柯萨奇病毒A6型实心病毒的单克隆抗体及其应用转让专利
申请号 : CN201911380623.5
文献号 : CN111018971B
文献日 : 2021-08-13
发明人 : 武瑞霞 , 戈小琴 , 夏君瑶 , 蔡芳 , 李雅静 , 高强 , 尹卫东
申请人 : 北京科兴生物制品有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.针对CA6病毒的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:7所示的重链互补决定区CDR3,以及SEQ ID NO:13所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ ID NO:14所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:15所示的轻链互补决定区CDR3;其中,所述CA6病毒为CA6型实心病毒。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链;和/或,所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链。
3.编码权利要求1或2所述的针对CA6病毒的单克隆抗体的多核苷酸分子,其特征在于,所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的编码重链互补决定区CDR1的序列、SEQ ID NO:2所示的编码重链互补决定区CDR2的序列、SEQ ID NO:3所示的编码重链互补决定区CDR3的序列,以及SEQ ID NO:9所示的编码轻链互补决定区CDR1的序列、SEQ ID NO:10所示的编码轻链互补决定区CDR2的序列、SEQ ID NO:11所示的编码轻链互补决定区CDR3的序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸分子,其特征在于,所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;和/或,所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
5.用于检测CA6病毒的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体;其中,所述CA6病毒为CA6型实心病毒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括多抗。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述多抗为CA6兔多抗。
8.用于诊断手足口病的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求3或4所述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体;其中,CA6病毒为CA6型实心病毒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括多抗。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述多抗为CA6兔多抗。
11.权利要求1或2所述的针对CA6病毒的单克隆抗体或权利要求3或4所述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体在制备用于检测CA6病毒或诊断手足口病的试剂盒中的应用;其中,所述CA6病毒为CA6型实心病毒。
12.权利要求1或2所述的针对CA6病毒的单克隆抗体或权利要求3或4所述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体在对含CA6病毒的疫苗的生产进行质量控制中的应用;其中,所述CA6病毒为CA6型实心病毒。
13.对含CA6病毒的疫苗的生产进行质量控制的方法,其特征在于,所述方法包括用权利要求1或2所述的针对CA6病毒的单克隆抗体或权利要求3或4所述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体检测CA6病毒的步骤;其中,所述CA6病毒为CA6型实心病毒。
14.权利要求1或2所述的针对CA6病毒的单克隆抗体或权利要求3或4所述的多核苷酸序列编码的单克隆抗体用于检测手足口疫苗制备过程中或疫苗成品中CA6病毒的含量的应用,所述应用为用于检测手足口疫苗制备过程中或疫苗成品中CA6实心病毒的含量。
说明书 :
柯萨奇病毒A6型实心病毒的单克隆抗体及其应用
技术领域
背景技术
炎、肺水肿、循环衰竭等导致死亡的重症。目前肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯
萨奇病毒A16(coxsackievirus,CA16)是中国大陆地区引起手足口病最常见的病原体。但随
着检测技术及病毒分型手段的进步,近年来发现肠道病毒中的柯萨奇病毒A6
(coxsackievirus,CA6)和柯萨奇病毒A10(coxsackievirus,CA10)的流行率呈现逐年增高
的趋势,并成为部分地区的主要流行血清型。针对近几年病毒血清型的流行趋势,国内外众
多研究机构及企业均在着力开发能够有效预防由CA6或CA10引起的手足口疾病发生的疫苗
或药物。
一株型别特异性的单克隆抗体是建立检测试剂盒的前提。此外,在疫苗的研究过程中,疫苗
中抗原含量是指导工艺研究和评价体外有效性的关键指标。建立抗原评价方法最关键的技
术也在于筛选到合适的单克隆抗体,继而可利用该单克隆抗体建立一套有效的ELISA评价
系统。
完整实心病毒颗粒,一种为不含核酸的空心病毒颗粒,通常这两种状态的病毒颗粒是共同
存在的。经文献资料记载及多次的实验研究表明,实心病毒颗粒和空心病毒颗粒均有免疫
原性,但实心病毒颗粒明显强于空心病毒颗粒。病毒原液中若含有一定比例的空心病毒颗
粒,可有效提高原液总蛋白含量,对病毒原液及成品疫苗的稳定性具有重要的意义。因此,
在疫苗的工艺研究和制剂研究中,能够确定产品中实心病毒颗粒和空心病毒颗粒的比例对
产品的质量评价具有重要意义。分别建立能够检测实心病毒颗粒的抗原评价系统及检测空
心病毒颗粒的抗原评价系统将对病毒原液的监测及成品疫苗的质量控制具有重要意义。
发明内容
ID NO:7所示的重链互补决定区CDR3,以及SEQ ID NO:13所示的轻链互补决定区CDR1、SEQ
ID NO:14所示的轻链互补决定区CDR2、SEQ ID NO:15所示的轻链互补决定区CDR3;优选地,
所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链;和/或,优选地,所述单克隆抗
体具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的轻链;
NO:2所示的编码重链互补决定区CDR2的序列、SEQ ID NO:3所示的编码重链互补决定区
CDR3的序列,以及SEQ ID NO:9所示的编码轻链互补决定区CDR1的序列、SEQ ID NO:10所示
的编码轻链互补决定区CDR2的序列、SEQ ID NO:11所示的编码轻链互补决定区CDR3的序
列;优选地,所述多核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列;和/或,优选地,所述多
核苷酸序列具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列;
优选地,所述多抗为CA6兔多抗;
更优选地,所述多抗为CA6兔多抗;
检测CA6病毒的步骤;
体;
应用。
镜观察的方法对样品的浓度和缓冲体系的成分要求比较高,试验耗时长,对实验室的仪器
设备要求也比较高,具有一定的局限性。若采用细胞病变法检测病毒滴度来评价样品中实
心病毒颗粒的含量,耗时需要5‑7天,实验操作繁琐。
细胞株制备大量腹水。之后对单克隆抗体与多克隆抗体分别进行纯化。对纯化后的单克隆
抗体进行HRP酶标记,与制备的多克隆抗体建立了一套与实心病毒颗粒反应能力强于空心
病毒颗粒的抗原检测系统,即主要用于检测CA6实心病毒颗粒的抗原评价系统。
强于与CA6型空心病毒颗粒的结合能力。在疫苗的研究过程当中,CA6抗原含量的检测是指
导工艺研究和评价体外有效性的关键指标。此外,在疫苗的工艺研究过程中,若能够客观真
实的评价每一步工序段产品的实心病毒颗粒和空心病毒颗粒的含量及比例,对指导工艺参
数的选择和成品的配比计量也具有重要的意义。
够主要检测实心病毒,对空心病毒的结合能力极弱。该评价系统的检测结果能够真实客观
的反应病毒液中的实心病毒含量。实心病毒颗粒的比例是疫苗研究工艺中重点关注的指
标,与产品的有效性成正相关。在病毒的培养阶段,采用本发明提供的检测CA6实心病毒颗
粒的抗原评价系统实时监测病毒液中实心病毒颗粒的含量,可以为病毒培养的收获时间提
供数据支持。在病毒超速离心纯化阶段,通过本发明提供的检测CA6实心病毒颗粒的抗原评
价系统可以监测出收集后的实心病毒管,为后续的超离合并提供指导。
者感染的病毒型别,加快疾病确诊,为临床的治疗方案提供强有力的依据。该抗原检测系统
对临床快速检测和疫苗生产的质量评价均具有重要意义。
多抗)—多抗、多抗—单克隆抗体(简称:单抗)、单抗—多抗、单抗—单抗的形式。
附图说明
具体实施方式
培养温度为36.0℃±0.5℃,病毒培养1~5天后收获得到CA6病毒液,采用100KD~300KD的
膜包澄清超滤初步纯化。
转离心3~15小时。蔗糖密度梯度离心分离出空心病毒条带和实心病毒条带,分别取出两条
病毒带,用电镜鉴定空实心分离结果。
获得实心病毒颗粒管和空心病毒颗粒管,将实心病毒颗粒管收集后脱糖处理,即得到CA6实
心病毒纯化液)免疫BALB/c小鼠,每型免疫5只;在0,2,4,6,8周共5针背部皮下多点免疫;免
疫剂量:0.2ml/针/只;佐剂:第1针为弗氏完全佐剂,第2、3、4针为弗氏不完全佐剂,第5针不
4
加佐剂;采血检测:免疫第4针后1周采血检测间接酶联免疫法效价,对抗体效价达到10以
上的小鼠进行第5针腹腔注射进行加强免疫。
10以上数量时提取总核酸,委托北京六合华大基因科技有限公司经PCR扩增单抗的重链和
轻链序列并进行测序,然后通过核苷酸序列确定对应的氨基酸序列,测定的多核苷酸序列
和氨基酸序列参见序列表。
体。纯化后检测蛋白质含量为521μg/ml。对纯化后的单克隆抗体进行纯度检测和效价的测
定。
化前单克隆抗体腹水,2为纯化洗脱液(重链+轻链),3为纯化流穿液。
的效果很好,无杂质蛋白。
4℃过夜或37℃2小时。加入终浓度0.05%吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液洗2~5遍,再加入含
有5~20%小牛血清的0.01M磷酸盐缓冲液于37℃封闭1~2小时,使用时甩去封闭液并拍板
去除孔中残留封闭液。
依次加入10 至10稀释度样品于上述96孔板,每孔加入100μl,37℃孵育0.5~2小时,0.01M
PBST20洗液洗涤2~5遍,加抗小鼠IgG HRP(市售:KPL厂家)于37℃孵育0.5‑2小时,洗板2‑5
遍后,拍干,加入显色底物于37℃显色8~15分钟,2M H2SO4终止,波长450nm处读数。标准:同
等稀释倍数下,样品OD450值≥阴性对照×2.1,若阴性对照吸光值<0.05,以0.05计算,判
6
定阳性标准。采用ELISA间接法检测得效价为10。
加至抗体中,继续透析过夜;取出抗体,得到HRP标记的CA6实心病毒单克隆抗体,加入硼氢
化钠还原;硫酸铵沉淀后采用0.01MPBS复溶,‑20℃以下保存。
温20的0.01M磷酸盐缓冲液洗2~5遍,再加入含有5~20%小牛血清的0.01M磷酸盐缓冲液
于37℃封闭1~2小时,使用时甩去封闭液并拍板去除孔中残留封闭液。本发明涉及的技术
方案在制成试剂盒时,可提前制成酶标干板,于2‑8℃培育。
PBST20洗液洗涤2~5遍,加实施例4制得的HRP标记后的CA6实心病毒单克隆抗体,于37℃孵
育0.5‑2小时,洗板2‑5遍后,拍干,加入显色底物于37℃显色8~15分钟,2M H2SO4终止,波长
450‑630nm处读数。考察该抗原系统的灵敏度、线性关系。
空白孔 0.0087 0.0092 0.0090
5 0.1256 0.1301 0.1279
10 0.2631 0.2685 0.2658
20 0.5511 0.5602 0.5557
40 1.0895 1.0785 1.0840
80 1.8796 1.9014 1.8905
被的96孔酶标板)中,检测上述抗原评价系统对实心病毒颗粒和空心病毒颗粒的结合能力
差异。按照达到相同OD值的条件下,加入的实心病毒、空心病毒蛋白浓度比值的倒数即为该
抗原评价系统对实心病毒颗粒和空心病毒颗粒的反应能力比值。实验结果显示,该抗原评
价系统对实心病毒颗粒的反应能力是与空心病毒颗粒反应能力的160倍,结果见表3。
品分别稀释至一定的浓度,加入预先包被好多抗的酶标板,参照实施例5步骤执行,将参比
品的OD值与抗原标示量制作标准曲线,样品OD值带入标准曲线计算样品的抗原含量,检测
结果见表4,图5所示为抗原系统用于超离分段工序样品的评价曲线图。
原系统进行抗原检测的ELISA结果,23号管为抗原的检测峰值,说明本系统主要与实心病毒
颗粒反应。
液、CA6病毒纯化液、CA6感染小鼠粪便样品(粪便样品采用PBS缓冲液稀释后离心取上清)和
CA6感染小鼠血清样品(眼球采血、离心分离血清),验证该抗原评价系统对肠道病毒检测的
专属性。结果见表5,结果显示,该抗原评价系统具有很好的专属性,对其它型别的肠道病毒
均不反应。
因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范
围。