一株植物乳杆菌HG20株及其应用

摘要

一株植物乳杆菌HG20株及其应用，属于功能性食品微生物领域。本发明的一株植物乳杆菌HG20株已于2019年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2019964。本发明采用胶原型类风湿性关节炎大鼠模型，灌胃给予植物乳杆菌HG20株连续21天，结果显示植物乳杆菌HG20株可以减少大鼠踝关节直径；降低炎症反应，减少炎症因子IL‑1β、TNF‑α水平，提高抗炎因子IL‑10水平；在类风湿性关节炎发病期间，减少C反应蛋白、免疫球蛋白IgG、IgM水平；能够有效发挥抗炎功效，使关节红、肿、痛症状得到改善。

权利要求

1.一株植物乳杆菌（L. plantarum）HG20株，其特征在于，该菌株已于2019年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M2019964。

2.以权利要求1所述的一株植物乳杆菌（L. plantarum）HG20株为活性成分的一种菌

9 10

剂，菌剂中所述植物乳杆菌（L. plantarum）HG20株的浓度为10～10 CFU/g，制备该菌剂的方法包括以下步骤：

将植物乳杆菌HG20株扩大培养到2L，6000r/min离心5min，生理盐水重悬，再次6000r/min离心5min，生理盐水重悬、洗净，再次6000r/min离心5min，收集菌泥，溶于1L冻干保护剂

10 

中，冻干得到植物乳杆菌HG20发酵剂，菌数为1.0×10 CFU/g；所述冻干保护剂是将40g葡萄糖、5g抗坏血酸钠、80g低聚果糖、30g海藻糖溶于三级水中，定容至750mL所得。

3.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌（L. plantarum）HG20株在制备具有预防和治疗类风湿性关节炎药品中的应用。

说明书

一株植物乳杆菌HG20株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于功能性食品微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌HG20 株及其应用。

背景技术

[0002] 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节疼痛、关节囊肿胀、病变等为主要表现的慢性自身免疫性疾病。RA的发生发展与大量炎症细胞因子和炎症介质的
释放有关，主要病理变化为慢性滑膜炎，并逐渐表现为软骨以及骨破坏，最终导致患者发生
关节畸形甚至关节功能丧失，是我国造成劳动力丧失和致残的主要病因之一。

[0003] 临床目前尚无根本治疗RA的药物。目前的药物治疗主要以减轻疼痛、控制关节炎的发展速度和防止关节软骨损害为主。现代临床主要应用非甾体类抗炎药、糖皮质激素、甲
氨蝶呤和新型生物制剂等控制病情对症治疗。尽管这些药物可在一定程度上改善RA的症
状，抑制骨破坏，但长期使用有较强的毒副作用，如抑制机体免疫功能、诱发RA患者感染等
严重的不良反应。因此寻找安全有效治疗RA的药物具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌HG20株及其应用，用于预防或治疗类风湿性关节炎。

[0005] 本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

[0006] 本发明的一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株，该菌株已于2019年11 月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2019964。

[0007] 本发明的一种菌剂，以上述的一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株为活性成份。

[0008] 作为优选的实施方式，所述植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株的浓度为 109～10
10 CFU/g。

[0009] 本发明的一种菌剂的制备方法，主要包括以下步骤：

[0010] 将植物乳杆菌HG20株扩大培养到2L，6000r/min离心5min，生理盐水重悬，再次6000r/min离心5min，生理盐水重悬、洗净，再次6000r/min离心5min，收集菌泥，溶于1L冻干
10
保护剂中，冻干得到植物乳杆菌HG20发酵剂，菌数为 1.0×10 CFU/g。

[0011] 作为优选的实施方式，所述冻干保护剂是将40g葡萄糖、5g抗坏血酸钠、 80g低聚果糖、30g海藻糖溶于三级水中，定容至750mL所得。

[0012] 本发明的一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株能够应用在制备具有预防和治疗类风湿性关节炎产品中。

[0013] 本发明的有益效果是：

[0014] 本发明以从黄瓜皮表面分离鉴定的乳酸菌为研究对象，经大量的实验筛选获得一株乳酸菌新菌株，命名为植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株。本发明采用胶原型类风湿性关
节炎大鼠模型，灌胃给予植物乳杆菌(L.plantarum)HG20 株连续21天，探讨植物乳杆菌
(L.plantarum)HG20株对胶原型类风湿性关节炎模型大鼠的治疗作用。研究结果显示，植物
乳杆菌(L.plantarum)HG20株可以减少大鼠踝关节直径；降低炎症反应，减少炎症因子IL‑1
β、TNF‑α水平，提高抗炎因子IL‑10水平；在类风湿性关节炎发病期间，减少C反应蛋白、免疫
球蛋白IgG、IgM水平。

[0015] 口服摄入植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株或其菌制剂，可以减少大鼠踝关节直径；降低炎症反应，减少炎症因子IL‑1β、TNF‑α水平，提高抗炎因子IL‑10 水平；在类风湿性
关节炎发病期间，减少C反应蛋白、免疫球蛋白IgG、IgM水平，对类风湿性关节炎具有预防和
治疗作用，并能缓解其炎症反应。因此，本发明提供的植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株可
以用于制备抗类风湿性关节炎的药物、药品等，同时本发明提供的植物乳杆菌
(L.plantarum)HG20株还可以作为功能性益生菌应用于食品、保健品和药品领域，应用前景
非常广阔。

附图说明

[0016] 图1为胶原型关节炎大鼠关节外形变化图。图中，A为对照组；B为模型组； C为植物乳杆菌HG20组。

具体实施方式

[0017] 本发明的一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株，已于2019年11月21 日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校
内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO: M2019964。

[0018] 本发明的一种菌剂，其活性成份为一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20 株。其中，9 10
植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株的浓度为10～10 CFU/g。

[0019] 本发明的一种菌剂，具有至少一项以下功能：

[0020] (a1)减少大鼠踝关节直径

[0021] (a2)降低血清中炎症因子(TNF‑α、IL‑1β)水平

[0022] (a3)提高血清中抗炎因子(IL‑10)水平；

[0023] (a4)减少C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白(IgG、IgM)水平

[0024] 本发明的一种菌剂是用含有一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株的菌液制备得到的粉剂，制备粉剂的方法为冷冻干燥法。

[0025] 本发明的一种菌剂的制备方法，包括以下步骤：

[0026] 将植物乳杆菌HG20株扩大培养到2L，6000r/min离心5min，生理盐水重悬，再次6000r/min离心5min，生理盐水重悬、洗净，再次6000r/min离心5min，收集菌泥，溶于1L冻干
10
保护剂中，冻干得到植物乳杆菌HG20发酵剂，菌数为 1.0×10 CFU/g。

[0027] 其中，冻干保护剂是将40g葡萄糖、5g抗坏血酸钠、80g低聚果糖、30g海藻糖溶于三级水中，定容至750mL所得。

[0028] 本发明的一株植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株能够应用在制备具有预防或治疗类风湿性关节炎功能的产品中。其产品可以为食品、保健品或药品等。以日常摄入植物乳杆
菌(L.plantarum)HG20株或其菌剂代替治疗类风湿性关节炎药物，可明显促进骨关节软骨
炎性物质的吸收，从而抑制关节液中过度生产的炎症因子(IL‑1β、TNF‑α)水平，提高抗炎因
子IL‑10水平，减轻关节软骨的病变过程；在类风湿性关节炎发病期间，减少C反应蛋白
(CRP)、免疫球蛋白 (IgG、IgM)水平，对类风湿性关节炎具有预防和治疗作用，且安全、无毒
副作用。

[0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的
实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。

[0030] 以下实施例中所用到的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0031] 实验材料：

[0032] 固体MRS培养基：溶剂为水，含蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、 KH2PO42g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸钠5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4·4H2O 0.05g/L、吐温‑801mL/L、
琼脂15g/L、葡萄糖20g/L；pH 6.6。

[0033] 固体MRS 5.2培养基：pH＝5.2的MRS培养基。

[0034] 液体MRS培养基与固体MRS培养基的区别仅在于不加入琼脂。

[0035] SD大鼠(体重180～220g)：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

[0036] 基础饲料：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

[0037] 采用江苏酶标大鼠肿瘤坏死因子(TNF‑α)ELISA试剂盒检测血清中TNF‑α含量；采用江苏酶标大鼠白介素1β(IL‑1β)ELISA试剂盒检测血清中IL‑1β含量；采用江苏酶标大鼠
白介素10(IL‑10)ELISA试剂盒检测血清中IL‑10含量；采用江苏酶标大鼠C反应蛋白(CRP)
ELISA试剂盒检测血清中CRP含量；采用江苏酶标大鼠免疫球蛋白IgG(IgG)ELISA试剂盒检
测血清中IgG含量；采用江苏酶标大鼠白介素IgM(IgM)ELISA试剂盒检测血清中IgM含量。

[0038] 其中，弗氏完全佐剂购于美国sigma公司，Ⅱ型胶原购于北京博蕾德科技发展有限公司。

[0039] 实施例1植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株的制备

[0040] 一、植物乳杆菌菌株的分离

[0041] 1、样本取材：黄瓜皮表面。

[0042] 取黄瓜皮5g，加入45mL生理盐水(10倍稀释)混匀，取0.5mL稀释液，再次用生理盐‑3 ‑1 ‑2 ‑3
水进行倍比稀释至10 ，取100μL液体(10 、10 、10 )涂布于固体MRS 5.2培养基中进行培
养(培养温度37℃，培养时间48～72h)。挑取单菌落接种于固体MRS培养基平板上继续培养
(培养温度37℃，培养时间48h)，经固体MRS培养基平板反复划线培养纯化(培养温度37℃，
培养时间48h)，得到多株纯培养菌种。

[0043] 2、将上述获得的多株纯培养菌种分别接种于液体MRS培养基中培养(培养温度37℃，培养时间14～18h)，然后加入60％甘油，置于‑80℃冰箱中保存。

[0044] 3、经革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性和16s rDNA序列同源性比对鉴定，从多株纯培养菌种中筛选出多株植物乳杆菌，选取其中的1株命名为植物乳杆菌
(L.plantarum)HG20株。

[0045] 二、菌株的鉴定

[0046] 1、本发明的植物乳杆菌(L.plantarum)HG20株的生理生化鉴定结果如下：

[0047] 革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性。

[0048] 在液体MRS培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

[0049] 2、16S rDNA序列同源性分析

[0050] (1)CTAB法提取菌株基因组DNA

[0051] 将分离的多株植物乳杆菌接种于液体MRS培养基中，37℃培养16h，取10mL培养液，10000r/min离心10min，离心后弃去上清液，用TE缓冲液清洗菌体1次；将清洗后的菌体重悬
浮于1.9mL的TE缓冲液中，加入0.1mL质量分数为10％的SDS溶液、10μL浓度为20mg/mL的蛋
白酶K、5μL浓度为50 mg/mL的溶菌酶，混匀后在37℃的水浴锅中水浴1h；水浴后，向体系中
加入 300μL 5M的NaCl溶液和300μL质量分数为10％的CTAB‑NaCl溶液，混匀后在65℃的水
浴锅中水浴20min；水浴后，向体系中加入等体积的氯仿‑异戊醇溶液(氯仿溶液与异戊醇溶
液的体积比为24:1)，充分混匀后10000r/min离心30 min；吸取上清液至新的离心管中，加
入等体积的酚‑氯仿‑异戊醇溶液(酚溶液、氯仿溶液、异戊醇溶液的体积比为25:24:1)，充
分混匀后10000r/min离心30min；吸取上清液至新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇溶
液，在‑20℃的条件下放置2h，然后10000r/min离心20min，弃去上清液；用体积分数为70％
的乙醇溶液清洗沉淀，然后10000r/min离心20min，在室温条件下放置至乙醇完全控干；将
沉淀溶于20μLTE缓冲液中，加入1μL的RNA酶并在37℃的水浴锅中水浴1h，获得菌株基因组
DNA，置于‑20℃保存。

[0052] (2)PCR扩增

[0053] ①扩增引物：根据乳酸杆菌的16S rDNA序列的保守区域，采用细菌通用引物27F/1492R，序列如下：

[0054] 27F：5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'；

[0055] 1492R：5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3'。

[0056] ②PCR反应体系如表1所示：

[0057] 表1

[0058]体系组分 反应体系
TaKaRa Ex Taq(5U/μL) 0.25μL
2+
10×Ex Taq Buffer(Mg Plus)5μL 5μL
dNTP Mixture(各2.5mmol/L) 4μL
基因组DNA 1μL
正向引物(10μmol/L) 1μL
反向引物(10μmol/L) 1μL
灭菌双蒸水 37.75μL
总体积 50μL

[0059] ③PCR扩增程序如下：

[0060]

[0061] ④检测PCR扩增产物

[0062] 预先制备质量分数为1％的琼脂糖凝胶(加入10mg/mL的溴化乙锭EB)， PCR扩增结束后，吸取5μL PCR扩增产物和1μL的6×Loading buffer混合均匀，用移液器加入到琼脂糖
凝胶板的点样孔中进行电泳。目标片段长度约为1500bp，使用DL2000的DNA Marker，以1×
TAE作为电泳液，电泳电压为100V，电泳时间为40min。

[0063] (3)16S rDNA基因序列分析

[0064] 将验纯后的产物送到长春库美进行测序；获得各菌株的16S rDNA序列通过 BLAST程序与GenBank库中已知菌株的序列信息进行同源性比对分析，鉴定待测菌株；以16S rDNA
序列同源性大于99％为标准进行属种归类，然后再将待测菌株与模式菌株的16S rDNA序列
利用MEGA4.0软件中的Neighbor‑Joining法构建系统发育树。16s rDNA序列如序列表中的
SEQ ID NO:1所示。

[0065] 基于上述分析结果可以确定，本发明的菌株HG20为植物乳杆菌(L. plantarum)。

[0066] 三、菌株的保藏

[0067] 本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HG20株，已于2019年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武
汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO: M2019964。

[0068] 实施例2本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HG20株对胶原型关节炎模型大鼠的影响

[0069] 一、动物模型的建立及分组

[0070] 利用小牛软骨Ⅱ型胶原加弗氏完全佐剂充分乳化后作为造模剂，20mg牛Ⅱ型胶原溶于10mL浓度为0.1mol/L的乙酸中，4℃过夜后与等量的完全弗氏佐剂充分乳化。在酒精擦
拭大鼠左、右侧足跖部位消毒后，于左、右侧足跖肉垫处皮内注射100μL/只。7d后，加强注
射。并将30只雄性SD大鼠，随机分成3组：对照组、模型组和植物乳杆菌HG20组，每组10只。于
加强注射7d 后灌胃给药，对照组和模型组灌胃生理盐水2mL/d，植物乳杆菌HG20组灌胃菌
株HG202mL/d，连续给药21d。试验结束后，测量踝关节直径、足趾容积；各组大鼠心脏取血，
3000r/min离心15min，收集血清。

[0071] 二、植物乳杆菌HG20对胶原型关节炎大鼠整体状况的影响

[0072] 对照组：大鼠背毛光滑、有色泽。饮食与大便情况均正常。两侧踝关节均无肿胀等异常情况。大鼠活动自如，喜动。

[0073] 模型组：大鼠背毛不光滑、色泽暗淡。进食较少，部分大便不成形。两侧踝关节肿胀明显，活动困难，不喜动。

[0074] 植物乳杆菌HG20组：大鼠背毛光滑、色泽尚可。饮食情况尚可，大便成形。两侧踝关节有些许肿胀，活动几乎无困难，较喜动。

[0075] 三、大鼠踝关节肿胀程度

[0076] 表2植物乳杆菌HG20株对胶原性关节炎大鼠踝关节肿胀程度影响

[0077] 组别 肿胀程度(cm) 足趾容积(mL)** **
对照组 0.90±0.19 1.77±0.31
模型组 3.80±0.48 6.07±0.33
** **
植物乳杆菌HG20组 1.31±0.30 2.35±0.25

[0078] 注：**与模型组比较，差异极显著(p<0.01)。

[0079] 造模前，3组无明显差异，观察无肿胀及行动不便的症状。造模第7天，除正常组外，其他2组均出现肿胀、踝关节直径变大、行动不便等症状，说明造模成功。给药第21天后，植
物乳杆菌HG20组踝关节直径减小，足趾容积减少，说明其具有缓解关节肿胀、行动不便的效
果，如图1所示。

[0080] 四、血清中相关指标检测

[0081] 表3植物乳杆菌HG20株对胶原型关节炎大鼠血清中炎症因子影响

[0082]组别 TNF‑α(pg/mL) IL‑lβ(pg/mL) IL‑10(pg/mL)
** ** **
对照组 41.81±7.44 43.49±10.15 70.32±3.95
模型组 122.58±16.09 120.20±13.33 36.98±3.44
** ** **
HG20 58.13±2.29 74.21±9.79 57.46±7.04

[0083] 注：**与模型组比较，差异极显著(p<0.01)。

[0084] 在RA发病期间，促进炎症反应的细胞因子如TNF‑α、IL‑1β等浓度会有所上升，而抗炎细胞因子IL‑10的水平有所下降，这些变化会加重炎症反应，对滑膜和关节软骨造成伤
害。检测在RA发病中具有关键作用的三种细胞因子含量变化可知，植物乳杆菌HG20具有一
定的抗炎作用，可使胶原型关节炎大鼠的 TNF‑α、IL‑1β水平降低，使病理性降低的IL‑10水
平升高，从而缓解病情，使发病程度降低。

[0085] 表4植物乳杆菌HG20株对胶原型关节炎大鼠血清中免疫球蛋白水平影响

[0086]

[0087]

[0088] 注：**与模型组比较，差异极显著(p<0.01)。

[0089] 诱发RA的始动因子可使机体产生IgG抗体并使其分子结构发生改变，从而激发类风湿因子的形成。IgM主要参与机体的急性免疫应答，是机体防御系统的重要的组成部分。C
反应蛋白(CRP)是一种急性期反应蛋白，在RA发病期间，机体处于急性炎症期，C反应蛋白的
浓度也会随之升高。本发明结果显示，模型组大鼠的免疫指标IgG、IgM和CRP明显升高，在通
过灌胃植物乳杆菌HG20 后，其血清中各项免疫指标均显著降低。

[0090] 本发明公开了一株植物乳杆菌HG20株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员
来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行
了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动
或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。