一种从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法及对羟基肉桂酸甲酯作为除草剂的应用转让专利
申请号 : CN201911287277.6
文献号 : CN111072483B
文献日 : 2021-06-25
发明人 : 罗小勇 , 孙小雪
申请人 : 青岛农业大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法,其特征在于,包括以下步骤:A.提取:称取玉米秸秆粉末,置于密封罐中,加入60%乙醇直至浸过粉末,置于25℃的恒温箱内浸提7天后收集提取液,期间每7‑9小时搅拌一次,按照此方法先后提取2‑4次,并合并所有提取液,对提取液进行真空抽滤后,进行旋转蒸发,得到第一浸膏;
B.萃取:用去离子水对第一浸膏进行分散,并将分散液用5倍体积的石油醚萃取6次,去除石油醚萃取液,对残余物用5倍体积的乙酸乙酯萃取6次,合并乙酸乙酯萃取液,进行真空抽滤后,再通过旋转蒸发蒸干溶剂,得第二浸膏;
C.色谱柱分离:
对第二浸膏进行初级柱色谱分离:将第二浸膏用丙酮溶解后,加入硅胶,搅拌均匀,待丙酮挥发后添加至硅胶色谱柱;先后依次以体积比为1:0、50:1、25:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚/丙酮混合溶液及体积比为50:1、25:1、10:1、5:1、1:1和0:1的丙酮/甲醇混合溶液作为流动相进行梯度洗脱,以薄层色谱追踪收集各洗脱组分,将Rf值相同的组分进行合并后,再分别进行旋转蒸发去除溶剂,按照洗脱顺序得到E1 E16共16个馏分,收集高活~
性的馏分E3和E13;
对馏分E13进行二级柱色谱分离:先后依次以体积比为10:1、5:1、3:1、2:1和0:1的石油醚/丙酮混合溶液和10:1、5:1、3:1、1:1和0:1的丙酮/甲醇混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱,合并Rf值相同的组分后,再分别进行旋转蒸发去除溶剂,从E13馏分中按照洗脱顺序分离得到E13‑1、E13‑2、E13‑3、E13‑4和E13‑5共5个馏分,收集高活性的E13‑2馏分;
对馏分E13‑2进行三级柱色谱分离:先后依次以体积比为3:1、2:1和0:1的石油醚/丙酮溶液以及体积比为3:1、1:1和0:1的丙酮/甲醇溶液混合液作为流动相进行梯度洗脱,通过三级柱色谱分离,合并Rf值相同的组分后,再分别进行旋转蒸发去除溶剂,按照洗脱顺序从E13‑2馏分中分离得到E13‑2‑1、E13‑2‑2和E13‑2‑3三个馏分,收集高活性的E13‑2‑1馏分;
纯化:通过HPLC制备色谱对E13‑2‑1馏分进行进一步纯化,得到2种化合物: qn‑3‑1,即顺式对羟基肉桂酸甲酯;qn‑4,即反式对羟基肉桂酸甲酯。
2.根据权利要求1所述的从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法,其特征在于,步骤C 中还包括:
对馏分E3进行二级柱色谱分离:先后依次以体积比为25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、3:1、
1:1和0:1的石油醚/丙酮混合溶液作为流动相进行梯度洗脱,对馏分E3进行二级柱色谱分离,将分离的Rf值相同的组分进行合并后,通过旋转蒸发去除溶剂,按照洗脱顺序分别得到
4个馏分E3‑1、E3‑2、E3‑3和E3‑4,收集馏分E3‑2;
对馏分E3‑2进行三级柱色谱分离:先后依次以体积比为10:1、5:1、3:1、1:1和0:1v/v的石油醚/丙酮溶液作为流动相进行梯度洗脱,通过三级柱色谱分离,从E3‑2馏分中分离得到E3‑2‑1、E3‑2‑2、E3‑2‑3和E3‑2‑4四个馏分;
通过HPLC制备色谱对E3‑2‑3进一步分离,从E3‑2‑3馏分中分离纯化出馏分qn‑3‑1、qn‑
4,分别为顺式对羟基肉桂酸甲酯和反式对羟基肉桂酸甲酯;
最后,分别合并步骤C得到的顺式对羟基肉桂酸甲酯和反式对羟基肉桂酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法,其特征在于,步骤C中采用200‑300目的硅胶,三次柱色谱分离采用的色谱柱规格为12 cm ×80 cm。
4.根据权利要求1所述的从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法,其特征在于,步骤C中,HPLC制备色谱进行分离纯化时,使用的是规格为250mm×10mm的YMC‑ODS半制备柱。
5.根据权利要求1所述的从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法,通过制备色谱从E13‑2‑1馏分中分离qn‑3‑1,qn‑4的方法具体为:流动相采用体积百分比为35%的甲醇水进行洗脱,流速为4 mL/min, qn‑3‑1的保留时间tR为31.0 min,qn‑4的保留时间tR为36.5 min。
6.根据权利要求2所述的从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法,通过制备色谱从E3‑2‑3馏分中分离qn‑3‑1,qn‑4的方法具体为:流动相采用体积百分比为47%的甲醇‑水进行洗脱,流速为4 mL/min,qn‑3‑1的保留时间tR为17.7 min,qn‑4 的保留时间tR为19.5 min。
7.如权利要求1所述的对羟基肉桂酸甲酯作为除草剂在生菜、小麦、反枝苋和稗草中的应用。
说明书 :
一种从玉米秸秆中提取对羟基肉桂酸甲酯的方法及对羟基肉
桂酸甲酯作为除草剂的应用
技术领域
背景技术
物各具特色的杂草群落,即使是相同作物因所处的地理位置及环境条件的差异使得杂草群
落的组成有着很大的不同。但杂草对作物的危害基本相同,可导致农产品的产量和品质严
重下降,甚至造成颗粒无收,并大大增加劳动成本。因此,如何更为有效地防除农田杂草已
成为现代化农业生产发展的一个重要的课题。
草防除效果显著,是农田杂草防除中最佳的方法,在农业经济发展中发挥着很大的作用,促
进了农业经济的高效、快速、健康发展,深受农民朋友的信赖。但化学除草剂的不合理使用
也带来了农药残留、环境污染、有害生物抗药性等一系列重大问题。另外,由于栽培耕作制
度变化、过度依赖除草剂、除草剂混用不当以及大量种植转基因作物等因素,导致杂草群落
发生改变,严重地阻碍了化学除草剂的发展。
开发为除草剂的潜力。而目前对羟基肉桂酸甲酯是一种重要的有机合成、医药以及抗肾上
腺素药艾司洛尔的中间体,现仅供工业使用,而日本电子和光纤方面的专家将顺式对羟基
肉桂酸甲酯应用延伸到了电子和光纤通信领域,成为一种优良的触摸屏和高端光纤材料。
此前并未发现其除草活性。
发明内容
次,并合并所有提取液,对提取液进行真空抽滤后,进行旋转蒸发,得到第一浸膏;
行真空抽滤后,再通过旋转蒸发蒸干溶剂,得第二浸膏;
和0:1的石油醚/丙酮混合溶液及体积比为50:1、25:1、10:1、5:1、1:1和0:1的丙酮/甲醇混
合溶液为流动相进行梯度洗脱,以薄层色谱追踪收集各洗脱组分,将Rf值相同的组分进行
合并后,再分别进行旋转蒸发去除溶剂,按照洗脱顺序得到E1~E16共16个馏分,收集高活
性的馏分E3和E13。
洗脱,合并Rf值相同的组分后,再分别进行旋转蒸发去除溶剂,从E13馏分中按照洗脱顺序
分离得到E13‑1、E13‑2、E13‑3、E13‑4和E13‑5共5个馏分,收集高活性的E13‑2馏分。
谱分离,从E13‑2馏分中分离得到E13‑2‑1、E13‑2‑2和E13‑2‑3三个馏分,收集高活性的E13‑
2‑1馏分。
谱分离,将分离的Rf值相同的组分进行合并后,通过旋转蒸发去除溶剂,按照洗脱顺序分别
得到4个馏分E3‑1、E3‑2、E3‑3和E3‑4,收集馏分E3‑2;
同的组分进行合并后,通过旋转蒸发去除溶剂,按照洗脱顺序从E3‑2馏分中分离得到E3‑2‑
1、E3‑2‑2、E3‑2‑3和E3‑2‑4四个馏分;
并各馏分。其中,qn‑3‑1(tR=17.7min)和qn‑4(tR=19.5min)在E3‑2‑3馏分的制备分离中
分别于第二个和第三个被分离出来,而在E13‑2‑1馏分中只有这两个化合物,先后于
31.0min和36.5min被分离出来,化合物的纯度很高。但由于所选用的流动相不同(前者为
47%甲醇‑水(v/v),后者为35%甲醇水(v/v)),在相同的流速(4mL/min)下,两个化合物被
分离出来的时间也不相同。
一步通过结构改造或修饰以形成除草活性更高的化合物后,再对其进行除草剂的应用。
作物田。应用上述环境时,对具体施用方法没有具体要求,可采用常规的茎叶喷洒法。
出苗前,将除草剂施于土壤,消除杂草幼苗。
酯和反式对羟基肉桂酸甲酯中的至少一种。
为植物中的天然产物,具有在环境中易降解、对环境友好的特点,非常符合农药发展的方
向。
值。
附图说明
基肉桂酸甲酯,VI为二甲戊灵。
具体实施方式
本发明中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施
例,都属于本发明保护的范围。除非另有定义,本说明书所使用的所有的技术和科学术语与
属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中
所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是用于限制本发明。此外,下面所描
述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
最后用分级超细连续式粉碎机粉碎,存放于6℃低温冷藏种子柜中以备用。
种为烟农24号,由烟台农科院提供;生菜品种为益农尼加拉黑核西生菜,采购于青岛城阳批
发市场种子站;反枝苋和稗草都采自青岛农业大学附近未使用过除草剂的荒地。将所有的
供试植物种子均存放于6℃的种子柜中保存、备用。
房用纸,用蒸馏水润湿,将吸水后的供试植物种子用蒸馏水冲洗数次后均匀摆放在厨房用
纸上,上盖后置于25℃的恒温气候培养箱内催芽,待植物幼苗的胚根(种子根)长到3‑5mm时
备用。
为空白对照处理。各处理中DMSO的含量保持一致。
在植物生长箱内培养3‑4天。生长箱的设置条件是光照14h(25℃)和黑暗10h(20℃)的不断
循环,箱内相对湿度为60%。
的抑制率及标准误差,用SPSS软件分析各处理的有效中浓度(EC50)。
350mL进行提取,用锡箔纸封闭锥形瓶口后,置于25℃的恒温震荡箱内浸提3天,过滤、收集
提取液。按同样方法提取3次后,合并3次的滤液,真空抽滤。将60%甲醇、60%乙醇的提取液
在40℃下用旋转蒸发仪旋转蒸干,得浸膏,而水提取液用冷冻干燥机清除水分,随后用于活
性测定。所用的受体植物为小麦和生菜,分别代表禾本科和阔叶植物。
的抑制作用,在0.5g·L 的最低处理浓度下,抑制率分别达83.9%、70.4%和70.3%,且均
‑1
随处理浓度的增加而显著提高,在4g·L 的最高处理浓度下,抑制率都达90%以上。但对生
菜幼苗胚轴生长的抑制作用相对较低,且不同提取物间差异较大。其中,以60%甲醇和60%
‑1 ‑1
乙醇提取物的活性相对较高,在0.5g·L ~1g·L 处理浓度下的抑制率分别达83.9%~
‑1 ‑1
89.5%和70.4%~85.6%,在4g·L 时提高至93.7%和94.7%。而水提取物在0.5g·L ~
‑1
1g·L 处理浓度下的抑制率均低于10%,只在高浓度处理下才有40%左右的抑制活性。
且对种子根的抑制活性高于对胚芽鞘的抑制。在0.5g·L ~4.0g·L 的处理浓度下,60%
甲醇、60%乙醇和水提取物对小麦幼苗种子根(胚芽鞘)的抑制率分别为79.9%~92.0%
(33.2~92.0%)、71.7%~90.7%(2.3~65.7%)和58.1~86.7%(23.9~51.2%)。
活性物质提取出来,因此,选择60%乙醇为提取溶剂。
号滤纸,Whatman)后于40℃下用旋转蒸发仪蒸干,得到提取物浸膏。
入新的石油醚进行二次萃取,如此循环直到用TLC色谱板检测在紫外灯下显示没有化合物
时为止,合并全部石油醚萃取液。而后再依次用乙酸乙酯和正丁醇按同样方法对残余物进
行萃取。将合并后的不同溶剂萃取液真空抽滤(Whatman,No2.)后,再用旋转蒸发仪(40℃)
旋转蒸干溶剂,得浸膏并称重。其中水相萃取液在冷冻干燥机内干燥后称重。测定各萃取物
的除草(化感)活性。
萃取物在0.25g·L ~0.5g·L 的低浓度下对其胚芽鞘的生长表现为一定的刺激生长活
性外,四种溶剂萃取物对其种子根或胚芽鞘的生长均表现出不同程度的抑制活性。其中,以
乙酸乙酯相萃取物的抑制效果最高,在该供试浓度范围内,对种子根和胚芽鞘的生长抑制
率分别达52.1%~94.6%和22.2%~84.4%;石油醚相萃取物次之,对二者的抑制率分别
为28.9%~73.6%和11.1%~48.7%。而正丁醇相和水相萃取物的抑制活性相对较低。
‑1 ‑1
L ~2g·L 的浓度下,对胚根(胚轴)生长的抑制率分别达81.8%~100%(35.2%~
93.7%)和38.6%~97.2%(23.1%~79.0%)。而正丁醇相和水相萃取物的活性相对较低,
在供试浓度范围内,对胚根的生长表现出一定的抑制活性,但对胚轴的生长仅在高浓度处
理时有一定的抑制活性,而在低浓度处理下均表现为轻微的刺激生长活性。
性物质进行了进一步分离。
法装柱,装柱后用石油醚跑空柱一天。称取40g的乙酸乙酯相浸膏于500ml烧杯中,用适量丙
酮溶解,加入65g硅胶(200‑300目)不断搅拌混匀,待溶剂挥发后上柱。以石油醚/丙酮混合
溶液(1:0、50:1、25:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1v/v)及丙酮/甲醇混合溶液(50:1、25:1、
10:1、5:1、1:1和0:1v/v)为流动相进行梯度洗脱。以TLC追踪收集各组分,合并Rf值相同组
分,分别旋转蒸发后,得到E1~En共n个馏分,称量并计算各组分得率。
行一级柱色谱分离纯化,得到E1~E16共16个组分,各组分得率如图5所示。可见,以E13馏分
的得率最高,达17.8%,E3馏分次之,为12.8%,其他馏分的得率则相对较低。
轴的生长表现为轻微的刺激作用外,其余均表现为不同程度的抑制活性。其中以E3馏分的
活性最高,对生菜胚根(胚轴)和小麦种子根(胚芽鞘)的抑制率分别高达100%(80.7%)和
80.5%(69.2%)。E13馏分的次之,分别为90.3%(46.2%)和87.7%(75.7%),而E1馏分的
最低,仅为‑9.7%(‑7.3%)和8.4%(3.1%)。其它馏分的活性则介于它们之间。综合考虑各
组分的得率及生物活性,选择E3和E13两个馏分进行进一步的分离纯化。
‑1
它们的得率分别为17.1%、31.5%、25.6%和25.8%。4个馏分在0.3g·L 浓度下对小麦和
生菜幼苗生长的影响见表2。可见,E3‑2馏分对两种受体植物幼苗生长的抑制活性最高,对
小麦种子根(胚根)和生菜胚根(胚轴)的抑制率分别达95.0%(74.5%)和100%(100%),
E3‑3馏分次之,分别为77.5%(45.8%)和77.1%(57.7%),第三为E3‑4馏分,分别为36.8%
(14.9%)和51.9%(31.1%),而E3‑1馏分最低,分别只有19.8%(8.2%)和23.4%
(11.3%)。综合考虑各组分的得率及生物活性,选择E3‑2馏分进行进一步的分离。
E13‑3、E13‑4和E13‑5共5个馏分,各馏分的得率分别为25.7%、16.5%、14.0%、13.2%和
‑1
30.6%。它们在0.3g·L 浓度下对生菜和小麦幼苗生长的影响见表3。可见,E13‑1和E13‑2
两个馏分均显著抑制了两种受体植物幼苗的生长,对它们胚根(胚轴)和种子根(胚芽鞘)的
抑制率分别达98.8%~100%(81.6%~84.8)和87.0%~95.6%(78.7%~87.2%)。E13‑3
和E13‑4两个馏分尽管也对它们的胚根(种子根)的生长表现出68.2%~85.1%(62.0%~
76.7%)的抑制活性,但对它们的胚轴(胚芽鞘)的抑制效果则相对较低,只有16.2%~
28.5%(31.7%~49.6%)。而E13‑5馏分的活性则较差,只对小麦种子根表现出52.2%的较
高抑制活性。综合考虑各组分的得率及生物活性,选择E13‑1和E13‑2两个馏分进行进一步
的分离。其中,E13‑1馏分直接用于制备色谱分离。
得率分别为21.5%、23.6%、17.8%和37.1%。四个馏分对生菜和小麦幼苗生长的影响见表
‑1
4。可见,在0.05g·L 浓度下,只有E3‑2‑3馏分显示出较高的抑制活性,对二者胚根(胚轴)
和种子根(胚芽鞘)生长的抑制率分别达75.3%(46.6%)和73.8%(32.8%),而其它三个馏
分除E3‑2‑1馏分对生菜胚根显示出70.8%的抑制活性外,其余的活性均较低。因此,选择
E3‑2‑3馏分进行进一步制备色谱分离。
2‑3三个馏分,它们的得率分别为31.9%、42.7%和25.4%。四个馏分对生菜和小麦幼苗生
‑1
长的影响见表5。可见,在0.05g·L 浓度下,只有E13‑2‑1馏分表现出较高的抑制活性,对二
者胚根(胚轴)和种子根(胚芽鞘)生长的抑制率分别达71.8%(32.8%)和83.5%(72.7%),
而其它三个馏分除E13‑2‑3馏分对生菜胚根显示出69.3%的较高抑制活性外,其余的活性
均较低。因此,选择E13‑2‑1进行进一步的制备色谱分离。
qn‑6(113.8mg);从E13‑2‑1馏分(57.9mg)中分离纯化出2个化合物:qn‑3‑1(2.0mg),qn‑4
(5.8mgin)。由上可知,qn‑3‑1和qn‑4分别都存在于E3‑2‑3馏分和E13‑2‑1馏分中;最后分别
合并两种馏分中qn‑3‑1和qn‑4。
(v/v),流速4mL/min,洗脱得到五种化合物的顺序依次为qn‑1(tR=7.2min)、qn‑3‑1(tR=
17.7min)、qn‑4(tR=19.5min)、qn‑5‑1(tR=30.7min)和qn‑6(tR=36.3min),目标化合物
qn‑3‑1和qn‑4分别于第二、第三个被分离出来。
36.5min)。
羟基肉桂酸甲酯(qn‑3‑1,又称对羟基别肉桂酸甲酯)、反式对羟基肉桂酸甲酯(qn‑4,又称
对羟基肉桂酸甲酯)、顺式对羟基肉桂酸乙酯(qn‑5‑1,又称对羟基别肉桂酸乙酯)、对羟基
肉桂酸甲酯(qn‑6,又称对羟基肉桂酸乙酯)。它们的C、H信号归属如下:
165.5(C‑4),133.4(C‑1),130.1(C‑2,6),117.0(C‑1)。
12.8Hz,H‑8),3.70(3H,s,‑CH3);13C‑NMR(125MHz,CD3OD)δ:168.8(C=O),160.0(C‑4),
145.0(C‑7),133.6(C‑2,6),127.5(C‑1),116.3(C‑8),115.8(C‑3,5),51.7(‑CH3)。
H‑8),3.65(3H,s,OCH3);13C‑NMR(125MHz,CD3OD)δ:169.7(C=O),161.3(C‑4),146.5(C‑
7),131.1(C‑2,6),127.0(C‑1),116.8(C‑3,5),114.8(C‑8),52.0(‑CH3)。
12.8Hz,H‑8),4.16(2H,q,J=7.2Hz,H‑10)1.25(3H,t,J=7.2Hz,H‑11);13C‑NMR(125MHz,
CD3OD)δ:168.4(C=O),160.0(C‑4),144.7(C‑7),133.5(C‑2,6),127.7(C‑1),116.9(C‑8),
115.8(C‑3,5),61.2(C‑10),14.5(C‑11)。
H‑8),3.95(2H,q,J=7.2Hz,H‑10)1.05(3H,t,J=7.2Hz,H‑11);13C‑NMR(125MHz,CD3OD)δ:
169.2(C=O),161.0(C‑4),146.2(C‑7),131.0(C‑2,6),127.0(C‑1),116.7(C‑3,5),115.2
(C‑8),61.4(C‑10),14.6(C‑11)。
对羟基肉桂酸乙酯(qn‑6):
幼苗的生长,且抑制率均随处理浓度的增加而提高。其中,在0.025g·L ~0.8g·L 浓度
‑1 ‑1
下对生菜、0.0125g·L ~0.2g·L 浓度下对反枝苋胚根(胚轴)生长的抑制率分别达
‑1
58.5%~100%(33.0%~100%)和74.4%~100%(50.4%~100%),在0.025~0.8g·L
浓度下对小麦和稗种子根(胚芽鞘)生长的抑制率分别达19.8%~100%(11.4%~78.3%)
和86.7%~100%(45.4%~80.9%),说明该提取物对反枝苋、稗两种杂草以及小麦和生菜
两种作物均有较强的抑制活性,其选择性较差。
羟基肉桂酸的作用效果相似,其中表现为对受试植物的种子根/胚根的抑制活性明显高于
‑1
胚芽鞘/胚轴,在0.025g·L 的处理浓度下,对生菜和反枝苋的胚根以及小麦和稗草的种子
根的抑制率分别为60.5%、82%、17.25%和56.2%,而对生菜和反枝苋的胚轴以及小麦和
稗草的胚芽鞘的抑制率分别为35.9%、55.3%、4.92%和24.9%。总体看,对双子叶植物的
‑1
抑制作用要优于单子叶植物,如在0.2g·L 的供试浓度下,对生菜和反枝苋的胚根/胚轴的
抑制率均达到100%,植物幼苗全部死亡,但对小麦和稗草的种子根/胚芽鞘的抑制率要相
对低一些,分别达92.7%/75.8%和98.0%/73.6%。
了对比试验,其结果见图6和表8。可见在0.05g·L 浓度下,两种对羟基肉桂酸甲酯对受体
‑1
植物反枝苋和0.1g·L 浓度下对稗草幼苗的生长均具有显著的抑制作用。反式对羟基肉桂
酸甲酯和顺式对羟基肉桂酸甲酯对反枝苋胚根生长的抑制活性(96.3%~97.0%)高于对
照药剂二甲戊乐灵(92.0%);两者对反枝苋胚轴的抑制活性(67‑74.3%))也高于对照药剂
二甲戊乐灵(65.8%);对稗种子根的抑制与对照间无显著差异(98.9%~100%);这些结果
说明,上述两种分离化合物高于对照药剂二甲戊灵。
护范围。