一种腺苷七肽及其制备菌株转让专利
申请号 : CN201911127892.0
文献号 : CN111018950B
文献日 : 2022-01-04
发明人 : 周晓容 , 杨飞云 , 肖融 , 刘作华
申请人 : 重庆市畜牧科学院
摘要 :
本发明涉及一种氨基酸序列为MATINAN的腺苷七肽，该七肽具有较强的耐热、耐胃蛋白酶、胰蛋白酶及糜蛋白酶的生物学特性，稳定性高，且抑菌活性强。本发明还提供了一种获得耐热耐蛋白酶菌株的高通量筛选方法，筛选出一种能产生上述七肽的约氏乳杆菌株，该约氏乳杆菌株于2019年10月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.18695，具有抗逆性好、分泌量高的优势，成本低，为畜牧饲料、化妆品、保健品等领域产业化大规模制备腺苷七肽奠定了重要的基础。
权利要求 :
1.一种腺苷七肽，其特征在于：氨基酸序列为MATINAN。
2.一种约氏乳杆菌菌株，其特征在于：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2019年10月16日，保藏号为CGMCC No.18695。
3.权利要求2所述的约氏乳杆菌菌株在制备权利要求1所述的腺苷七肽中的应用。
4.权利要求1所述的腺苷七肽的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的菌株于MRS培养基活化18‑24小时，然后接种于发酵培养基，经过至少三个批次发酵培养，可获得产量为0.9‑1.1g/L的腺苷七肽。
5.如权利要求4所述的腺苷七肽的制备方法，其特征在于：每1000mL发酵培养基的成分为：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰
0.25g、pH6.2‑6.6；发酵条件为温度25‑37℃，溶氧≤5%。
说明书 :
一种腺苷七肽及其制备菌株
技术领域
[0001] 本发明涉及一种腺苷七肽及其产生菌株，属于生物技术领域。技术背景
[0002] 约氏乳杆菌是一种安全无害的益生菌，可以用来发酵饲料、食品以及作为益生菌调节肠道健康，提高动物或人体免疫力。抗菌肽是生物体产生的与宿主防御和先天免疫相
关的小分子多肽，一般由5‑50个氨基酸组成。抗菌肽具有抑制杀灭病原体、促进免疫、促进
伤口愈合和粘膜防御等功能。
关的小分子多肽，一般由5‑50个氨基酸组成。抗菌肽具有抑制杀灭病原体、促进免疫、促进
伤口愈合和粘膜防御等功能。
[0003] 腺苷七肽(又名杆菌七肽、microcin C7肽)是由肠杆菌属、乳杆菌属等微生物分泌的一种细菌素类抗菌肽，由7个氨基酸残基组成，C端通过N‑酰磷酰胺键与5'‑磷酸腺苷
(AMP)所结合形成小分子量抗菌肽，具有抗菌能力强，调节免疫的功能，是潜在的抗生素替
代品(冉仁森，中国科学院大学，硕士学位论文，2017)。腺苷七肽的N端的蛋氨酸(Met)残基
和C端的谷氨酰胺(Asn)为其保守序列，不同的微生物分泌的杆菌七肽中间的五个氨基酸残
基有所差异，抗菌效果和抗逆性也有所不同。其中，约氏乳杆菌(Lactococcus johnsonii
NCC533)分泌的腺苷七肽序列为MHRIMKN(Olga Bantysh，Mbio，2014 Volume 5 Issue 3)。
野生型约氏乳杆菌分泌的腺苷七肽对胃蛋白酶、胰蛋白酶以及热处理耐受性差，分泌量少，
故用野生型约氏乳杆菌生产腺苷七肽安全性好，但生物稳定性差，且生产成本高，不能实现
大规模产业化。
(AMP)所结合形成小分子量抗菌肽，具有抗菌能力强，调节免疫的功能，是潜在的抗生素替
代品(冉仁森，中国科学院大学，硕士学位论文，2017)。腺苷七肽的N端的蛋氨酸(Met)残基
和C端的谷氨酰胺(Asn)为其保守序列，不同的微生物分泌的杆菌七肽中间的五个氨基酸残
基有所差异，抗菌效果和抗逆性也有所不同。其中，约氏乳杆菌(Lactococcus johnsonii
NCC533)分泌的腺苷七肽序列为MHRIMKN(Olga Bantysh，Mbio，2014 Volume 5 Issue 3)。
野生型约氏乳杆菌分泌的腺苷七肽对胃蛋白酶、胰蛋白酶以及热处理耐受性差，分泌量少，
故用野生型约氏乳杆菌生产腺苷七肽安全性好，但生物稳定性差，且生产成本高，不能实现
大规模产业化。
[0004] 传统筛选目的菌株的方法工作量大、耗时长，专利CN 109400685 A采用Quickchange方法进行腺苷七肽改造，需要宿主是大肠杆菌，且仅能筛选到耐受胰蛋白酶的
菌株，无法对约氏乳杆菌基因进行快速改造。
菌株，无法对约氏乳杆菌基因进行快速改造。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种具有较高耐热性、耐肠液和胃液效果的腺苷七肽，本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0006] 一种腺苷七肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为MATINAN。
[0007] 上述腺苷七肽经100IU//ml胃蛋白酶或/和100IU/ml胰蛋白处理后或/和100IU/ml糜蛋白和/或95℃高温处理后，含量下降低于10.0％，抑菌效果下降低于10.0％；与野生型
七肽或其他氨基酸序列的七肽相比，具有较强的耐热、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶的生物学特
性，且抑菌活性强。
七肽或其他氨基酸序列的七肽相比，具有较强的耐热、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶的生物学特
性，且抑菌活性强。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种菌株，该菌株可用于制备上述腺苷七肽，且能够实现高产。
[0009] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0010] 一种约氏乳杆菌株(Lactobacillus johnsonii)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区)，保藏日期是2019年10月16日，保藏号为CGMCC
No.18695。
No.18695。
[0011] 上述菌株，用于制备上述腺苷七肽。
[0012] 上述菌株，经100IU//ml胃蛋白酶或/和100IU/ml胰蛋白处理后或/和100IU/ml糜蛋白和/或95℃高温处理后，发酵液中腺苷七肽含量下降低于10.0％，抑菌效果下降低于
10.0％。
10.0％。
[0013] 本发明的还提供了一种上述菌株的高通量筛选方法，包括以下措施：
[0014] 一种上述菌株的高通量筛选方法，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶作为筛选试剂，筛选时间20‑40min。
[0015] 上述高通量筛选方法，筛选温度为95℃，筛选时间为10‑20min。
[0016] 上述高通量筛选方法，步骤如下：
[0017] 1.获得单个菌株培养上清：将菌株库培养涂布于MRS琼脂，将平板上长出的菌落接种于细胞孔板，培养24小时，获得上清；
[0018] 2.检测菌株耐热及耐蛋白的性能：在细胞孔板中，每孔加入终浓度为100IU/ml的胃蛋白酶，pH＝4.5‑7.0，处理后再加入终浓度为100IU/ml的胰蛋白酶和终浓度为100IU/ml
的糜蛋白酶(pH＝6.5‑7.5)处理；95℃处理15‑20min进行耐热性筛选；
的糜蛋白酶(pH＝6.5‑7.5)处理；95℃处理15‑20min进行耐热性筛选；
[0019] 3.检测菌株抑菌效果：灭活蛋白酶，每个孔中加入肉汤培养基及指示菌，培养16h后，OD580值<0.1的菌株为抑菌性能稳定且耐高温耐蛋白酶的菌株。
[0020] 本发明还提供了一种制备上述腺苷七肽的方法。该目的是通过以下措施实现的：
[0021] 一种上述腺苷七肽的制备方法，将上述菌株于MRS培养基活化18‑24小时，然后接种于发酵培养基，经过至少三个批次发酵培养，可获得产量为0.9‑1.1g/L的腺苷七肽。
[0022] 上述制备方法，每1000mL发酵培养基的成分为：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、pH 6.2‑6.6。
[0023] 上述制备方法的发酵条件为：温度25‑37℃，溶氧≤5％。
[0024] 有益效果：
[0025] 1.本发明公开了一种腺苷七肽，稳定性高，具有较强的耐热、耐胃蛋白酶和胰蛋白酶的生物学特性，与现有的野生型七肽及其他氨基酸序列的七肽相比，具有更强的抗菌效
果和抗逆性。
果和抗逆性。
[0026] 2.本发明提供了一种制备上述腺苷七肽的菌株，具有抗逆性好、分泌量高的优势，成本低，为畜牧饲料、化妆品、保健品等领域产业化大规模制备腺苷七肽奠定了重要的基
础。
础。
[0027] 3.本发明提供了一种获得上述菌株的高通量筛选方法，可快速准确从突变库中筛选到耐热耐蛋白酶的目的菌株，该方法不仅可用于上述菌株的筛选，其他耐热或耐蛋白的
菌株也可用该方法快速准确获得。
菌株也可用该方法快速准确获得。
[0028] 4.本发明提供了一种上述腺苷七肽的制备方法，采用上述菌株在特制培养基中进行三个批次发酵培养，可获得产量为0.9‑1.1g/L的腺苷七肽，为野生型菌株产量的13‑18
倍，可实现大规模产业化的生产。
附图说明：
倍，可实现大规模产业化的生产。
附图说明：
[0029] 图1是高通量筛选过程图
[0030] 图2是野生型以及不同突变株发酵液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(WT为野生型，对照为无菌水，M1‑M4为不同突变株)
[0031] 图3是人工肠液处理各菌株发酵液上清液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(右为处理前，左为处理90min后各菌株上清液抑菌圈)
[0032] 图4是人工胃液处理各菌株发酵液上清液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(右为处理前，左为处理90min后各菌株上清液抑菌圈)
[0033] 图5是90℃水浴热处理各菌株发酵液上清液对大肠杆菌CGMCC44102的抑菌圈(右为处理前，左为处理15min后各菌株上清液抑菌圈)
[0034] 图6是色谱图(A腺苷七肽M1纯品图谱，B腺苷七肽M1发酵液图谱，C野生型纯品图谱,，D野生型发酵液图谱)
[0035] 图7是人工胃液、肠液处理腺苷七肽纯品M1、WT纯品的抑菌圈(M1、WT1为腺苷七肽纯品M1、WT形成的抑菌圈，CK为无菌水对照。M1‑1为人工胃液处理腺苷七肽M1，M1‑2为人工
肠液处理腺苷七肽M1；WT‑1为人工胃液处理WT，WT‑2为人工肠液处理WT，以上处理时间为
30min)
具体实施方案
肠液处理腺苷七肽M1；WT‑1为人工胃液处理WT，WT‑2为人工肠液处理WT，以上处理时间为
30min)
具体实施方案
[0036] 一、建立菌株库
[0037] 将野生型约氏乳杆菌在MRS肉汤培养基中培养10小时，达到对数生长前中期，采用紫外线照射120s，然后4mg/L亚硝基胍(NTG)处理30min进行联合诱变，构建菌株库。
[0038] 二、高通量筛选：筛选过程如图1所示。
[0039] 1.获得单个菌株培养上清：首先将菌株库培养涂布于MRS琼脂，使其每个平板约长出100个菌落，用灭菌牙签挑单菌落接种于96孔板(每个孔含有100μL培养基，其培养基成份
为MRS不加吐温和柠檬酸氢二铵)或48孔板或24孔板，培养24h后，离心，吸取100ul上清液到
另一96孔板。
为MRS不加吐温和柠檬酸氢二铵)或48孔板或24孔板，培养24h后，离心，吸取100ul上清液到
另一96孔板。
[0040] 2.检测菌株的耐热及耐蛋白性能：每孔加入终浓度为100IU/ml的胃蛋白酶，环境pH＝4.5‑7.0，处理20‑40min，优选30min；处理后加入终浓度为100IU/ml的胰蛋白酶和终浓
度为100IU/ml的糜蛋白酶，环境pH＝6.5‑7.5，处理20‑40min，优选30min(所用的HCl、NaOH
以及蛋白酶配置好后用0.22um滤膜过滤，使其达到无菌状态)，然后95℃处理10‑20min，优
选15min，进行耐热性筛选。
度为100IU/ml的糜蛋白酶，环境pH＝6.5‑7.5，处理20‑40min，优选30min(所用的HCl、NaOH
以及蛋白酶配置好后用0.22um滤膜过滤，使其达到无菌状态)，然后95℃处理10‑20min，优
选15min，进行耐热性筛选。
[0041] 3.检测菌株抑菌效果：同时灭活蛋白酶，每个孔中加入MH肉汤培养基(96孔板，每6
孔加入100μL)，加入大肠杆菌CGMCC44102(活菌数10CFU/mL)，培养16h后，用酶标仪测定
OD580，其OD值<0.1为抑制大肠杆菌生长的菌株，从中筛选出后进行验证。从38400株菌株中
筛选到4株耐蛋白酶和高温的菌株，其中M1的抑菌效果最好(图2)，作为其筛选出的目的菌
株。相同培养条件，菌株M1‑4发酵液的抑菌圈直径比野生型都有不同程度的提高。
孔加入100μL)，加入大肠杆菌CGMCC44102(活菌数10CFU/mL)，培养16h后，用酶标仪测定
OD580，其OD值<0.1为抑制大肠杆菌生长的菌株，从中筛选出后进行验证。从38400株菌株中
筛选到4株耐蛋白酶和高温的菌株，其中M1的抑菌效果最好(图2)，作为其筛选出的目的菌
株。相同培养条件，菌株M1‑4发酵液的抑菌圈直径比野生型都有不同程度的提高。
[0042] 三、各菌株核酸序列和氨基酸序列的确定。根据GenBank公布的约氏乳杆菌mccA序列以及上下游序列，在mccA上下游约50bp处设计引物P1和P2，通过PCR方法克隆各菌株的
mccA序列，其DNA扩增体系为50μL：2.5U/μL Taq酶，1μL；10×反应缓冲液，5μL；引物，各1μL；
模板，1μL；10mM dNTP，1μL；ddH2O，40μL，扩增条件为：变性，94℃，0.5min；退火55℃，
0.5min；延伸72℃，20s。所获得M1‑M4序列经过测序后，得到DNA序列及氨基酸序列如下：
mccA序列，其DNA扩增体系为50μL：2.5U/μL Taq酶，1μL；10×反应缓冲液，5μL；引物，各1μL；
模板，1μL；10mM dNTP，1μL；ddH2O，40μL，扩增条件为：变性，94℃，0.5min；退火55℃，
0.5min；延伸72℃，20s。所获得M1‑M4序列经过测序后，得到DNA序列及氨基酸序列如下：
[0043]
[0044] 四、菌株发酵液的抗逆性验证：
[0045] 人工胃液按照如下配制：取稀盐酸16.4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水定容成1000ml，pH值调至4.5‑6.5。人工肠液按照如下配制：取磷酸二氢钾6.8g，加水
500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶(含胰蛋白酶及糜蛋白
酶)10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml。取约氏乳杆菌发酵液(其培养
基成份为MRS不加吐温和柠檬酸三铵)样品1.0ml：①定溶于10mL人工肠液，其中胰蛋白酶的
终浓度为100IU/ml，糜蛋白酶的终浓度为100IU/ml，环境pH值为6.5‑7.5；②或定溶于10mL
人工胃液中，其中胃蛋白酶的终浓度为100IU/ml，环境pH值为4.5‑7.0。开始计时，分别在
30、60、120min不同时间点取样加酸或碱中和pH＝7.0，再95℃处理10‑20min，优选15min灭
活蛋白酶，然后梯度稀释，以CGMCC44102指示菌进行抑菌试验，每个试验两个重复。取发酵
液样品10mL，定容于100mL无菌水中，分成4份为1‑4号样，每份20mL，1‑3号样分别与75、85、
95℃水浴处理15min，4号样为对照室温放置。以大肠杆菌CGMCC44102为指示菌进行抑菌试
验。每个试验两个重复。由于抑菌圈的直径的平方与抗菌物质的效价对数成正比，故抗逆性
试验通过可以抑菌圈的直径来确定发酵液中腺苷七肽的效价。通过高通量筛选，所得突变
株发酵液对蛋白酶的耐受性明显增加,其中，M1的抗逆性和抑菌性最强，经人工胃液及人工
肠液处理后其抑菌圈的直径基本不发生变化(<10.0％)，而野生型的抑菌圈处理30min后明
显减小，处理60min后不具有抑菌作用(表1，2，图3，图4)，而且耐热性明显提高(表3，图5)。
采用高通量筛选所得突变株的发酵液抑菌圈直径明显大于野生型，突变后抑菌能力增强，
耐受性提高。
500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶(含胰蛋白酶及糜蛋白
酶)10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml。取约氏乳杆菌发酵液(其培养
基成份为MRS不加吐温和柠檬酸三铵)样品1.0ml：①定溶于10mL人工肠液，其中胰蛋白酶的
终浓度为100IU/ml，糜蛋白酶的终浓度为100IU/ml，环境pH值为6.5‑7.5；②或定溶于10mL
人工胃液中，其中胃蛋白酶的终浓度为100IU/ml，环境pH值为4.5‑7.0。开始计时，分别在
30、60、120min不同时间点取样加酸或碱中和pH＝7.0，再95℃处理10‑20min，优选15min灭
活蛋白酶，然后梯度稀释，以CGMCC44102指示菌进行抑菌试验，每个试验两个重复。取发酵
液样品10mL，定容于100mL无菌水中，分成4份为1‑4号样，每份20mL，1‑3号样分别与75、85、
95℃水浴处理15min，4号样为对照室温放置。以大肠杆菌CGMCC44102为指示菌进行抑菌试
验。每个试验两个重复。由于抑菌圈的直径的平方与抗菌物质的效价对数成正比，故抗逆性
试验通过可以抑菌圈的直径来确定发酵液中腺苷七肽的效价。通过高通量筛选，所得突变
株发酵液对蛋白酶的耐受性明显增加,其中，M1的抗逆性和抑菌性最强，经人工胃液及人工
肠液处理后其抑菌圈的直径基本不发生变化(<10.0％)，而野生型的抑菌圈处理30min后明
显减小，处理60min后不具有抑菌作用(表1，2，图3，图4)，而且耐热性明显提高(表3，图5)。
采用高通量筛选所得突变株的发酵液抑菌圈直径明显大于野生型，突变后抑菌能力增强，
耐受性提高。
[0046] 表1人工肠液处理发酵液对大肠杆菌CGMCC44102抑菌活性的影响
[0047]
[0048] —表示无明显抑菌圈，下同
[0049] 表2人工胃液处理发酵液对大肠杆菌CGMCC44102抑菌活性的影响
[0050]
[0051] 表3热处理发酵液对大肠杆菌CGMCC44102抑菌活性的影响
[0052]
[0053] 五、从约氏乳杆菌M1中获得腺苷七肽
[0054] 将约氏乳杆菌M1在MRS培养基活化后，连续传代三个批次发酵液定量测定其腺苷七肽，其腺苷七肽的含量为0.98g/L、0.93g/L、1.10g/L，而野生型的发酵液中腺苷七肽的含
量为0.06、0.07、0.06g/L(发酵培养基成分如下：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、
磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL、pH 6.2‑6.6、温度：35‑37℃，
溶氧≤5％)。突变株的腺苷七肽的分泌量是野生型菌株的13‑18倍。经过三个批次发酵液腺
苷七肽含量稳定，证明此菌株具有良好的遗传稳定性，其产生的腺苷七肽可以进行产业化。
2.发酵液腺苷七肽的含量测定方法如下：按M1菌株的腺苷七肽氨基酸序列，在生物公司采
用化学法分别合成腺苷七肽M1和野生型菌株腺苷七肽WT(南京金斯瑞)纯品(99％)，以纯品
为标准，测定发酵液中腺苷七肽的含量。其方法如下：用反相色谱柱：C18(4.6×250mm)；洗
脱液：流动相A(0.1％三氟乙酸)、流动相B(90％乙腈)按表4进行洗脱。所设的参数应为：柱
温：25℃，检测波长：260nm；最大压力：200bar。
量为0.06、0.07、0.06g/L(发酵培养基成分如下：蛋白胨15.0g、酵母膏10.0g、葡萄糖20.0g、
磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL、pH 6.2‑6.6、温度：35‑37℃，
溶氧≤5％)。突变株的腺苷七肽的分泌量是野生型菌株的13‑18倍。经过三个批次发酵液腺
苷七肽含量稳定，证明此菌株具有良好的遗传稳定性，其产生的腺苷七肽可以进行产业化。
2.发酵液腺苷七肽的含量测定方法如下：按M1菌株的腺苷七肽氨基酸序列，在生物公司采
用化学法分别合成腺苷七肽M1和野生型菌株腺苷七肽WT(南京金斯瑞)纯品(99％)，以纯品
为标准，测定发酵液中腺苷七肽的含量。其方法如下：用反相色谱柱：C18(4.6×250mm)；洗
脱液：流动相A(0.1％三氟乙酸)、流动相B(90％乙腈)按表4进行洗脱。所设的参数应为：柱
温：25℃，检测波长：260nm；最大压力：200bar。
[0055] 表4高效液相洗脱条件
[0056]
[0057] 纯品溶于水中，上样测定纯品的出峰时间，然后发酵液上样。外标法以峰面积和浓度(上样量一致)成正比计算，采用下列公式计算含量：
[0058] 式中AX为发酵液腺苷七肽的峰面积；CX为发酵液中腺苷七肽的含量(μg/g)；AR为对照品的峰面积：CR为对照品
的浓度(μg/mL)。M1腺苷七肽纯品和发酵液图谱为图6A、6B，野生型纯品和发酵液图谱6C、
6D。
的浓度(μg/mL)。M1腺苷七肽纯品和发酵液图谱为图6A、6B，野生型纯品和发酵液图谱6C、
6D。
[0059] 六、腺苷七肽M1和腺苷七肽WT抗逆性的验证
[0060] 用化学合成法合成(南京金斯瑞生物有限公司)腺苷七肽M1(序列为MATINAN)和WT(序列为MHRIMKN)，分别配制M1和WT溶液1.0mg/mL，然后用人工胃液或肠液按照1：10稀释腺
苷七肽M1和WT溶液，其中胃蛋白酶的终浓度为100IU/ml，胰蛋白酶的终浓度为100IU/ml，糜
蛋白酶的终浓度为100IU/ml，处理20‑40min，优选30min，再95℃，处理10‑20min，优选
15min，进行耐热性处理，同时灭活蛋白酶，调节pH＝7.0。结果显示经人工肠液或人工胃液
处理后，腺苷七肽M1的抑菌圈直径与对照组相比仅下降8.30±1.23或7.42±1.11％，抑菌
圈直径显著大于腺苷七肽WT，腺苷七肽M1的含量与对照组相比仅下降5.48±0.92或4.71±
0.88％，含量显著高于腺苷七肽WT，证实腺苷七肽M1的抑菌效果和抗蛋白酶活性显著强于
腺苷七肽WT(表5，图7)。
苷七肽M1和WT溶液，其中胃蛋白酶的终浓度为100IU/ml，胰蛋白酶的终浓度为100IU/ml，糜
蛋白酶的终浓度为100IU/ml，处理20‑40min，优选30min，再95℃，处理10‑20min，优选
15min，进行耐热性处理，同时灭活蛋白酶，调节pH＝7.0。结果显示经人工肠液或人工胃液
处理后，腺苷七肽M1的抑菌圈直径与对照组相比仅下降8.30±1.23或7.42±1.11％，抑菌
圈直径显著大于腺苷七肽WT，腺苷七肽M1的含量与对照组相比仅下降5.48±0.92或4.71±
0.88％，含量显著高于腺苷七肽WT，证实腺苷七肽M1的抑菌效果和抗蛋白酶活性显著强于
腺苷七肽WT(表5，图7)。
[0061] 表5纯品腺苷七肽M1和WT抗逆性验证结果
[0062]
[0063] 同项目同行肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)