在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法转让专利
申请号 : CN201911321998.4
文献号 : CN111066727B
文献日 : 2021-08-27
发明人 : 殷骏 , 倪兵 , 高钰琪 , 廖卫公 , 邓芳 , 柳君泽 , 高志奇 , 陈德伟 , 何文娟 , 赵力 , 张梦洁 , 唐中伟 , 陈建 , 刘宝 , 张二龙 , 徐刚 , 孙滨达 , 王泽军 , 张健阳 , 李晓栩 , 周思敏 , 杨天 , 钟志凤
申请人 : 中国人民解放军陆军军医大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤一,使用睾丸特异性mTOR单基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠为对象;通过低氧诱导构建缺氧性血睾屏障通透模型,分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM‑B表达水平;
步骤二,运用mTOR阻断剂作为手段,将C57BL/6小鼠分为两组;一组行mTOR阻断剂处理;
另一组以生理盐水作为对照;比较两处理组小鼠在低氧诱导后,曲精小管的病损程度及JAM‑B的表达水平;
步骤三,分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细胞作为研究对象;体外低氧暴露下,运用westernblot、免疫细胞化学、qPCR技术,比较刺激后两组支持细胞分泌JAM‑B的能力,体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中,mTOR抑制支持细胞表达JAM‑B的调节作用和分子机制;
步骤四,体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小管原代培养细胞系和小鼠支持细胞株TM4;比较两刺激组间JAM‑B的表达水平;
步骤五,在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM‑B的活化作用;
步骤六,在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR作用后,运用野生型小鼠作为研究对象,使用mTOR重组蛋白体内促进mTOR表达,分析比较mTOR对缺氧性血睾屏障通透潜在的效果。
2.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤五中,所述在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM‑B的活化作用为:①qPCR和WB明确小鼠睾丸和支持细胞TFEB表达水平,通过激活HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM‑B表达,佐证mTOR调节性诱导JAM‑B是否依赖TFEB失活予以实现;
②通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF‑1α活化程度显著高于对照组支持细胞,并且HIF‑1α结合JAM‑B转录启动子区缺氧反应元件的结果,实验佐证mTOR调节性诱导JAM‑B表达是否依赖HIF‑1α激活予以完成。
3.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,所述明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用的方法包括:(1)建立低氧诱导的WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠缺氧性血睾屏障通透模型:
20至25g雄性小鼠采用11.5%氧含量低氧处理,每组共20只小鼠;分别于0、15、30、60天后分析小鼠的血睾屏障及曲精小管病损指标,根据指标初步断定模型的建立是否成功;
(2)观察WT小鼠和mTOR基因敲除小鼠在低氧诱导之后的生理变化:低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和WT小鼠后开始观察小鼠的活动状况,并于0、15、30、60天四个时相点将两组小鼠处死,分别收集两组小鼠低氧诱导不同时间的小鼠附睾曲精小管组织和性腺组织,ELISA检测两组小鼠不同时间点PI3K/Akt/mTOR途径指标Akt、RagA、Rhe B和mTORC1,观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、透射电镜下曲精小管、性腺病理改变和血睾屏障结构改变,包括组织坏死程度,支持细胞和生殖细胞凋亡;
(3)分析mTOR阻断剂在低氧诱导缺氧性血睾屏障通透中的作用:将野生型小鼠分为两组,一组体内注射mTOR阻断剂,另一组体内注射生理盐水后同时对两组小鼠进行低氧诱导,比较两组小鼠刺激0、15、30、60天四个时相点曲精小管和血睾屏障病损程度。
4.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,所述步骤三还包括体外明确mTOR对JAM‑B的调节作用的方法,具体包括:(1)分离野生型小鼠及mTOR基因敲除小鼠曲精小管支持细胞:小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养、流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达、体外检测低氧诱导野生型及mTOR基因敲除小鼠原代细胞JAM‑B的表达水平;
(2)体外检测低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系后JAM‑B表达水平:分别用单独低氧和低氧+重组mTOR蛋白刺激细胞系,比较两刺激组细胞。
5.如权利要求4所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,所述体外检测低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系后JAM‑B表达水平:分别用单独低氧和低氧+重组mTOR蛋白刺激细胞系,比较两刺激组细胞包括:
1)ELISA检测两刺激组细胞上清JAM‑B表达水平;
2)qPCR检测两刺激组细胞内JAM‑B mRNA的转录水平;
3)WB检测两刺激组细胞内JAM‑B蛋白表达水平。
6.如权利要求4所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤(1)中,所述小鼠曲精小管支持细胞的分离及培养方法为:将10只8周龄体重为
20‑25g的野生型和mTOR基因敲除雄性小鼠眼眶放血处死,分别附睾注射不含小牛血清的DMEM培养液5ml‑8ml,轻柔小鼠睾丸部2‑3min,无菌条件下,剪碎睾丸,用注射器抽取睾丸液,在含10%小牛血清的RPMI‑1640培养液中培养并用显微镜观察细胞生存状态,6h贴壁细胞即为支持细胞并换液。
7.如权利要求4所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,步骤(1)中还包括,流式细胞技术检测小鼠曲精小管支持细胞上mTOR的表达的方法为:收集小鼠曲精小管支持细胞,将得到的细胞用anti‑FcγR处理,4℃30分钟,封闭非特异性抗体结合位点,按照抗体使用说明书要求,加入适量的ATP与Trx荧光抗体于细胞悬液中,
4℃避光孵育30分钟后,PBS洗涤两遍,洗去多余抗体,最后用100ulPBS重悬,标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测,所得数据用FlowJo软件对细胞表型进行分析。
8.如权利要求1所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,所述步骤三还包括:体外佐证mTOR对JAM‑B调节作用的分子机理,具体包括:(1)比较低氧诱导mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠不同时间点小鼠睾丸曲精小管组织中TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号活化程度:用低氧分别对mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠进行诱导,在0h,24h,48h时间点处死小鼠后分离小鼠睾丸曲精小管组织,WB检测比较两组小鼠诱导不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号通路的活化程度,筛选出缺氧性血睾屏障通透发病中mTOR下游信号通路具体活化的信号途径,进而从体内明确mTOR下游效应分子TFEB和P70S6K1对HIF‑1α的调节作用;
(2)检测低氧曝露下mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠曲精小管支持细胞的TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号活化程度:分离mTOR基因敲除小鼠和野生型小鼠的原代细胞,并用低氧对其进行诱导,比较低氧曝露两组细胞后不同时间点细胞TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号通路的活化水平;
(3)比较低氧和重组mTOR蛋白诱导细胞系TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号表达水平:分别用单独低氧或联合重组mTOR蛋白刺激细胞系,比较两刺激组细胞不同时间点TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号途径的活化情况;
(4)评价低氧诱导缺氧性血睾屏障通透模型中,TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号通路阻断剂对JAM‑B产生的影响:选取精母细胞系作为研究对象,ELISA、WB实验比较低氧、mTOR单抗、低氧+mTOR单抗、低氧+mTOR单抗+TFEB、低氧+mTOR单抗+HIF‑1α刺激组刺激细胞后,细胞产生JAM‑B的能力。
9.如权利要求2所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,所述体内分析重组mTOR蛋白激活JAM‑B表达对缺氧性血睾屏障通透可能的治疗效果包括:在明确mTOR激活JAM‑B表达的分子基础上,拟进一步采用野生型小鼠作为对象,将其分为两组,一组通过尾静脉注射的方式注射重组mTOR蛋白,另一组用IgG作为对照,而后对两组小鼠进行低氧诱导。
10.如权利要求9所述在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法,其特征在于,进一步包括:
(1)比较两组小鼠在低氧诱导后睾丸曲精小管和血睾屏障病损状况:分别在两组小鼠低氧诱导后的0h,24h,48h处死小鼠,分离其睾丸组织,石蜡包埋并切片,H/E染色显示两组小鼠附睾组织坏死程度,免疫组化染色显示其生殖细胞凋亡程度及透射电镜下睾丸曲精小管和血睾屏障病理改变,包括组织坏死程度,支持细胞和生殖细胞凋亡;
(2)观察两组小鼠低氧诱导后JAM‑B表达情况:在低氧诱导两组小鼠的0h,24h,48h处死小鼠,分别收集性腺、睾丸组织,qPCR及免疫组化分析两组小鼠睾丸组织中JAM‑B的表达情况,比较其曲精小管中JAM‑B的水平,明确重组单抗mTOR是否存在治疗作用,进一步佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。
说明书 :
在低氧性血睾屏障通透中作用机制的小鼠模型构建方法
技术领域
背景技术
数量减少现象已有报道。以上资料只是表明缺氧引起缺氧性精子生成减少(hypoxic
spermatogenesis reduction,HSR),但具体机制并不清楚。支持细胞之间血睾屏障(Blood‑
Testis‑Barrier,BTB)是精子生成的重要屏障,其中紧密连接(Tight junction,TJ)分子通
过及时的拆卸和重组,确保精母细胞通过BTB进入曲精小管腔,所以,如何维持血睾屏障TJ
完整是精子生成顺利进行的关键。在前期我们模拟海拔5000米低氧曝露小鼠60天,发现小
鼠睾丸曲精小管中支持细胞BTB通透性显著增加(hypoxic blood‑testis‑barrier
permeability,HBTBP),进一步发现血睾屏障TJ分子mRNA与蛋白表达显著下降,1%氧含量
培养小鼠支持细胞48小时,发现小鼠支持细胞电阻显著降低,TJ分子转移至胞浆,且蛋白表
达明显降低。因此,低氧通过抑制小鼠TJ分子进而诱导血睾屏障通透,但是低氧抑制紧密连
接分子的确切机制尚不清楚。
支持细胞紧密连接的机制尚不明确,查阅文献也未见报道。我们前期研究发现缺氧抑制睾
丸和支持细胞mTORC1(mechanistic Target Of Rapamycin complex 1)表达。mTORC1是细
胞对外环境应激(如饥饿)作出反应并控制合成与分解代谢平衡的关键分子。在营养充足条
件下,氨基酸激活Rheb‑GTP,然后活化mTORC1。同时,氨基酸激活的RagA/B招募mTORC1聚集
于溶酶体膜上。因此,以上两个途径共同激活mTORC1。激活后的mTORC1磷酸化TFEB
(Transcription factor EB,碱性螺旋‑环‑螺旋‑亮氨酸拉链转录家族成员),磷酸化的
TFEB不能结合CLEAR(Coordinated lysosomal expression and regulation,溶酶体合成
相关基因的转录启动区)元件。因此,溶酶体合成受限,最终导致内吞的胞外蛋白和胞膜上
的紧密连接蛋白一起不能被溶酶体降解。饥饿条件下,mTOR从溶酶体膜上易位至胞浆并处
于失活状态。去磷酸化的TFEB结合CLEAR元件并诱导溶酶体合成,充足的溶酶体降解内吞的
紧密连接蛋白并产生细胞所需的氨基酸。以上资料只是表明mTORC1从溶酶体膜上解离,酶
活性降低,而非mTORC1表达减少。
在;在正常氧含量下,脯氨酰羟化酶(Prolyl‑hydroxylases,PHD)使用分子氧作为底物使
HIF‑1α的脯氨酸残基羟基化,羟基化的HIF‑1α被范希佩尔林肿瘤抑制物(Von Hippel‑
Lindau tumor suppressor,VHL)识别和降解。大多数条件下,缺氧诱导HIF‑1α表达。但是在
一些特殊细胞类型和缺氧程度较重的细胞中,HIF‑1α表达是降低的;例如1%氧含量曝露食
管上皮细胞48小时后HIF‑1α显著减少;0.5%氧含量曝露星形胶质细胞24小时后HIF‑1α降
低;本发明研究发现1%氧含量暴露支持细胞48小时后HIF‑1α表达显著下降;提示HIF‑1α上
游可能存在调控分子。相对于mTOR/HIF‑1α途径参与肿瘤、炎症、神经退行性病变、肺动脉高
压和慢性肾衰竭疾病发生的广泛报道,有关其在血睾屏障中的功能报道还很少。一是缺氧
特别是高原低氧引起的血睾屏障通透报道很少,大家关注的也少;二是疾病模型特殊,相比
缺血性脑卒中、炎性肠病、食管炎等疾病中血脑屏障通透和血管上皮细胞紧密连接缺失,高
原低氧引起的血睾屏障通透很少报道。
已报道。连接黏附分子(junctional adhesion molecule,JAM)属于免疫球蛋白超家族成
员,JAM家族成员包括了JAM‑A和JAM‑B,其中JAM‑A与精子尾形成有关,JAM‑A缺失会引起精
子运动能力下降;JAM‑B是精母细胞通过BTB‑支持细胞顶端特化区域(Apical ectoplasmic
specialization,AES)进入曲精小管腔的关键紧密连接分子,JAM‑B缺失会出现大量精母细
胞凋亡,JAM‑B的及时拆卸/重组对于精母细胞顺利迁移至关重要。
成减少的发病原因不明,mTOR在其中作用的相关文献也未见报道。
制的延续。
发明内容
比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM‑B表达水平,初步了解mTOR对缺氧性血睾屏障通
透模型的影响。
程度及JAM‑B的表达水平,进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用。
胞分泌JAM‑B的能力,体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中,mTOR抑制支持细胞表达JAM‑B
的调节作用和分子机制。
用。
的治疗意义和可能的治疗效果。
失活予以实现;另一方面,通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF‑1α活化程度显著高于对照
组支持细胞,并且HIF‑1α结合JAM‑B转录启动子区缺氧反应元件的结果,实验佐证mTOR调节
性诱导JAM‑B表达是否依赖HIF‑1α激活予以完成。
雄性小鼠低氧处理(采用11.5%氧含量),每组共20只小鼠。分别于0、15、30、60天后分析小
鼠的血睾屏障及曲精小管病损指标,根据这些指标初步断定模型的建立是否成功。
管组织和性腺组织,ELISA检测两组小鼠不同时间点PI3K/Akt/mTOR途径指标(Akt、RagA、
RheB和mTORC1),观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、透射电镜下曲精小
管、性腺病理改变和血睾屏障结构改变,包括组织坏死程度,支持细胞和生殖细胞凋亡等。
睾屏障病损程度。
氧诱导野生型及mTOR基因敲除小鼠原代细胞JAM‑B的表达水平。
剪碎睾丸,用注射器抽取睾丸液,在含10%小牛血清的RPMI‑1640培养液中培养并用显微镜
观察细胞生存状态,6h贴壁细胞即为支持细胞并换液。
荧光抗体于细胞悬液中,4℃避光孵育30分钟后,PBS洗涤两遍,洗去多余抗体,最后用
100ulPBS重悬,标记好的细胞用FACSCantoII流式细胞仪检测,所得数据用FlowJo软件对细
胞表型进行分析。
P70S6K1/HIF‑1α信号通路的活化程度,筛选出缺氧性血睾屏障通透发病中mTOR下游信号通
路具体活化的信号途径,进而从体内明确mTOR下游效应分子TFEB和P70S6K1对HIF‑1α的调
节作用。
同时间点细胞TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号通路的活化水平。
剂)刺激组刺激细胞后,细胞产生JAM‑B的能力
作为研究对象,将其分为两组,一组通过尾静脉注射的方式注射重组mTOR蛋白,另一组用
IgG作为对照,而后对两组小鼠进行低氧诱导:
及透射电镜下睾丸曲精小管和血睾屏障病理改变,包括组织坏死程度,支持细胞和生殖细
胞凋亡等。
重组单抗mTOR是否存在治疗作用,进一步佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。
分关键作用。在此基础上,本发明检测发现缺氧诱导了巨胞饮‑溶酶体系统。所以研究将焦
点汇聚在mTORC1对巨胞饮调控研究上。综上,缺氧抑制的m TOR表达可能也通过TFEB介导的
溶酶体合成来激活巨胞饮‑溶酶体系统,继而降解溶酶体包裹的紧密连接蛋白。
是缺氧性精子生成减少过程中最敏感的生精细胞,那么JAM‑B内吞增加或者表达减少均会
导致精母细胞凋亡。因此拟假设,低氧抑制m TORC1表达后;一方面,m TORC1表达减少激活
巨胞饮‑溶酶体系统降解JAM‑B;另一方面,m TORC1表达减少后,HIF‑1α/JAM‑B途径受限,因
此,JAM‑B表达降低;两方面共同作用促进了支持细胞紧密连接缺失,加重缺氧性血睾屏障
通透疾病的程度。
活化JAM‑B的表达的分子机制,为治疗缺氧性血睾屏障通透提供必要的理论依据和新的治
疗策略。
型,将有助于进一步研究其在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用和调节机制。
具体调节机制。在本发明的预实验中已经佐证:在低氧诱导的缺氧性血睾屏障通透小鼠模
型中,mTOR基因敲除小鼠血睾屏障病损程度较对照组严重,提示mTOR在缺氧性血睾屏障通
透中的保护作用。了解明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用及机制有助于对此疾病深
入的了解,并为未来治疗此疾病提供更安全更有效的治疗途径和手段。
附图说明
Occludin、JAM‑BmRNA水平。
米曝露60天的mTORKO组小鼠睾丸伊文斯蓝渗出。
1%氧含量+48h组TM4细胞溶酶体;D.21%氧含量+48h组和1%氧含量+48h组TM4细胞溶酶体
占比。
B.WB检测21%氧含量+48h和1%氧含量+48h组支持细胞m TOR效应分子p‑m TOR、p‑4EBP1和
p‑P70S6K1;C.WB检测1%氧含量+48h和1%氧含量曝露48h+MHY1485(mTOR特异性激动剂)组
支持细胞p‑mTOR和HIF‑1α表达。
1α与JAM‑B转录启动子区结合。
具体实施方式
限定本发明。
较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM‑B表达水平,初步了解mTOR对缺氧性血睾屏障通透
模型的影响。
度及JAM‑B的表达水平,进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用。
分泌JAM‑B的能力,体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中,mTOR抑制支持细胞表达JAM‑B的
调节作用和分子机制。
用。
治疗意义和可能的治疗效果。
失的两个重要机制。对其研究时本发明发现HBTBP小鼠睾丸中,mTOR表达较对照组降低,且
mTOR敲除小鼠血睾屏障通透性较对照组增加,表明阻断mTOR致使更高程度紧密连接缺失及
JAM‑B(连接黏附分子2)减少。WB结果提示特异性激活支持细胞mTOR能够激活HIF‑1α,但还
未在HBTBP模型中得到验证。所以本研究拟推测:缺氧抑制mTOR表达后,一方面激活巨胞饮
并内吞降解掉JAM‑B;另一方面,通过HIF‑1α/JAM‑B途径抑制JAM‑B表达,以上两方面促使紧
密连接缺失,导致血睾屏障通透。
构建缺氧性血睾屏障通透模型,分析比较两种小鼠的曲精小管病损情况和JAM‑B表达水平,
初步了解mTOR对缺氧性血睾屏障通透模型的影响。(2)运用mTOR阻断剂作为研究手段,将
C57BL/6小鼠分为两组。一组行mTOR阻断剂处理;另一组以生理盐水作为对照;比较两处理
组小鼠在低氧诱导后,曲精小管的病损程度及JAM‑B的表达水平,进一步确定mTOR在缺氧性
血睾屏障通透中的重要作用。(3)分离mTOR基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠的曲精小管支持细
胞作为研究对象。体外低氧暴露下,运用western blot、免疫细胞化学、q PCR技术,比较刺
激后两组支持细胞分泌JAM‑B的能力。体外佐证缺氧性血睾屏障通透模型中,mTOR抑制支持
细胞表达JAM‑B的调节作用和分子机制。(4)体外低氧单独或联合mTOR单抗刺激小鼠曲精小
管原代培养细胞系和小鼠支持细胞株TM4;比较两刺激组间JAM‑B的表达水平,进一步深入
明确mTOR对JAM‑B的调节作用。(5)在明确缺氧性血睾屏障通透模型中mTOR对JAM‑B的活化
作用后,进一步探寻其可能活化机制。一方面,qPCR和WB明确小鼠睾丸和支持细胞TFEB表达
水平,进一步通过激活HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM‑B表达,从而佐证mTOR调
节性诱导JAM‑B是否依赖TFEB失活予以实现;另一方面,通过WB提示mTOR激活后支持细胞
HIF‑1α活化程度显著高于对照组支持细胞,并且HIF‑1α结合JAM‑B转录启动子区缺氧反应
元件的结果,实验佐证mTOR调节性诱导JAM‑B表达是否依赖HIF‑1α激活予以完成。(6)运用
野生型小鼠作为研究对象,mTOR重组蛋白作为研究手段,体内促进mTOR表达;分析比较mTOR
对缺氧性血睾屏障通透潜在的治疗意义和可能的治疗效果。
必要的理论依据和新的治疗策略。具体研究内容如下:
曲精小管病损情况,JAM‑B表达水平,初步了解mTOR在缺氧性血睾屏障通透模型中的作用;
JAM‑B的表达水平,进一步确定mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用;
JAM‑B的能力,体外佐证缺氧性精子生成减少模型中,mTOR诱导支持细胞表达JAM‑B的调节
作用和分子机制;
HBTBP小鼠睾丸和支持细胞TFEB来检测JAM‑B表达,从而佐证mTOR调节性诱导JAM‑B是否依
赖TFEB失活予以实现;另一方面,通过WB提示mTOR激活后支持细胞HIF‑1α活化程度显著高
于对照组支持细胞,并且HIF‑1α结合JAM‑B转录启动子区缺氧反应元件的结果,实验佐证
mTOR调节性诱导JAM‑B表达是依赖HIF‑1α活化予以完成;
睾屏障通透中的作用;
鼠曲精小管原代支持细胞系和小鼠支持细胞株,比较不同刺激组细胞上清JAM‑B的表达水
平;结合CHIP结果,体外运用westernblot、免疫细胞化学、qPCR等技术佐证缺氧性血睾屏障
通透模型中,mTOR对JAM‑B调节作用的潜在分子机制;
鼠(C57BL/6)购买自第三军医大学实验动物研究中心。20至25g(6至8周龄)
功。
管组织和性腺组织,ELISA检测两组小鼠不同时间点PI3K/Akt/mTOR途径指标(Akt、RagA、
RheB和mTORC1),观察两组小鼠曲精小管和性腺大体形态变化及HE染色、透射电镜下曲精小
管、性腺病理改变和血睾屏障结构改变,包括组织坏死程度,支持细胞和生殖细胞凋亡等。
睾屏障病损程度。
剪碎睾丸,用注射器抽取睾丸液,在含10%小牛血清的RPMI‑1640培养液中培养并用显微镜
观察细胞生存状态,6h贴壁细胞即为支持细胞并换液。
持细胞标志)荧光抗体于细胞悬液中,4℃避光孵育30分钟后,PBS洗涤两遍,洗去多余抗体,
最后用100ulPBS重悬,标记好的细胞用FACSCanto II流式细胞仪检测,所得数据用FlowJo
软件对细胞表型进行分析。
P70S6K1/HIF‑1α信号通路的活化程度,筛选出缺氧性血睾屏障通透发病中mTOR下游信号通
路具体活化的信号途径,进而从体内明确mTOR下游效应分子TFEB和P70S6K1对HIF‑1α的调
节作用。
同时间点细胞TFEB和P70S6K1/HIF‑1α信号通路的活化水平。
剂)刺激组刺激细胞后,细胞产生JAM‑B的能力
而后对两组小鼠进行低氧诱导:
及透射电镜下睾丸曲精小管和血睾屏障病理改变,包括组织坏死程度,支持细胞和生殖细
胞凋亡等。
重组单抗mTOR是否存在治疗作用,进一步佐证mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用。
体内激活或活化JAM‑B后能够明显维持小鼠缺氧性血睾屏障完整,降低附睾曲精小管病损
程度,提示JAM‑B在睾丸扭转和自身免疫性睾丸炎的重要地位,mTOR为丝氨酸/苏氨酸激酶,
它极有可能也参与缺氧性血睾屏障通透的发生。我们的预实验证实缺氧性血睾屏障通透小
鼠睾丸mTOR较正常对照组显著降低,mTOR基因敲除小鼠曲精小管组织损伤程度显著高于野
生型小鼠,提示mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的保护作用,因此运用重组的mTOR单抗有可
能延缓HBTBP的病理进程;同时,WB结果提示低氧曝露小鼠睾丸P70S6K1/HIF‑1α信号途径的
活化程度明显低于对照组小鼠,提示mTOR对HIF‑1α的调节作用,而在之前我们的研究中发
现在缺氧性血睾屏障通透中,HIF‑1α结合JAM‑B转录启动子区缺氧反应元件,所以我们有理
由相信缺氧性血睾屏障通透中抑制性活化mTOR可能通过阻抑P70S6K1/HIF‑1α信号通路的
活化减少JAM‑B表达,进而达到恶化生殖的作用,这一设想在理论层面上可行,理应获得预
期结果。
进程,那么在同为缺氧性血睾屏障通透病人中或许也存在此调控机制,此外我们前期的结
果也证实低氧诱导缺氧性血睾屏障通透小鼠睾丸mTOR显著低于对照组小鼠,mTOR基因敲除
小鼠血睾屏障通透性显
技术及方法,尤其在小鼠曲精小管支持细胞的分离培养等关键实验技术上较为熟练,与此
同时本项目立足现有的工作基础,立题依据充分,课题组人员组成既有从事生殖低下研究
的人员,又有长期从事分子生物学的实验室研究及技术人员,还有长期从事病理研究的技
术人员。既有博士、硕士,又有各种技术人员,人员搭配合理,能保证研究顺利完成。
型,将有助于我们进一步研究其在缺氧性血睾屏障通透中的重要作用和调节机制。
其具体调节机制。在我们的预实验中已经佐证:在低氧诱导的缺氧性血睾屏障通透小鼠模
型中,mTOR基因敲除小鼠血睾屏障病损程度较对照组严重,提示mTOR在缺氧性血睾屏障通
透中的保护作用。了解明确mTOR在缺氧性血睾屏障通透中的作用及机制有助于我们对此疾
病深入的了解,并为未来治疗此疾病提供更安全更有效的治疗途径和手段。
氧病理生理学有较深入的了解,承担并圆满完成了国家、军队、重庆市多项缺氧方面的课
题。获得“高原病发病机制和防治措施研究”国家科学技术进步一等奖在内的各种奖项。
hypoxia causes deleterious effects on spermatogenesis in rats”,并提出高原低氧
对生精细胞的影响主要集中在精母细胞上,为理解高原男性生殖功能低下的发病机制奠定
了基础。自噬在缺氧诱导精母细胞凋亡中的作用机制一直是申请者所重点关注的研究领
域,部分文献综述已以第一作者身份被本领域知名期刊Biology of reproduction(IF=
3.47)发表,申请者围绕低氧诱导精母细胞凋亡的机制和凋亡与自噬的串扰先后发表两篇
论著,先后发表于Journal of cellular physiology(IF=4.1)和Reproduction(IF=
3.06),本项目是本课题组前期研究工作的继续深入。
障通透程度呈时间依赖性;与对照组比较,海拔5000米低氧曝露30天组小鼠血睾屏障紧密
连接结构松散,细胞间隙增大;与对照组比较,海拔5000米低氧曝露60天组小鼠支持细胞紧
密连接相关分子Claudin‑5、Occludin、JAM‑B的mRNA水平和蛋白表达均显著降低(p<0.05)
(Yinetal.未发表)。低氧诱导血睾屏障通透如图3所示,低氧抑制紧密连接相关分子m RNA
和蛋白表达如图4所示。
JAM‑B荧光强度下降,且分布位置转移至胞浆;与21%氧含量+48h组支持细胞比较,1%氧含
量+48h组小鼠TM4细胞紧密连接相关分子Claudin‑5、Occludin、JAM‑B的m RNA水平和蛋白
表达均显著降低(p<0.05)(Yinetal.未发表)。TM4细胞曝露于21%氧含量和1%氧含量48h
后的跨细胞电阻变化如图5所示,免疫荧光染色并分别观察21%氧含量+48h组与1%氧含量
+48h组TM4细胞紧密连接分子Claudin‑5、Occludin、JAM‑B分布及荧光强度如图6所示,低氧
抑制TM4细胞紧密连接相关分子Claudin‑5、Occludin、JAM‑B蛋白表达如图7所示。
Rhe B表达显著下降(p<0.05),AMPK和TSC2表达显著上调(p<0.05);与平原对照组小鼠比
较,m TOR KO组小鼠睾丸血睾屏障中伊文斯蓝标记物明显增多(p<0.05)(Yin et al.未发
表)。
子α‑adaptin和Caveolar介导的内吞标记分子caveolin‑1表达无变化;与21%氧含量+48h
组支持细胞相比,1%氧含量+48h组小鼠TM4细胞溶酶体显著上升(p<0.05)(Yinetal.未发
表)。低氧诱导支持细胞巨胞饮介导的胞吞如图9所示。
持细胞比较,1%氧含量曝露48h+MHY1485(m TOR特异性激动剂)组TM4细胞p‑mTOR和HIF‑1α
表达均显著上升(p<0.05)(Yin et al.未发表)。低氧抑制TM4细胞m TOR/HIF‑1α途径如图
10所示。
养箱、低氧细胞培养箱、超低温高速离心机、‑80oC冰箱、荧光显微镜、凝胶成像系统、冰冻切
片机、低温高速离心机、超声细胞破碎仪、实时定量PCR扩增仪、紫外透射观察仪及照相装
置、杂交炉、电泳仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪、万分之一电子天平及高精度pH计等
实验室常规设备,拥有先进的全天候不间断低氧缺氧舱群。