的纳米粒的制备及活体成像实验

[0101] 称取Big‑Chol‑1盐6mg,IR780溶液0.2mg/ml，溶于0.5mL体积比4：1的二氯甲烷与无水乙醇的有机相中，加入2ml质量分数为1.5％的PVA溶液作为乳化剂，冰浴探超，磁力搅拌，过0.45um滤膜，得到最终制剂IR780‑NP组。

[0102] 称取PLGA9k 4mg，Big‑Chol‑1盐2mg，IR780溶液0.2mg/ml，溶于0.5mL体积比4：1二氯甲烷与无水乙醇的有机相中，加入2ml质量分数为1.5％的PVA水溶液，探超，开口磁力搅拌12h,过0.45um滤膜，得到最终制剂PLGA‑IR780‑NP组。

[0103] 称取mPEG3.5k‑PLGA9k 4mg，Big‑Chol‑1盐2mg，IR780溶液0.2mg/ml，溶于0.5mL体积比4：1二氯甲烷与无水乙醇的有机相中，加入2ml质量分数为1.5％的PVA水溶液，探超，开口磁力搅拌12h，过0.45um滤膜，得到最终制剂MPEG‑PLGA‑IR780‑NP组。

[0104] 称取mPEG3.5‑PLGA9k 0.8mg，AEAA‑PEG3.5k‑PLGA9k3.2mg，Big‑Chol‑1盐2mg，IR780溶液0.2mg/ml，溶于0.5mL体积比4：1二氯甲烷与无水乙醇的有机相中，加入2ml质量分数为1.5％的PVA水溶液，探超，开口磁力搅拌12h，过0.45um滤膜，得到最终制剂AEAA‑MPEG‑PLGA‑IR780‑NP组。

[0105] 将乳腺接种好4T1肿瘤的BALC小鼠按照体重与肿瘤体积的大小进行分组，每组2只。分别在给药后1h、4h、8h、12h、24h进行拍摄。设置激发波长为770nm，发射波长830nm，曝光时间20s。具体实验分组如下：(A)IR780‑NP组；(B)PLGA‑IR780‑NP组；(C)mPEG‑PLGA‑IR780‑NP组，(D)AEAA‑PEG‑PLGA‑IR780‑NP组。以IR‑780碘化物的注射浓度为5mg/kg的剂量，尾静脉注射给药，小动物成像仪拍照前用10％(M/V)水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。结果见附图2。从活体成像结果上可以看出考察的几组制剂，均可靶向于肿瘤部位，而且即使在给药24h后，仍有较强荧光。

[0106] 以上试验表明，以胆固醇双胍偶联物作为载体使用，结合本发明提供的制剂技术，可以包裹多种药物，形成纳米粒制剂等微粒型制剂，制剂制备方法简单，适用的药物范围广，稳定性好，且有助于提高所包载的药物的靶向作用效果，是制剂领域的一大进步。

[0107] 最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发
明权利要求保护的范围之内。