狼毒乙素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用

摘要

本发明涉及狼毒乙素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。本发明首次研究发现，狼毒乙素具有一定的抗黑色素瘤生长和转移的效果，进一步研究了狼毒乙素对肿瘤增生的治疗效果和机制研究。这种作用是通过抑制血管内皮生长因子及关联受体来实现的。

权利要求

1.狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤药物中的应用。

2.狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤在体内的转移的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述黑色素瘤由人黑色素瘤细胞A2058细胞导致。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述狼毒乙素作为所述药物中唯一活性成分或活性成分群中的一种。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述药物为颗粒剂、片剂、胶囊剂或注射液。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述药物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

说明书

狼毒乙素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及狼毒乙素在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 恶性黑色素瘤是最严重的一种皮肤癌，发病机理是皮肤中黑色素细胞发生超常增生。目前尚没有治疗痊愈的药物，黑色素瘤细胞在体内迅速转移，而转移性黑色素瘤的患者生存期不超过五年。自2011年以来，FDA批准威罗菲尼(Vemurafenib)等八种药物用于晚期黑色素瘤的治疗。然而一旦黑色素瘤涉及大脑和内脏器官，在很大程度上无法通过分子靶向治疗或新型免疫疗法实现长期的缓解。黑色素瘤的顽固给医学带来了难题。

发明内容

[0003] 本发明首次研究发现，狼毒乙素(2，4‑dihydroxy‑6‑methoxy‑3‑methylacetophenone，ECB)具有一定的抗黑色素瘤生长和转移的效果。因此，本发明提出狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤药物中的应用。

[0004] 本发明所述狼毒乙素结构式如下，其分子式：C10H12O4，分子量：196.20。

[0005]

[0006] 本发明所述狼毒乙素为已知的可自行制备或可市售购得的化合物，例如可购自中国药品生物制品鉴定所。

[0007] 本发明使用注入有黑色素瘤细胞的转基因斑马鱼作为模型动物，研究了狼毒乙素对肿瘤增生的治疗效果和机制研究。结果表明，狼毒乙素与肿瘤抑制剂PTK相似，不但抑制了斑马鱼肠下血管(SIV)的数量和长度(p＜0.05)、也抑制了黑色素瘤体内的转移和分布(p＜0.05)，同时抑制体外细胞的增长和扩散。更重要的是，与血管抑制剂Vatalanib(PTK787)2HCL(PTK)不同，狼毒乙素只对异常生长的血管有抑制作用。基因水平检测也发现狼毒乙素也抑制了调控血管的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR2)和VEGFR3 mRNA的表达。以上结果表明，狼毒乙素具有一定的抗黑色素瘤生长和转移的效果，这种作用是通过抑制血管内皮生长受体来实现的。

[0008] 基于以上研究，本发明提出狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤药物中的应用。具体地，所述应用是狼毒乙素通过抑制血管内皮生长因子及关联受体来实现的。具体地，所述应用是通过狼毒乙素抑制调控血管的血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和VEGFR3 mRNA的表达来实现的。

[0009] 进一步地，本发明还提出狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤组织血管数量和长度的药物中的应用。

[0010] 进一步地，本发明还提出狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤在体内的转移和分布的药物中的应用。

[0011] 进一步地，本发明还提出狼毒乙素在制备抑制黑色素瘤体外细胞的增长和扩散的药物中的应用。

[0012] 具体地，本发明所述黑色素瘤由人黑色素瘤细胞A2058细胞导致。

[0013] 进一步地，本发明包括上述狼毒乙素在制备治疗和/或预防黑色素瘤药物中的应用在内的应用，其中狼毒乙素可以作为所述药物中唯一活性成分或活性成分群中的一种，所述活性成分群中的其他活性成分为化学药或天然产物。

[0014] 本发明包括上述治疗和/或预防黑色素瘤药物以口服剂、透皮吸收剂或注射剂的形式存在。

[0015] 进一步地，本发明所述治疗和/或预防黑色素瘤药物可以直接为狼毒乙素，或进一步加入药学上可接受的赋形剂制备成常见剂型应用在治疗和/或预防黑色素瘤药物中，理想的剂型如颗粒剂、片剂、胶囊剂、注射液等，具体为本领域技术人员所掌握。所述药物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

[0016] 本发明还提供治疗和/或预防黑色素瘤的方法，包括给予患病个体或患者施予有效量的狼毒乙素。其中，所述患病个体或患者包括人或哺乳动物等。

附图说明

[0017] 图1表示ECB对黑色素瘤细胞造成转基因Tg(flk1：GFP)斑马鱼胚胎血管生成的抑制作用。48hpf斑马鱼胚胎注入黑色素瘤后，分别在24h和48h后使用荧光显微镜拍照观察。图1中，A、E：黑色素瘤细胞植入24h后(24hpi)的SIV血管，B、F：48hpi的SIV血管，C、G：24hpi+
20μg/ml的ECB进行处理24h后的SIV血管。D、H：24hpi+1μM PTK进行处理24h后的SIV血管，红色箭头表示新形成的SIV的异位血管。bar＝100μm。

[0018] 图2表示ECB对黑色素瘤造成斑马鱼胚胎SIV血管增生的抑制作用。48hpf斑马鱼胚胎注入黑色素瘤后，分别在24h和48h后使用荧光显微镜照相，计数SIV部位异位血管数量和长度。图2中，A：A2058细胞和MDBK细胞24hpi、48hpi、以及ECB和PTK处理组的血管数量(*p＜0.05)；B：A2058细胞和MDBK细胞24hpi、48hpi、以及ECB和PTK处理组的血管长度(*p＜
0.05)。

[0019] 图3中：图3‑1表示ECB对正常斑马鱼SIV和ISV血管发育的影响。其中，2hpf斑马鱼胚胎分别使用ECB和PTK处理72h后在荧光显微镜照相。图3‑1中，AD：对照组，BE：ECB，CF：PTK组，其中A、B、C组箭头指向SIV血管；D、E、F组箭头指向ISV血管。图3‑2表示ECB对正常斑马鱼胚胎血管的抑制作用。对SIV血管的面积以及周长进行统计。A：SIV血管的面积(***p<0.001)；B：SIV血管的周长(***p＜0.001)。

[0020] 图4表示ECB对斑马鱼体内黑色素瘤细胞转移的影响。其中，给48hpf斑马鱼胚胎注入黑色素瘤细胞后，分别在6h，24h和48h后，使用荧光显检测细胞分布情况。图4中，A：无细胞注射；B、C、D：黑色素细胞注入斑马鱼体内后，6h、24h、48h后的转移情况；E：注射黑色素瘤细胞24h后，20μg/ml ECB处理24h后的细胞分布；F：注射黑色素瘤细胞24小时后，1μM PLX处理24h后细胞的体内的分布。Bar＝100μm。

[0021] 图5表示ECB对斑马鱼体内黑色素瘤细胞的抑制作用。其中，给48hpf斑马鱼胚胎注入黑色素瘤后培养48h，使用荧光显微镜照相，测量黑色素瘤细胞在斑马鱼体内面积，定量细胞分布。***表示差异极显著(p＜0.001)。

[0022] 图6表示ECB对斑马鱼胚胎VEGFA、VEGFR2、VEGFR3基因表达的影响。图6中，A：在48hpi，Co组、A2058组、ECB组以及PTK组VEGFA基因的表达。B：在48hpi，Co组、A2058组、ECB组以及PTK组VEGFR2基因的表达(p＜0.05)。C：在48hpi，Co组、A2058组、ECB组以及PTK组VEGFR3基因的表达(p＜0.05)。

[0023] 图7表示ECB对黑色素瘤斑马鱼P53mRNA和Caspase 3表达的影响。其中，黑色素瘤注入斑马鱼胚胎后24h，加入ECB 20mg/ml，1μM PTK、1μM PLX、以及黑色素瘤斑马鱼组(A2058)处理24小时至48hpi，提取各组RNA后分别进行P53和caspase‑3基因的定量，*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.0001。

[0024] 图8表示ECB对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用。其中，A2058细胞生长至80％左右使用0、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的ECB以及1μM PLX进行处理1h、2h、6h和24h，然后进行细胞计数，统计细胞增长率。比例尺为200μm。

[0025] 图9表示ECB对黑色素瘤细胞增长率的影响。A2058细胞生长至80％左右使用0、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的ECB以及1μM PLX进行处理1h、2h、6h和24h，之后进行细胞计数。A图显示在2小时0(Co)、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的ECB以及1μM PLX细胞增长率；图B显示20μg/ml的ECB处理A2058细胞，在1、2、6、24h时的细胞增长率。*表示差异显著(p＜0.05)。*表示差异显著(p＜0.05)。

[0026] 图10表示ECB诱导黑色素瘤细胞凋亡。A2058细胞生长至80％左右使用0(Co)、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的ECB以及1μM PLX分别进行处理2小时，然后分别进行细胞凋亡染色，进行统计细胞凋亡率。箭头指示为凋亡的细胞(核浓缩)，，星为凋亡的细胞小体。比例尺为200μm。

[0027] 图11表示定量ECB诱导黑色素瘤细胞凋亡.A2058细胞生长至80％左右使用0(Co)、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的ECB以及1μM PLX分别进行处理1h、2h、6h和24h，然后分别进行细胞凋亡染色，统计细胞凋亡率。A图显示在2小时0(Co)、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的ECB以及1μM PLX细胞凋亡率；图B显示20μg/ml的ECB处理A2058细胞，在1、2、6、24h时的细胞凋亡率。*表示差异显著(p＜0.05)。

具体实施方式

[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0029] 1.概述

[0030] 黑色素瘤是一种严重的恶性皮肤癌，目前仍然在寻求有良好疗效的治疗药物。血管生成对于肿瘤生长是必需，更是癌症发展的标志，因为它对癌症的生长和转移至关重要，并为癌细胞迁移(转移)提供了途径。然而，当前血管生成的测定太复杂而不能用于药物筛选。本发明的发明人通过大量实践发现，斑马鱼可用于筛选影响黑色素瘤影响血管生成。本研究使用Tg(flk1：GFP)转基因斑马鱼为模型，当斑马鱼胚胎被注入黑色素瘤细胞后，增生的血管经过量化后，探讨狼毒乙素(ECB)对增生血管的抑制效果，并对相应的机制做初步探讨。

[0031] 2.材料和方法：

[0032] 2.1药品与试剂

[0033] A2058(人黑色素瘤细胞)和MDBK均购自美国典型培养物保藏中心(American Type Clture Collection，ATCC)(Manassas，VA，USA)。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素TM和链霉素均购自美国HyClone(Logan，UT，USA)公司。Vybrant  CM‑DiI Cell‑Labeling Solution (CM‑DiI)和Terminal DeoxynucleotidylTransferase，recombinant购买于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)，Vatalanib(PTK787)2HCL购买于APEXBIO(Houston，TX，USA)，PLX‑4720(PLX)购买于MedChemExpress(New Jersey，NJ，USA)，ECB(狼毒乙素)购自于(中国药品生物制品鉴定所)，High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，购买于TM TM
Applied Biosystems (Carlsbad，CA，USA)，TB  Premix Ex Taq  II(TliRNaseH TM
Plus)购买于Takara(Japan)，购买于Invitrogen (Carlsbad，CA，USA)，其他药品与试剂购自Sigma Aldrich(St.Louis MO，USA)。

[0034] 2.2斑马鱼培养

[0035] 斑马鱼由军事医学科学院赠送，饲养于北京爱生公司生产的斑马鱼养殖系统中，保持饲养水温28.5℃、光照时间为14h/d。试验前一天傍晚，随机选取3条雌鱼和6条雄鱼放在同一斑马鱼专用孵化缸中混养，于第2日8:00开灯，待其自然交配后，挑选发育正常的受精卵进行培育至12hpf，加入PTU进行色素处理。斑马鱼养殖和试验流程经过内蒙古民族大学动物保护协会批准。

[0036] 2.3斑马鱼黑色素肿瘤异种移植模型的建立

[0037] 将标记好的A2058细胞(人黑色素瘤细胞)进行细胞计数，调整浓度3×107个细胞/mL，使用显微注射仪将细胞注射至48hpf斑马鱼卵黄囊内，注射体积10nL，每尾斑马鱼约注射300个细胞。注射细胞后的斑马鱼放置35℃恒温生化培养箱培2h然后放入28℃恒温生化培养箱培养22h后在荧光显微镜下筛选荧光量一致的斑马鱼，进行下一步实验。

[0038] 2.4药物处理及血管数量长度以及斑马鱼体内黑色素瘤面积的计算

[0039] 斑马鱼细胞移植后24小时在荧光显微镜下分别使用x100和x200倍率，拍摄SIV血管和斑马鱼体内黑色素瘤荧光面积，使用Image J进行SIV异位血管的长度和荧光面积进行测量，并计数异位血管增长的数量。统计长度数量和面积之后将其放入6孔板中，分别加入ECB、PTK、PLX以及对照组继续培养24小时，之后进行拍照统计。

[0040] 2.5细胞培养及标记

[0041] 人黑色素瘤细胞A2058以及阴性对照细胞(MDBK)均从美国ATCC购买，A2058以及MEDK均使用含10％胎牛血清1％双抗的DMEM完全培养基，在37℃二氧化碳恒温培养箱中培养(CO2浓度为5％)。肿瘤细胞培养至60％‑70％，使用CM‑Dil进行标记20min，用HBSS清洗3次，每次10分钟，继续放入培养基培养过夜，第二日用胰酶消化、清洗，收集用于注射的细胞。

[0042] 2.6 RNA的提取及实时定量PCR(RT‑PCR)技术：

[0043] 采用Trizol法制备总RNA，样品匀浆后加入Trizol(Gibco产品)裂解细胞，加入氯仿于4℃、12000rpm/min下离心15min；离心后取上层水相到新管中，用异丙醇沉淀RNA。反转录体系为10 x RT Buffer 2μl，25 x dNTPMix(10Mm)0.8μl，10 x RT Random Primers 2.02μl，Reverse Transcriptase 1μl，Rnase Inhibitorl 0.1μl Nuclease‑free水3.2μl，模板RNA 10μl。反应条件25℃10min，37℃120min，85℃5min。qPCR采用20μl反应体系，sybr GreenI PCR反应混合液10μl，Dye 0.4μl，上下游引物各2.5μl，cDNA 4.6μl(11.5ng)。在95℃10min，然后95℃15s，60℃1min条件下反应40个循环。试验采用18s作为内参基因，计算采‑△△CT
用2 方法来计算基因表达的相对变化。

[0044] 2.7贴壁细胞TUNEL染色：

[0045] 将细胞爬片放入24孔板中，导入A2058细胞进行培养1天，待细胞生长到80％左右后，分别使用0(对照)、0.2、2、20μg/mlECB和黑色素瘤抑制剂1μmPLX处理24小时后，弃去上清，用PBS清洗三遍后，用4％PFA固定20min，PBST清洗后，使用1mg/mlProteinase K室温下孵育30min.经过TNEL Buffer37℃孵育60分钟后，加入TUNEL反应液4℃过夜，PBST清洗后使用3，3‑二氨基联苯胺(3，3‑diaminobenzidine，DAB)染色液发色，之后封片显微镜观察。

[0046] 2.8细胞计数方法：

[0047] 在六孔板中均匀的加入2ml的细胞悬液，放在二氧化碳培养箱中培养至细胞贴壁80％左右后拍照，每组选取5个视野进行计数(A1)，分别加入0(对照组)、0.2μg/ml、2μg/ml、
20μg/ml ECB和1μM PLX处理24小时后再进行拍照，每组选取5个视野进行计数(A2)。细胞增长率＝(A2‑A1)/A1。

[0048] 2.9统计分析：

[0049] 用GraphPad Prism 5软件进行数据集统计，对各组进行多重比较。使用t检验对两组进行对比统计。结果以 差表示，差异显著性水平设置为*p＜0.05，**p＜0.01；***p＜0.001。

[0050] 3.结果

[0051] 3.1 ECB对黑色素瘤造成斑马鱼胚胎血管增生的抑制作用

[0052] 荧光转基因Tg(flk1：GFP)斑马鱼胚胎在发育到48hpf时进行显微注射。将带有红色荧光染料标记的A2058(黑色素瘤细胞)注射入48hfp斑马鱼胚胎体内，注射后24h分别加入20μg/ml的ECB和1μM的Vatalanib(PTK787)2HCL(PTK)进行处理，24小时后对SIV的异位血管数目和长度进行测量(图1)。分别测量24hpi、48hpi的对照组(MDBK)细胞与A2058细胞注射组的SIV长度异位血管长度，24hpi与48hpi相比，A2058黑色素瘤组都显著高于对照组(p＜0.01)。当经过20μg/ml ECB以及肿瘤血管抑制剂处理(1μM PTK)后，与血管抑制剂类似，ECB减少SIV异位血管的长度是A2058的0.5倍以上，差异极显著(p＜0.001)，与对照组(MDBK)相比，无显著性差异(p＞0.05)(图2)。

[0053] 3.2 ECB对正常血管发育的影响

[0054] 荧光转基因Tg(flk1：GFP)斑马鱼胚胎在受精后2小时(2hpf)挑选正常的胚胎置于六孔板中，每孔10颗胚胎。分别暴露0(Co)、0.2、2、20μg/ml的ECB以及1μM PTK至72hpf测量斑马鱼SIV血管的周长以及面积(图3)。经过测量不同浓度的ECB组与Co比较没有显著性差异，而血管抑制剂PTK组与对照组和ECB组相比SIV血管的面积减少10倍，SIV血管周长减少3倍，具有显著性差异(p＜0.05)。

[0055] 3.3 ECB对斑马鱼黑色素瘤细胞在体内转移的影响

[0056] 在48hpf的斑马鱼体内注入等量的黑色素瘤细胞，分别在注射后6h、24h、48h观察黑色素瘤在斑马鱼体内的转移情况。注射24h后(24hpi)，使用ECB以及黑色素瘤抑制剂PLX‑4720处理24小时后观察(图4)。实验结果显示6hpi、24hpi、48hpiA2058细胞在斑马鱼体内的
2 2 2
面积分别为0.009mm 、0.01mm、0.013mm ；在斑马鱼体内转移呈现上升趋势，但差异不显著。
当20μg/mlECB和黑色素瘤抑制剂PLX处理24小时后，A2058细胞在斑马鱼体内的面积的面积
2
都减少到0.004mm；是未处理组的3倍(p＜0.001)。其他各组之间没有显著性差异(图5)。

[0057] 3.4 ECB对黑色素瘤诱导斑马鱼肿瘤血管VEGF、VEGFR2、VEGFR3mRNA表达的影响[0058] A2058(黑色素瘤细胞)注射入48hpf斑马鱼胚胎，当胚胎发育到72hpf(24hpi)时，分别用0(Co)、20μg/ml的ECB和1μM的PTK处理24h，之后提取RNA，用于VEGF、VEGFR2、VEGFR3基因的表达定量(图6)。ECB和血管抑制剂PTK能下调VEGF基因的表达，其中PTK显著下调VEGFR2基因的表达，是Co的0.6倍。ECB和PTK也显著下调VEGFR3基因是Co的0.5和0.38倍(p＜0.05)。

[0059] 3.5 ECB对黑色素瘤斑马鱼细胞凋亡关联基因表达的影响

[0060] 培养A2058黑色素瘤细胞使用CM‑Dil进行标记后注射到发育至48hpf斑马鱼胚胎体内，在24hpi加入ECB 20mg/ml，1μM PTK、1μM PLX、以及黑色素瘤斑马鱼组(A2058)。实验结果显示ECB注射可明显上调P53基因，是A2058组的2.3倍(p＜0.05)，而PTK和PLX组于A2058组没有显著性差异(p＞0.05)(图，7A)。同时ECB处理组明显上调了caspase‑3基因的表达，是A2058处理组的2.9倍(p＜0.05)，而PTK处理和PLX处理组和A2058组没有显著性差异(图7B)。

[0061] 3.6 ECB对体外黑色素瘤细胞的影响

[0062] A2058黑色素瘤细胞培养至六孔板中，培养至80％，分别加入不同浓度的ECB(0、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml)以及1μMPLX，分别培养1h、2h、6h和24h后进行观察计数(图8)。
0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/mlECB处理组和1μMPLX组与对照组相比能抑制细胞的生长。在2h时0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/mlECB处理组和PLX组细胞增长率与Co相比分别显著减少了1.5(p＞0.05)、1.8(p＜0.05)、2.6(p＜0.05)和2倍(p＜0.05)(图9A)，20μg/ml的ECB处理A2058细胞，在1、2、6、24h时的细胞增长率显著低于Co组(图9B)。

[0063] 3.7 ECB诱导黑色素瘤细胞的凋亡

[0064] 将细胞爬片放入24孔板中，导入A2058细胞进行培养1天，待细胞生长到80％左右后，分别使用0(Co)、0.2、2、20μg/mlECB和1μMPLX分别处理1h、2h、6h和24h后，弃去上清用4％PFA固定20分钟进行细胞凋亡染色，之后进行观察计数(图10)。与对照组相比0.2μg/ml、
2μg/ml和20μg/mlECB处理组和PLX组都能够促进A2058细胞的凋亡，在2h时Co组、0.2μg/ml、
2μg/ml和20μg/ml ECB处理组和PLX组细胞凋亡率分别是2.75％、5.57％、7.4％、10.8％和
11.2％，且20μg/mlECB处理组和PLX处理同样，与Co组和0.2μg/ml处理组有显著差异(p＜
0.05)(图11A)；使用20μg/mi的ECB处理A2058细胞，在1、2、6、24h时的细胞凋亡率分别是
4.75％，10.8％，12.75％和4.75％(p＜0.05)(图11B)。

[0065] 讨论

[0066] 为评价ECB对黑色素瘤的抑制作用，本文使用了Tg(flk1：GFP)转基因斑马鱼胚胎作为活体实验模型，通过显微注射，将带有红色荧光染料标记的A2058(黑色素瘤细胞)注射入48hfp斑马鱼体内，发现的ECB对斑马鱼SIV的异位血管长度和数量的增加有显著的抑制作用。也同样抑制A2058细胞在斑马鱼体内的迁移。进一步通过检测与血管生长相关的VEGFA、VEGFR2、VEGFR3mRNA表达的影响，发现ECB可以降低这些基因的表达。并且ECB能够促进斑马鱼P53以及Caspase‑3基因的表达。体外实验也发现ECB能够有效抑制A2058细胞的增长，促进A2058细胞的凋亡，这种凋亡存在浓度依存性，特别是20μg/ml的EBC差异显著的增加细胞凋亡，在ECB处理1h后，这种凋亡现象开始出现，从2h至6h凋亡达到高峰，之后下降，当到24h细胞凋亡已经是基础水平。

[0067] 在胚胎发育过程中，血管网络的重塑，用来满足不断增长的组织对氧气和养分的需求。肿瘤的发生和转移，更是加大了血管的增生，而大部分抗癌药物是通过抑制血管增生这个机制达到抑制癌症。血管生成抑制剂Su 5416短时间暴露(1h)便能阻止新的血管生成和血管生成血管的形成。而TNP470需要连续暴露以阻断SIV的形成，并且对已经生成血管无明显影响我们使用斑马鱼黑色素瘤模型，观察胚胎的肠下静脉(SIV)，发现ECB抑制SIV长度，降低血管数量。Lenard认为血管的减少是通过细胞自融合形成瞬时单细胞管。并且修剪细胞，重新加入相对的分支这种机制尚的阐明尚需要更多研究。

[0068] 有关癌症及其血管形成的机制尚不清楚。

[0069] 本文使用斑马鱼胚胎，制作黑色素瘤斑马鱼模型，狼毒乙素处理后，发现增生的血管被抑制，而这种抑制是与Caspase3和P53的增高相关联，但Bax和Bcl‑2并没有显著变化(结果未加入)。另外，我们使用ECB分别处理体外培养的黑色素瘤细胞，经过1，、2、6h以及24h处理后，结果显示ECB整体抑制了黑色素瘤细胞增长，但2‑6h的抑制率最为显著。同时发现狼毒乙素在2‑6h时期也显著增加了黑色素瘤细胞的细胞凋亡，说明狼毒乙素抑制细胞增殖可能是通过细胞凋亡来实现的。

[0070] 结论

[0071] 本实验研究了ECB对人源黑色素瘤在斑马鱼体内诱发血管增生的抑制作用。ECB不但抑制了黑色素瘤诱导的斑马鱼SIV血管的增生、也抑制了黑色素瘤在斑马鱼体内的转移和分布。在体外，ECB抑制体黑色素瘤细胞的增长和扩散，促进黑色素瘤细胞的凋亡。这种抑制作用也许是通过抑制调控血管的VEGF、VEGR2和VEGFR3等调控受体的表达来实现，血管的减少可能是通过细胞凋亡途径造成。更为值得关注的ECB只对抑制异常生长的血管发育，而不同于血管抑制剂全面抑制血管的生长，表明ECB用于医疗，有优良的价值。

[0072] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。