一种活性氧响应性凝胶贮库及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种活性氧响应性凝胶贮库及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。凝胶贮库中包括聚(4，6‑二炔基癸二酸)和凝胶骨架材料，聚(4，6‑二炔基癸二酸)的羧基与骨架材料发生共价交联形成凝胶；凝胶中负载有光敏剂分子。优选地，凝胶中还负载有抗肿瘤药物。本发明的活性氧响应水凝胶，通过组分的协同作用，具有高效的抗肿瘤和防止肿瘤术后的复发与转移。当光照射时，光敏剂分子产生活性氧，不仅能降解水凝胶贮库，调控抗体药物如免疫检查点抑制剂的释放，也能通过光动力激活机体免疫，增加巨噬细胞在肿瘤部位的比例，与抗体药物如免疫检查点抑制剂起到协同增效的作用。

权利要求

1.一种活性氧响应性凝胶贮库，其特征在于，所述凝胶贮库中包括聚（4，6-二炔基癸二酸）和凝胶骨架材料，所述聚（4，6-二炔基癸二酸）的羧基与凝胶骨架材料发生共价交联形成凝胶；所述聚（4，6-二炔基癸二酸）能够被活性氧降解，使得所述凝胶具有活性氧响应性；

所述凝胶中负载有光敏剂分子；

所述凝胶中还负载有免疫检查点抑制剂aCD47；所述光敏剂分子为二氢卟吩e6；所述凝胶骨架材料为普鲁兰多糖。

2.如权利要求1所述的活性氧响应性凝胶贮库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将聚（4，6-二炔基癸二酸）和凝胶骨架材料分别溶于有机溶剂中，得到聚（4，6-二炔基癸二酸）溶液和凝胶骨架材料溶液；

（2）向步骤（1）得到的凝胶骨架材料溶液中加入催化剂和缩合剂，充分混匀后，再加入步骤（1）得到的聚（4，6-二炔基癸二酸）溶液，使所述聚（4，6-二炔基癸二酸）的羧基与凝胶骨架材料发生共价交联形成凝胶；

（3）将步骤（2）得到的凝胶透析除去有机溶剂后，浸泡在光敏剂溶液中，即得到活性氧响应性凝胶贮库；

或将步骤（2）得到的凝胶除去有机溶剂后进行冻干，得到冻干凝胶，将光敏剂溶液加入到该冻干凝胶内，充分溶胀后，即得到活性氧响应性凝胶贮库。

3.如权利要求2所述的活性氧响应性凝胶贮库的制备方法，其特征在于，所述聚（4，6-二炔基癸二酸）（PDDA）1份、普鲁兰多糖4-50份、催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）1份、缩合剂

1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDCI）5份。

4.如权利要求1所述的活性氧响应性凝胶贮库用于制备术后防止肿瘤复发植入制剂和/或防止肿瘤转移植入制剂的应用。

说明书

一种活性氧响应性凝胶贮库及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种活性氧响应性凝胶贮库及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 大部分药物自身半衰期短，并且毒副作用大，因此传统的给药方式在进入人体之后会快速释放药物，不仅导致较强的毒副作用，还会影响治疗效果。药物载体可以改变药物在体内的存在形式，控制药物的缓慢释放，减少药物的流失，提高药物的治疗效果。其中，凝胶具有载药量高、生物相融性好、可控性强、毒副作用小等优点。缓释或者控释型凝胶贮库可以实现药物的持续缓慢释放。功能化的药物凝胶贮库可以在单次植入体内之后，作为药物的暂时储存空间，通过人工的控制，实现按需释药。

[0003] 高分子材料由于其生物可降解、易加工等优点被广泛用于缓释和控释药物载体。但是很多高分子材料形成的凝胶制备步骤繁琐、重复性差、材料降解物对人体有害。此外，依靠机体自身的降解作用，凝胶降解缓慢，人为不可控制。开发响应性凝胶载体，利用人为可控的手段来调控药物的释放，进而实现临床可控性治疗具有十分重要的意义。

[0004] 活性氧(ROS)在细胞的发生发展中扮演着十分重要的角色。高水平的ROS可以引起细胞生物分子的氧化损伤，例如脂质、蛋白质、DNA等等，最终导致细胞的死亡。因此，利用ROS进行肿瘤治疗具有重大意义。目前，也已有报道根据內源ROS来设计制备具有ROS响应性凝胶贮库，但肿瘤组织自身产生的ROS往往有限，对治疗效果或凝胶响应效果均不理想。光动力疗法是利用光敏剂在光激活状况下产生ROS，进而杀伤细胞。

发明内容

[0005] 本发明解决了现有技术中药物凝胶载体的药物释放不可控，以及内源活性氧响应凝胶响应不够灵敏的技术问题。本发明通过聚(4，6-二炔基癸二酸)的羧基与凝胶骨架材料的羟基或者氨基发生共价交联形成凝胶，该交联剂聚(4，6-二炔基癸二酸)能够被活性氧降解；凝胶中负载有光敏剂分子，进一步地凝胶中负载有抗肿瘤药物。当光照射时，光敏剂分子产生活性氧，不仅能降解水凝胶贮库，进一步还能调控抗肿瘤药物的释放，并能与抗体药物起到协同增效的效果。

[0006] 根据本发明的第一方面，提供了一种活性氧响应性凝胶贮库，所述凝胶贮库中包括聚(4，6-二炔基癸二酸)和凝胶骨架材料，所述聚(4，6-二炔基癸二酸)的羧基与凝胶骨架材料发生共价交联形成凝胶；所述聚(4，6-二炔基癸二酸)能够被活性氧降解，使得所述凝胶具有活性氧响应性；所述凝胶中负载有光敏剂分子。

[0007] 优选地，所述凝胶中还负载有抗肿瘤药物。

[0008] 优选地，所述抗肿瘤药物为抗体药物。

[0009] 优选地，所述抗体药物为免疫检查点抑制剂。

[0010] 优选地，所述光敏剂分子为玫瑰红、亚甲基蓝、二氢卟吩e6或吲哚菁绿；所述凝胶骨架材料含有羟基或氨基；

[0011] 优选地，所述凝胶骨架材料为普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、纤维素、透明质酸或胶原蛋白。

[0012] 按照本发明的另一方面，提供了任一所述的活性氧响应性凝胶贮库的制备方法，包括以下步骤：

[0013] (1)将聚(4，6-二炔基癸二酸)和凝胶骨架材料分别溶于有机溶剂中，得到聚(4，6-二炔基癸二酸)溶液和凝胶骨架材料溶液；

[0014] (2)向步骤(1)得到的凝胶骨架材料溶液中加入催化剂和缩合剂，充分混匀后，再加入步骤(1)得到的聚(4，6-二炔基癸二酸)溶液，使所述聚(4，6-二炔基癸二酸)的羧基与凝胶骨架材料发生共价交联形成凝胶；

[0015] (3)将步骤(2)得到的凝胶透析除去有机溶剂后，浸泡在光敏剂溶液中，即得到活性氧响应性凝胶贮库；

[0016] 或将步骤(2)得到的凝胶除去有机溶剂后进行冻干，得到冻干凝胶，将光敏剂溶液加入到该冻干凝胶内，充分溶胀后，即得到活性氧响应性凝胶贮库。

[0017] 优选地，步骤(3)中，所述光敏剂溶液中还包括抗肿瘤药物。

[0018] 优选地，所述抗肿瘤药物为抗体药物；

[0019] 优选地，所述抗体药物为免疫检查点抑制剂。

[0020] 优选地，所述光敏剂分子为玫瑰红、亚甲基蓝、二氢卟吩e6或吲哚菁绿；所述凝胶骨架材料含有羟基或氨基；

[0021] 优选地，所述凝胶骨架材料为普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、纤维素、透明质酸或胶原蛋白。

[0022] 按照本发明的另一方面，提供了任一所述的活性氧响应性凝胶贮库用于制备术后防止肿瘤复发植入制剂和/或防止肿瘤转移植入制剂的应用。

[0023] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

[0024] (1)本发明所述的活性氧响应水凝胶，通过组分的协同作用，具有高效的抗肿瘤和防止肿瘤术后的复发与转移。当近红外光照射时，光敏剂分子产生活性氧，不仅能降解水凝胶贮库，调控抗体药物如免疫检查点抑制剂的释放，也能通过光动力激活机体免疫，增加巨噬细胞在肿瘤部位的比例，与抗体药物如免疫检查点抑制剂起到协同增效的作用。

[0025] (2)本发明中凝胶材料为一种具有活性氧可降解的聚合物与含有羧基或羟基的高分子骨架材料共价交联而成，更利于提升水凝胶的性能，进一步提升材料的原位抗肿瘤能力以及生物相容性，且具有活性氧响应性和良好的生物可降解性，其包载的光敏剂分子在近红外光照下一方面可使水凝胶发生降解，调控抗体包载物的释放，同时还可起到光动力治疗与免疫治疗的协同治疗效果。

[0026] (3)本发明中，将光敏剂分子与抗肿瘤药物共负载在凝胶中，优选地将免疫检查点抑制剂aCD47与近红外光敏剂Ce6分子负载在水凝胶上，具有明显协同增效目的，可以提升彼此的抗肿瘤活性，明显改善肿瘤术后的复发与转移，不仅如此，将免疫检查点抑制剂aCD47与近红外光敏剂Ce6分子同时负载在水凝胶上，可以通过Ce6产生的活性氧降解水凝胶，通过光控调节免疫检查点抑制剂aCD47的释放，实现按需给药的目的。

[0027] (4)本发明中活性氧响应水凝胶具有制备方法简单、应用操作简单的特点。所选用的两种水凝胶材料共价交联即可得到活性氧响应水凝胶。应用时，仅需要术后植入肿瘤切除点和一次或者数次近红外光照即可防止肿瘤复发和转移。

附图说明

[0028] 图1是实施例1活性氧响应水凝胶的宏观图。

[0029] 图2是实施例2活性氧响应水凝胶光照前后的流变学性质。

[0030] 图3是实施例3不同交联度的活性氧响应水凝胶冻干图。

[0031] 图4是实施例4的活性氧响应水凝胶的体外光降解。

[0032] 图5为实施例5肿瘤术后的植入过程。

[0033] 图6为实施例6活性氧响应水凝胶的抑制术后肿瘤复发曲线。

具体实施方式

[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0035] 本发明一种活性氧响应性凝胶贮库，所述凝胶贮库中包括聚(4，6-二炔基癸二酸)(简写为PDDA)和多糖，所述聚(4，6-二炔基癸二酸)的羧基与多糖的羟基发生共价交联形成凝胶，该共价交联能够被活性氧降解；所述凝胶中负载有光敏剂分子。

[0036] 本发明所述的光敏剂分子为玫瑰红、亚甲基蓝、二氢卟吩e6和吲哚菁绿等中的至少一种，优选地为近红外光光敏剂，具有较高的活性氧产生效率的二氢卟吩e6。

[0037] 本发明凝胶中还负载有抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物优选为抗体药物，所述抗体药物优选为免疫检查点抑制剂，免疫检查点抑制剂优选地为CTLA-4、aPD-L1\PD1和aCD47中的至少一种，优选为aCD47。

[0038] 作为优选，所述活性氧响应水凝胶贮库中，聚(4，6-二炔基癸二酸)和凝胶骨架材料形成的水凝胶基底材料质量为4～12mg，近红外光敏剂的质量为0.01～0.15mg，免疫检查点抑制剂质量在0.03～0.12mg。

[0039] 本发明中凝胶骨架材料优选地为普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、纤维素、透明质酸或胶原蛋白。

[0040] 本发明的活性氧响应性凝胶贮库的制备方法，优选地，由以下质量百分比的原料制备而成：聚(4，6-二炔基癸二酸)(PDDA)1份、普鲁兰多糖4-50份、催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)1份、缩合剂1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)5份。制备步骤如下：

[0041] S1：将聚(4，6-二炔基癸二酸)溶于二甲亚砜溶液中，得到1-5mg/ml的PDDA溶液；

[0042] S2：另取一容器，按照需要制备的凝胶交联度，称取与第一步聚(4，6-二炔基癸二酸)质量相对应的普鲁兰多糖，利用超声溶解法使其完全溶解于二甲亚砜中；

[0043] S3：向上述普鲁兰多糖溶液中加入对应质量的催化剂，继续超声使其完全溶解；

[0044] S4：最后向上述普鲁兰多糖和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合溶液中加入缩合剂，继续超声使其完全溶解；

[0045] S5：将上述聚(4，6-二炔基癸二酸)溶液先加到对应的容器中，如96孔板，48孔板等等；再加入普鲁兰多糖、催化剂和缩合剂的混合溶液，迅速搅拌，静置；

[0046] S6：静置2-5天，待凝胶充分交联后，将其转移至超纯水中，透析3-5天，制得所述的活性氧响应水凝胶。

[0047] S7：将S6步得到的凝胶，直接浸泡在药液中，或冻干后将药液加入到冻干凝胶内，充分溶胀后，得到载药凝胶贮库。

[0048] 本发明中活性氧响应性凝胶贮库可用于制备抗肿瘤制剂或防止肿瘤复发转移制剂的应用。

[0049] 优选地，用于制备肿瘤术后原位治疗的药物；

[0050] 进一步优选地，用于制备抗恶性乳腺瘤的药物；

[0051] 最优选，用于制备肿瘤术后防复发的植入制剂。

[0052] 实施例1

[0053] 一种活性氧响应性凝胶贮库，由以下重量百分比的原料制备而成：普鲁兰多糖53.6％、聚(4，6-二炔基癸二酸)(PDDA)6.7％、4-二甲氨基吡啶(DMAP)6.7％、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)33％。按照上述制备方法，使用48孔板制备得到直径为
1cm，厚度为3mm的凝胶。如图1所示。

[0054] 实施例2

[0055] 对此凝胶贮库的活性氧响应性进行研究。取两块实施例1中制备得到的凝胶，每块滴加50ul的1mg/ml的玫瑰红RB溶液，将其中一块置于红光灯下持续照射24h，另一块不施加光照。使用高速旋转流变仪对两块凝胶的弹性模量和粘性模量进行测定。结果如图2所示。光照过后的凝胶弹性模量和粘性模量均比未光照的低。说明光敏剂光照过程中产生的活性氧确实对凝胶的结构产生了影响。证明此凝胶确实具有活性氧响应性。

[0056] 实施例3

[0057] 根据上述制备方法得到不同交联度的凝胶，将其充分透析之后冻干，拍照。其中，PDDA和普鲁兰多糖的质量比分别为1:8、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:50、1:55。结果如图3所示。可见，通过控制凝胶的投料比可以得到不同交联度的凝胶。

[0058] 实施例4

[0059] 按照上述制备方法，分别制备PDDA和普鲁兰多糖的质量比分别为1:6、1:8、1:12、1:16、1:20的凝胶。透析之后，使用660nm，5mW/cm2的LED灯进行持续光照，并分别于0h、4h、
8h、10h、12h、24h拍照记录凝胶不同交联度的凝胶光降解情况。结果如图4所示，24h之内，不同交联度的凝胶均具有较好的降解效果。

[0060] 实施例5

[0061] 一种活性氧响应性凝胶贮库用于肿瘤术后防复发，动物验证参见图5所示，具体包括以下步骤：

[0062] S1：治疗前10天，于小鼠右侧乳腺附近皮下接种4T1-luc乳腺癌细胞1×106；

[0063] S2：待肿瘤体积达到300mm3时，将其手术切除90％的肿瘤；

[0064] S3：将凝胶植入残余肿瘤部位上方；

[0065] S4：将手术部位通过手术缝合线进行缝合。

[0066] 实施例6

[0067] 按照实施例5中的验证方法将载有不同药物的凝胶埋植于小鼠肿瘤部位。其中，光敏剂选取Ce6，抗体药物选择aCD47抗体。且分别于第0,2,4,6天对光照组老鼠外部施加660nm LED光照射凝胶埋植部位，照射时间为每次20min。记录不同组别小鼠40天内的肿瘤体积，以考察肿瘤复发情况。从肿瘤生长曲线来看，采用光敏剂和抗体药物联合治疗的凝胶，肿瘤防复发效果更好。具体分组如下：

[0068] a.PBS组，磷酸盐缓冲液；

[0069] b.Free aCD47/Ce6，游离的抗体药物和光敏剂；

[0070] c.Ce6@gel+L，凝胶包载光敏剂，加光照；

[0071] d.aCD47/Ce6@gel-L，凝胶包载抗体药物和光敏剂，不加光照；

[0072] e.aCD47/Ce6@gel+L，凝胶包载抗体药物和光敏剂，加光照；

[0073] f.Blank gel，空白凝胶。

[0074] 通过建立小鼠皮下肿瘤，肿瘤体积超过300mm3时，通过手术切除肿瘤，原位植入活性氧响应水凝胶后，并给予四次近红外光照射(660nm，0.3mW/cm2，20min)。研究发现与单一光动力治疗或者免疫阻断疗法对照组比较，实验组(aCD47/Ce6@gel+L)具有最优的抑制肿瘤复发的协同效果。治疗24天后解剖发现，实验组(aCD47/Ce6@gel+L)中5只小鼠经治疗后复发肿瘤体积都得到较好的抑制，其中2只小鼠残余肿瘤组织完全消失，表明光动力治疗与免疫阻断疗法联合治疗手段可以完全抑制甚至消融小鼠的肿瘤(图6)。

[0075] 治疗后39天内肿瘤的体积变化如图6所示。相较于对照组而言，aCD47/Ce6@gel+L相较于单独的Ce6@gel+L有较好的肿瘤治疗效果，同样地，aCD47/Ce6@gel-L相较于游离的Free aCD47/Ce6有更好的癌症治疗效果，但是四组小鼠的肿瘤在治疗后期都表现出明显的增长趋势，使用复合水凝胶处理的实验组具有更好的肿瘤抑制效果。

[0076] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。