一株在高盐环境下增强木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6

摘要

本发明公开了一种在高盐环境下增加木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6，属于微生物技术领域。该内生真菌Y6的分类命名为炭团菌（Hypoxylon sp.），已于2019年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18814。内生真菌Y6菌液通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式应用于高盐环境下木麻黄苗木的种植，能够增加木麻黄的抗氧化能力。

权利要求

1.一株在高盐环境下增强木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6，其特征在于：所述内生真菌Y6的分类命名为炭团菌（Hypoxylon sp.），已于 2019年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18814。

2.如权利要求1所述的一株在高盐环境下增强木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6在高盐环境下木麻黄种植中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将内生真菌Y6菌液通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式应用于高盐环境下木麻黄苗木的种植。

说明书

一株在高盐环境下增强木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株能在高盐环境下增加木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6。

背景技术

[0002] 盐胁迫严重影响着农作物以及林地植物的生长发育，是世界范围内主要的非生物+ + ‑
胁迫。过量的盐分离子，如Na 、K 、Cl等被植物摄取后会使得植物细胞内离子浓度增高，而
+ ‑
植物细胞内的各种生物酶只能在较狭窄范围离子浓度才具有活性，如对Na离子和Cl离子
+
要求低于50mM，对于K 离子而言则是0.1‑0.2M。因此，离子浓度的改变影响生物酶活性，从
而影响植物的生长。盐胁迫亦能通过影响细胞质膜的组分、透性、运输等一系列的变化，使
植物细胞膜功能受损，从而在一定程度上破坏细胞的代谢以及各种生理功能。

[0003] 短枝木麻黄（Casuarina equisetifolia L.）是世界各国引种最早且人工栽培面积最大的木麻黄科树种，目前也是我国华南和东南沿海最主要的造林树种。现有研究都表
明，木麻黄本身具有一定的耐盐能力，但其抗盐性的提高有助于发挥更大的生态作用。因
此，如何增加木麻黄耐盐能力，提高生态适应性是将来研究的重点。

[0004] 前人的一系列研究都表明植物内生真菌与宿主的共生体有利于宿主本身应对不利环境，同时还促进植物的生长发育，但这方面的研究大部分集中在禾草科植物，而木本植
物内生真菌研究较少。从木麻黄组织中分离鉴定其内生真菌，寻找具有促生效果且具有一
定耐盐性的内生真菌，建立木麻黄‑内生真菌共生体系，提高木麻黄在高盐胁迫下的生长，
可为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为木麻黄工林经营制造生物菌肥提供数据基
础和参考依据。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一株在高盐环境下增强木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一株在高盐环境下增强木麻黄抗氧化能力的内生真菌Y6，该内生真菌Y6的分类命名为炭团菌（Hypoxylon sp.），已于 2019年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员
会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC 
NO.18814。

[0008] 内生真菌Y6在土豆葡萄糖培养基（PDA培养基）上培养时，初期菌落成白色，气生菌丝茂盛，培养后期菌落中间颜色逐渐变深，逐渐呈墨绿色至黑色。

[0009] 上述内生真菌Y6菌株是从木麻黄的种子中分离纯化得到的，其可制备成菌液，通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于高盐环境下木麻黄苗木的种植。

[0010] 所述菌液的制备方法为：将所述菌株接入液体培养基中，摇床恒温培养72h后，将5 
所得培养液用无菌水混合稀释，稀释后菌液浓度为8.75×10 cfu/mL。所述液体培养基为
PDB。

[0011] 本发明的优点在于：

[0012] 所得菌株能够缓解盐胁迫条件对植株生长的制约，能够在高盐环境下促进木麻黄抗氧化酶的增加，从而缓解盐胁迫对植株的伤害。

[0013] 附图说明：

[0014] 图1内生真菌Y6菌丝、菌落形态图。

[0015] 图2不同浓度NaCl胁迫对木麻黄EF和木麻黄EI小枝SOD含量的影响。不同大写字母表示同一NaCl水平下不同处理水平上差异显著 (Duncane test, P＜0.05)，不同小写字母
表示同一处理水平下不同NaCl水平上差异显著 (Duncan test, P＜0.05)。

[0016] 图3不同浓度NaCl胁迫对木麻黄EF和木麻黄EI小枝POD含量的影响。不同大写字母表示同一NaCl水平下不同处理水平上差异显著 (Duncane test, P＜0.05)，不同小写字母
表示同一处理水平下不同NaCl水平上差异显著 (Duncan test, P＜0.05)。

[0017] 图4不同浓度NaCl胁迫对木麻黄EF和木麻黄EI小枝MDA含量的影响。不同大写字母表示同一NaCl水平下不同处理水平上差异显著 (Duncane test, P＜0.05)，不同小写字母
表示同一处理水平下不同NaCl水平上差异显著 (Duncan test, P＜0.05)。

[0018] 图5不同浓度NaCl胁迫对木麻黄EF和木麻黄EI小枝CAT含量的影响。不同大写字母表示同一NaCl水平下不同处理水平上差异显著 (Duncane test, P＜0.05)，不同小写字母
表示同一处理水平下不同NaCl水平上差异显著 (Duncan test, P＜0.05)。

[0019] 图6不同浓度NaCl胁迫对木麻黄EF和木麻黄EI小枝H2O2含量的影响。不同大写字母表示同一NaCl水平下不同处理水平上差异显著 (Duncane test, P＜0.05)，不同小写字母
表示同一处理水平下不同NaCl水平上差异显著 (Duncan test, P＜0.05)。

具体实施方式

[0020] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此

[0021] 实施例1 木荷内生真菌的分离

[0022]  1. 主要仪器设备

[0023] AX224ZH电子天平(OHAUS)、LS‑75HD高压蒸汽灭菌锅（济南来宝医疗器械有限公司）、JB‑CJ‑1500FX超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）、DNP‑9162恒温培养箱
(上海精宏)、ZHWY2111B恒温震荡培养箱(上海智城)、Beckman超速离心机（美国）等。菌株鉴
定主要仪器：FQD‑48APCR扩增仪(BIOER)、EPS‑100核酸电泳仪(上海天能科技)、
SeqStudioDNA测序仪(美国)，研钵，冰袋，泡沫盒，移液器（Thermo），1.5ml和2mlEP管
（Axygen）。

[0024] 2. 主要试剂和培养基

[0025] 试剂：70%酒精、次氯酸钠、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯葡萄糖(PDB)培养基、NaCl，Taq酶及PCR相关试剂、引物（ITS1/ITS4），OMEGA真菌基因组试剂盒，液氮，乙醇
（天津大茂化学试剂厂），去离子水。

[0026] 3. 内生真菌的分离

[0027] （1）采用组织分离法，将木麻黄样本根据其的根、茎、叶、以及种子不同组织分成四个个部分，经流水冲洗干净阴干后于超净台内进行组织表面消毒。操作流程为：70%酒精浸
泡30s→无菌水清洗3次→10%次氯酸钠浸泡7min→无菌水清洗3次。将木麻黄样品分别用手
术刀切开，平放于已经灭菌过的平板培养基中后，于28C恒温培养箱内培养5‑7天。

[0028] （2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的PDA培养基上，28℃恒温培养4 7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本
~
组织于未使用的PDA培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培
养4 7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。
~

[0029] 4. 内生真菌的纯化

[0030] 待平板培养基上的组织材料培养3 5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的~
菌丝，分别于新的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温
培养箱内，28℃恒温避光培养4 7d。反复纯化3 4次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入斜
~ ~
面培养基，于4℃保存。

[0031] 5. 内生真菌的筛选

[0032] （1）平板初筛：采用三点接种法，将活化后的纯化菌株接种于含有不同浓度（1%、3%、5%、10%）NaCl的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，将菌株接种后于28C恒温培养7天，
观察生长情况。每组实验平行三次，观察菌株生长状态，得到目标菌株（图1）。

[0033] 6. 内生真菌的DNA提取和鉴定

[0034] （1）菌株总DNA的提取

[0035] 从保存的目标菌株的斜面培养基转接到平板培养基，28C培养一周。基因组DNA的提取采用OMEGA真菌基因组试剂盒（Fungal DNA Kit 50）进行。

[0036] （2）菌株18S rDNA的PCR扩增

[0037] 利用真菌18S rDNA通用引物ITS1（5＇‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3＇）和ITS4（5＇‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3＇）为正、反引物，扩增其ITS序列。

[0038] ITS区域扩增选择真核生物ITS通用扩增引物ITS1 (5’‑TCCGTAGGTGAACCTGCGG‑3’)，ITS4(5’‑TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)，PCR反应条件为预变性94C 5min，变性94C 
1min，退火55C 30s，延伸72C 1min，共35个循环，最后延伸72C10min。

[0039] PCR扩增反应采用50ul的反应体系，包括ddH2O 40.5µl，PCR Buffer（10х，Mg+plus）5µl，dNTP(2.5mM)1µl，ITS1(20µM)1µl，ITS4(20µM)1µl，DNA1µl，Taq polymerase(5U/
µl)0.5µl。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后交由公司进行DNA测序，其核苷酸序
列如SEQ ID NO.1所示。

[0040] （3）菌株18S rDNA序列分析

[0041] 获得序列后，在NCBI中BLAST进行同源性搜索，从中找到与该序列相似性较高（99%）的核酸序列，确定该菌株为何种菌属。初步确定菌株的分类命名为：炭团菌
（Hypoxylon sp.）。

[0042] 实施例2

[0043] 菌液制备：将活化后的耐盐菌株接种于60mL 马铃薯葡萄糖培养基（PDB）液体培养基中，置于恒温摇床上培养72h（28℃、160 r•min‑1）。用血球计数法计算菌液浓度, 得到浓
5
度为为8.75×10 cfu/mL的菌液。

[0044] 本试验采用土培盆栽试验，试验所选木麻黄为一年生实生苗，平均苗高为20cm，平均地径为3.0mm，由福建省惠安赤湖国有林场提供。在2017年7月3日选取长势一致的木麻黄
定植于直径15cm、高10cm的塑料盆内。实验所需土壤经过混匀称量，每盆放入等量（4kg）的
黄心土，该土壤中养分含量见表1。经一个月恢复性生长后，于2017年8月3日开始接菌，连续
3天于木麻黄根际土壤施入100mL菌液。每种菌液处理4次重复，并以蒸馏水处理为空白对
照。

[0045] 表1 土壤养分底值

[0046]

[0047] NaCl胁迫：根据预备试验和有关资料，以NaCl设计了正常胁迫CK（0%）、轻度胁迫（5%），中度胁迫（10%）和重度胁迫（15%）4个盐胁迫处理，每个处理3个重复。于2017年8月18
日进行NaCl胁迫试验，在胁迫至20d，40d，60d时进行全部木麻黄幼苗H2O2、丙二醛（MDA）、超
氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的测定。结果见图2至图6。

[0048] 当盐胁迫浓度增加，Y6菌株侵染植株的H2O2和MDA含量均显著增加，SOD、CAT和POD活性均呈先上升后下降的变化趋势，而未侵染植株的H2O2含量显著降低，丙二醛（MDA）含量
显著上升，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性呈先上升后下
降的变化趋势。当胁迫时间延长，Y6侵染的与未侵染的植株H2O2均先显著增加后显著降低，
MDA含量均显著上升，SOD、CAT、POD活性均呈先上升后下降的变化趋势。综合比较，在轻度胁
迫（5%）及短期（0和20d）胁迫下，Y6侵染植株H2O2显著低于未侵染，且保护酶（SOD、CAT、POD）
活性亦显著高于未侵染植株，说明轻度和短期胁迫下，内生真菌的侵染能增加保护酶活性
而清除更多活性氧，导致Y6侵染后植株的活性氧低于未侵染，而中度和重度（10%和15%）和
长期（40d和60d）胁迫下，Y6侵染的植株H2O2显著高于未侵染，但其保护酶活性也显著高于未
侵染，说明虽然中高度胁迫下Y6侵染后植株的活性氧增多，但保护酶活性亦显著增加，由此
推测内生真菌能够影响NaCl胁迫下短枝木麻黄的保护酶系统，提高其抗性。

[0049] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。