检测病原体的组合物、试剂盒及方法

摘要

本发明提供了一种组合物，尤其用于检测脑炎/脑膜炎/呼吸道多种病原体，其中所述组合物包括针对病原体的SEQ ID NO:1~7、9~23和25~32引物序列，其中SEQ ID NO:1~7和9~16带有荧光报告基团。此外，本发明还涉及上述组合物在制备试剂盒中的用途，和相关的试剂盒及其使用方法。本发明在常规荧光PCR仪器上实现了单通道多靶点检测，从而将现有的荧光PCR检测通量增加4倍，并且在单管封闭条件下进行，极大降低分子检测的污染。

权利要求

1.一种组合物，包括：

针对流感嗜血杆菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 17所示；

针对肺炎链球菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:18 所示；

针对脑膜炎奈瑟氏菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 19所示；

针对李斯特菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 20所示；

针对大肠杆菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 21所示；

针对乙型脑炎病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 22所示；

针对肠道病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 23所示；

针对人疱疹病毒6型的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 25所示；

针对水痘-带状疱疹病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 26所示；

针对尼帕病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 27所示；

针对波瓦森病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 28所示；

针对西尼罗病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 29所示；

针对1-型单纯疱疹病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 30所示；

针对2-型单纯疱疹病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 31所示；和针对新型隐球菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 32所示。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，SEQ ID NO: 1 7和9 16带有荧光报告基团。

~ ~

3.根据权利要求2所述的组合物，其中，SEQ ID NO: 1 7和9 16同时带有荧光猝灭基~ ~团。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述荧光报告基团与所述荧光猝灭基团之间的间距为15 25nt。

~

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 4具有第一荧光报告基团；

SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO: 7具有第二荧光报告基团；

SEQ ID NO: 9至SEQ ID NO: 12具有第三荧光报告基团；并且SEQ ID NO: 13至SEQ ID NO: 16具有第四荧光报告基团；

其中，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团和所述第四荧光报告基团各不相同。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，SEQ ID NO: 1 7和9 16为上游引~ ~物，SEQ ID NO: 17 23和25 32为下游引物，所述上游引物的用量与所述下游引物的用量之~ ~间的摩尔比为1:2 2:1。

~

7.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括前述权利要求1至6中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于提取样本的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述样本为脑脊液。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物在制备用于检验病原体的试剂盒中的用途，其中，检测病原体的方法包括：提供待测样本；

向待测样本中加入根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，以通过PCR进行扩增；

采集荧光信号强度变化来绘制熔解曲线，以对检测的目标靶序列进行定性分析。

11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述采集荧光信号强度变化为采集特异性引物的扩增产物的荧光信号强度变化。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中，在50℃至95℃下对熔解曲线进行分析，其中，每上升0.5℃采集一次荧光。

说明书

检测病原体的组合物、试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及利用单通道多重实时荧光PCR技术检测尤其是脑炎/脑膜炎/呼吸道多种病原体的组合物。并且本发明还涉及相关试剂盒及其该试剂盒的使用方法。

背景技术

[0002] 脑炎（encephalitis）和脑膜炎（brain fever；meningitis）是脑部受到病原体感染后而患有的疾病，其区别在于受感染的脑部位有所不同，其中脑膜炎涉及脑膜或脑脊膜被感染病原体。它们通常伴有细菌或病毒感染的并发症，比如耳部、窦或上呼吸道感染。其中，造成脑炎和/或脑膜炎的病原体多种多样，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂。

[0003] 目前，临床上已经存在多种检测脑炎和/或脑膜炎病原体的方法，诸如直接进行影像及活组织检查的病原体检查法；脑电图辅助诊断法；影像学检查法；免疫学检查法；细胞学检查法；基因芯片法以及PCR检测方法。然而，在已知的这些方法中，存在检测方法耗时长，取样方式难以接受，诊断效率低或无法确诊以及灵敏度不够高、样品存在污染风险等各种不足。

[0004] 其中，尤其是随着分子诊断学技术的迅猛发展，PCR、RT-PCR、Real-Time PCR、LAMP等新技术正以其高特异性、敏感性和时效性慢慢地在取代传统的病原体分离培养和生化鉴定等敏感性低、费时费力的检测方法。然而，临床诊断的敏感性不仅仅包括检测敏感性AS（analytical sensitivity）还包括临床敏感性CS（clinical sensitivity）。例如呼吸道感染可能由30-40种常见病原体感染引起，如果仅仅检测一个指标，检测敏感性AS再高其临床敏感性也会大打折扣。因此，相对于一次只能检测一种病原体的PCR技术，多重PCR技术以其高通量、高效率、低成本和少耗时的特性而在分子诊断行业越来越被重视。其能够使分子诊断不仅能看到点上的问题还能看到面上的东西，从而增加临床诊断的敏感性。

[0005] 荧光定量PCR在过去的二十多年里得到了飞速的发展，已经渗透到生物技术开发的各行各业。现有的常用荧光定量仪器检测通道为4至5个，因此单管检测的靶基因数量通常也为4至5，这也成为要进行多重实时定量PCR检测的瓶颈。并且，在用一支反应管里通过有限数量的检测通道提高靶点检测的通量的开发中，还需要面对越来越复杂的复合性病原体感染和多基因遗传病诊断的多靶点检测。在进行多重PCR扩增时，还需要面对每增加一对引物便增加对PCR反应体系优化的挑战。

[0006] 因此，在检测脑炎/脑膜炎/呼吸道多种病原体中，希望于不更改现行市面上已有的荧光定量PCR仪的硬件设施前提下，开发单色单通道多靶点的检测，优化PCR反应体系以开发一套成熟的能够解决多靶点扩增检测的技术。

发明内容

[0007] 本发明旨在至少改进现有技术中存在的一些缺陷。至少部分地基于本发明人对单通道中多个靶点利用的荧光产物Tm值不一样来进行熔解曲线分析法，通过是否存在熔解曲线特征峰来判读检测阴阳性，以此实现单管反应检测通量的4倍增加的理解，从而研发了本发明。

[0008] 因此，在第一方面中，本发明提供了一种组合物，包括：

[0009] 针对流感嗜血杆菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 17所示；

[0010] 针对肺炎链球菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 18所示；

[0011] 针对脑膜炎奈瑟氏菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 19所示；

[0012] 针对李斯特菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 20所示；

[0013] 针对大肠杆菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 21所示；

[0014] 针对乙型脑炎病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 22所示；

[0015] 针对肠道病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 23所示；

[0016] 针对人疱疹病毒6型的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 25所示；

[0017] 针对水痘-带状疱疹病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 26所示；

[0018] 针对尼帕病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 27所示；

[0019] 针对波瓦森病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 28所示；

[0020] 针对西尼罗病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 29所示；

[0021] 针对1-型单纯疱疹病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 30所示；

[0022] 针对2-型单纯疱疹病毒的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 31所示；

[0023] 针对新型隐球菌的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 32所示。

[0024] 在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16带有荧光报告基团。

[0025] 在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 16同时带有荧光猝灭基团，优选地，所述荧光报告基团与所述荧光猝灭基团之间的间距为15 25nt。~

[0026] 从而，通过本发明的上述组合物，能够通过一次实验对特定15种病原体进行同时检测分析，为临床及疾控监测提供快速分子诊断解决方案。这15种病原体可用于辅助诊断脑炎、脑膜炎以及呼吸道感染。

[0027] 在具体的实施方式中，其中，SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 4具有第一荧光基团；SEQ ID NO: 5至SEQ ID NO: 7具有第二荧光报告基团；SEQ ID NO: 9至SEQ ID NO: 12具有第三荧光报告基团；并且SEQ ID NO: 13至SEQ ID NO: 16具有第四荧光报告基团；其中，所述第一荧光报告基团、所述第二荧光报告基团、所述第三荧光报告基团和所述第四荧光报告基团各不相同。

[0028] 所述组合物引入用于扩增流感嗜血杆菌（HI），肺炎链球菌（SP）、脑膜炎奈瑟氏菌（NM）、李斯特菌（LM）、大肠杆菌（ECO）、乙型脑炎病毒（JEV）、肠道病毒（EV）、人疱疹病毒6型（HHV6）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、尼帕病毒（NVD）、波瓦森病毒（POWV）、西尼罗病毒（WNV）、1-型单纯疱疹病毒（HSV-1）、2-型单纯疱疹病毒（HSV-2）、新型隐球菌（CN）的如SEQ ID NO: 
1 7、9 23和25 32所示的特异性引物和荧光引物序列。然而，应当知晓的是，本发明的组合~ ~ ~
物可以进一步包括用于扩增除上述15种特定病原体之外病原体的特异性引物对。

[0029] 在一些实施方式中，第一荧光报告基团、第二荧光报告基团、第三荧光报告基团以及第四荧光报告基团可独立地选择FAM、HEX、ROX、CY5、VIC、JOE、TAMRA，但不限于此。在尤其优选的实施方式中，第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为HEX，第三荧光报告基团为ROX，第四荧光报告基团为CY5。

[0030] 在尤其具体的实施方式中，通过具有相同荧光报告基团的引物序列扩增所得到的产物被设计为在不同的温度下显示出特征Tm值；而对于具有不同荧光报告基团的引物序列扩增所得到的产物被设计为在对应相同的温度下显示出特征Tm值。具体地，在本发明中，通过具有第一荧光报告基团的引物序列扩增所得到的产物分别在第一温度、第二温度、第三温度、第四温度下出现熔解曲线峰值；通过具有第二荧光报告基团的引物序列扩增所得到的产物分别在第一温度、第二温度、第三温度下出现熔解曲线峰值；通过具有第三荧光报告基团的引物序列扩增所得到的产物分别在第一温度、第二温度、第三温度、第四温度下出现熔解曲线峰值；通过具有第四荧光报告基团的引物序列扩增所得到的产物分别在第一温度、第二温度、第三温度、第四温度下出现熔解曲线峰值；其中，第一温度、第二温度、第三温度、第四温度各不相同。

[0031] 在一些实施方式中，SEQ ID NO: 1 7和9 16与SEQ ID NO: 17 23和25 32的摩尔~ ~ ~ ~比1:2 2:1，优选1:0.95 0.85，优选1:0.9。
~ ~

[0032] 在一些实施方式中，本发明的组合物可进一步包括内标。示例性的内标包括人内源性管家基因（内标），但不限于管家基因（内标）。在尤其具体的实施方式中，本发明的组合物包括针对示例性内标的引物对，其序列分别如SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 24所示。

[0033] 在一些实施方式中，SEQ ID NO: 8可带有第一、第二、第三或第四荧光报告基团并且可同时带有荧光猝灭基团，优选可带有第二荧光报告基团，并且更优选在第四温度下出现熔解曲线峰值。

[0034] 其中，应当知晓的是，在本发明中，表述“第一”和“第二”等仅用于描述目的，用以区分所限定的物质、温度等，而不以任何方式限定次序或主次。

[0035] 在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明的组合物。

[0036] 在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于提取样本的试剂，优选地，所述样本为脑脊液。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括DNA/RNA提取试剂（Tris-HCL，NaCL，KCL,吐温20，曲拉通X-100）、dNTPs（20-200 μmol/L）、Mg2（+ 1.5-3mmol/L）、Taq聚合酶（0.5-5U/100 μL，pH 8.3-8.5）、PCR缓冲液（100mmol/LTris-HCL，PH8.3;250mmol/L KCL；Mg2+）。

[0037] 在第三方面，本发明提供了使用检验病原体的方法，其中，所述方法包括：

[0038] 提供待测样本；

[0039] 向待测样本中加入本发明的组合物或根据本发明的试剂盒，以通过PCR进行扩增；

[0040] 采集荧光信号强度变化，尤其是采集特异性引物的扩增产物的荧光信号强度变化来绘制熔解曲线，以对检测的目标靶序列进行定性分析。

[0041] 在一些实施方式中，在50℃至95℃下对熔解曲线进行分析，其中，每上升0.5℃采集一次荧光。

[0042] 本发明通过设计特定的特异性引物，从而在荧光引物扩增后，带荧光产物带有不同的Tm值，从而实现在单色荧光通道中同时进行多个，例如4个靶点的检测和分析。从而能够进行特定的15种病原体的检测，突破了单次试验一个样本只能给出4个靶点检测信息的瓶颈，提升临床核酸检测的通量，效率，为临床及科研的多重病原体检测及大的症候群监测提供了简单高效的检测方法。并且其中熔解曲线采取的是核酸杂交的方式，特异性更好，灵敏度更高。更重要的是，检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。

附图说明

[0043] 图1示出了应用本发明组合物的多平台应用的示意图；

[0044] 图2示出了根据发明实施例的FAM通道的阳性检测结果；

[0045] 图3示出了根据发明实施例的HEX通道的阳性检测结果；

[0046] 图4示出了根据发明实施例的ROX通道的阳性检测结果；

[0047] 图5示出了根据发明实施例的CY5通道的阳性检测结果。

具体实施方式

[0048] 总体来讲，通过本发明，能够在于同一管试剂中同时检测多种病原体，尤其是特定的15种病原体。从而尤其是在脑脊液这种取样困难的核酸样品的一次检测中为医生提供更多的靶点检测信息。此外，在本发明中，PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，降低分子检测的污染，同时能对反应过程进行实时监测。

[0049] 更具体地，基于荧光引物扩增后，带荧光产物杂交产生荧光信号的技术原理，针对单色荧光通道中采用熔解曲线的方式，通过产物不同的Tm值进行4个靶点的同时扩增，从而实现在单色荧光通道中进行4个靶点的检测和分析。

[0050] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

[0051] 其中，在下文中，除非另有说明，所有的试剂、仪器等都商购所得。

[0052] 实施例1

[0053] 序列

[0054] 30条引物序列和2条内标序列：SEQ. ID NO: 01-SEQ. ID NO: 32；

[0055] 其中SEQ. ID NO: 08和SEQ. ID NO: 24为内标引物对；

[0056] 特异性地检测流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、脑膜炎奈瑟氏菌（NM）、李斯特菌（LM）、大肠杆菌（ECO）、乙型脑炎病毒（JEV）、肠道病毒（EV）、人疱疹病毒6型（HHV6）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、尼帕病毒（NVD）、波瓦森病毒（POWV）、西尼罗病毒（WNV）、1-型单纯疱疹病毒（HSV-1）、2-型单纯疱疹病毒（HSV-2）、新型隐球菌（CN）的SEQ ID NO: 1 7、9 23和25~ ~ ~32引物序列；

[0057]

[0058]

[0059] 实施例2

[0060] DNA/RNA提取

[0061] 采用磁珠法提取DNA/RNA，在样本处理室进行如下操作：

[0062] 取适量1.5 mL灭菌离心管，分别标记阴性对照、阳性对照及待测样本，每管加入300μL DNA/RNA提取溶液1；

[0063] 每管加入200μL待测样本或阴性对照、阳性对照；盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；

[0064] 每管加入100μLDNA/RNA提取溶液2-mix，充分混匀后吸取，震荡混匀10秒钟后，室温下静置10 分钟；

[0065] 瞬时离心后将离心管置于分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出（注意不要碰到吸附于管壁的棕色物）；

[0066] 每管加入600μL DNA/RNA提取溶液3和200 μL DNA/RNA提取溶液4，震荡混匀5秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

[0067] 约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃。

[0068] 实施例3

[0069] PCR反应

[0070] 每管加入50μL PCR-mix（Mg2+，dNTPs，MMLV，Taq酶，引物，PCR缓冲液），用吸头吸取PCR-mix洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量使其完全洗脱，然后将洗脱后的所有棕色混合液转移至0.2mL PCR反应管中，盖上管盖，转移到扩增检测区。

[0071] 使用宏石SLAN-96P全自动医用PCR分析系统进行以下分析。

[0072] 其中，荧光PCR反应体系如表1中所示。PCR扩增程序如表2所示。

[0073]

[0074] 实施例4

[0075] 利用各靶标的阳性质粒做模板，模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。

[0076] 利用荧光引物扩增后产物杂交产生荧光信号的技术原理，通过熔解曲线法检测靶点，其中，在Tm时有无特征峰作为阴阳性判定标准，在特定的Tm温度下，有特征峰，则为阳性；若无，则为阴性。

[0077] 在该示例性实施例中，示例性地，第一温度可大致设置为67℃±1℃；第二温度可大致设置为71℃±1℃；第三温度可大致设置为75℃±1℃；第四温度可大致设置为81℃±1。示例性地，可将靶点HI、ECO、HHV6、WNV的熔解曲线峰值设计在第一温度，即，67℃±1℃；
将靶点SP、JEV、VZV、HSV1的熔解曲线峰值设计在第二温度，即，71℃±1℃；将靶点NM、EV、NVD、HSV2的熔解曲线峰值设计在第三温度，即，75℃±1℃；将靶点LM、POWV、CN的熔解曲线峰值设计在第四温度，即，81℃±1℃；以及内标IC的熔解曲线峰值设计在第四温度。

[0078] 目的检测信号为FAM，HEX、ROX、CY5。结果示出在图2至图5中。

[0079] 结果分析

[0080] A. FAM通道（参见图2）：

[0081] 在温度约为67℃时出现熔解曲线峰，证实存在流感嗜血杆菌（HI）病原体；

[0082] 在温度约为71.5℃时出现熔解曲线峰，证实存在肺炎链球菌（SP）病原体；

[0083] 在温度约为76.5℃时出现熔解曲线峰，证实存在脑膜炎奈瑟氏菌（NM）病原体；

[0084] 在温度约为82℃时出现熔解曲线峰，证实存在李斯特菌（LM）病原体。

[0085] B. HEX通道（参见图3）：

[0086] 在温度约为67.1℃时出现熔解曲线峰，证实存在大肠杆菌（ECO）病原体；

[0087] 在温度约为71.8℃时出现熔解曲线峰，证实存在乙型脑炎病毒（JEV）病原体；

[0088] 在温度约为76.3℃时出现熔解曲线峰，证实存在肠道病毒（EV）病原体；

[0089] 在温度约为81.5℃时出现熔解曲线峰，证实内标为阳性。

[0090] C. ROX通道（参见图4）：

[0091] 在温度约为64.9℃时出现熔解曲线峰，证实存在人疱疹病毒6型（HHV6）病原体；

[0092] 在温度约为71.9℃时出现熔解曲线峰，证实存在水痘-带状疱疹病毒（VZV）病原体；

[0093] 在温度约为76.2℃时出现熔解曲线峰，证实存在尼帕病毒（NVD）病原体；

[0094] 在温度约为82.2℃时出现熔解曲线峰，证实存在波瓦森病毒（POWV）病原体。

[0095] D. CY5通道（参见图5）：

[0096] 在温度约为63.9℃时出现熔解曲线峰，证实存在西尼罗病毒（WNV）的病原体；

[0097] 在温度约为71.1℃时出现熔解曲线峰，证实存在1-型单纯疱疹病毒（HSV1）病原体；

[0098] 在温度约为76.1℃时出现熔解曲线峰，证实存在2-型单纯疱疹病毒（HSV2）病原体；

[0099] 在温度约为80.8℃时出现熔解曲线峰，证实存在新型隐球菌（CN）病原体。

[0100] 尽管参照本发明的实施例详细描述了本发明，但提供这些实施例是为了说明而不是限制本发明。根据本发明原理能够得到的其它实施例均属于本发明权利要求所界定的范畴。