一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法

摘要

本发明涉及一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）构建ctnR基因敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；（2）构建ctnR基因敲除菌株GN‑01△ctnR；（3）敲除菌株GN‑01△ctnR的验证；（4）构建mokC基因过表达质粒；（5）在基因敲除菌株GN‑01△ctnR中导入mokC基因过表达质粒，获得mokC过表达菌株；（6）mokC过表达菌株的验证。本发明通过代谢产物验证，构建的GN‑01△ctnR基因缺失菌株已不产桔霉素，GN‑01△ctnR‑mokC过表达菌株产Monacolin K的能力较野生菌株提高了30%，达到267 mg/L。

权利要求

1.一株高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株，其特征在于，于2020年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19361。

2.一种如权利要求1所述高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法，其特征在于，通过将GN‑01菌株中的ctnR基因敲除，同时过表达mokC基因获得；

所述的构建方法包括以下步骤：

（1）从红曲米中分离获得一株红色红曲霉菌株GN‑01；

（2）构建ctnR基因敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；

（3）构建ctnR基因敲除菌株GN‑01△ctnR；

（4）敲除菌株GN‑01△ctnR的验证；

（5）构建mokC基因过表达质粒；

（6）在基因敲除菌株GN‑01△ctnR中导入mokC基因过表达质粒，获得mokC过表达菌株；

（7）mokC过表达菌株的验证；

步骤（2）所述ctnR基因敲除质粒的构建方法为：

1）利用ctnR‑up‑F/R和ctnR‑dn‑F/R两对引物分别扩增出ctnR基因上下游同源臂；

2）通过酶切连接将ctnR基因上下游同源臂分别构建到pGKO2‑Neo空质粒上，构建得到基因敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；

步骤（3）所述基因敲除菌株GN‑01△ctnR的构建方法为：

1）将敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn电击导入农杆菌AGL‑1中，在卡那霉素筛选平板上获得含敲除质粒的农杆菌转化子AGL‑1‑pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；

7

2）将农杆菌转化子在含有乙酰丁香酮的诱导培养基IM中培养至OD600为0.5，与浓度10o个/mL的红色红曲菌GN‑01孢子等体积混匀，涂布于含乙酰丁香酮的共生培养基上，25  C下避光培养2‑3 d；

3）洗下共生板上菌丝，涂布于含300 μg/mL头孢噻肟和50 μg/mL新霉素的PDA平板上，o

30  C下培养4‑5 d获得敲除转化子；

4）将转化子挑到含300 μg/mL头孢噻肟和50 μg/mL新霉素的PDA平板上进行复筛，获得敲除菌株GN‑01△ctnR；

步骤（5）所述构建mokC基因过表达质粒的方法为：

1）设计mokC基因上下游引物mokC‑F/R；

2）从红色红曲菌GN‑01基因组中扩增得到mokC基因；

3）将扩增得到的mokC基因通过酶切连接，构建到PBC‑hygro原核表达载体上，获得PBC‑Hygro‑mokC过表达质粒；

步骤（6）所述mokC过表达菌株的构建方法为：

1）将GN‑01△ctnR菌株在PDA固体培养基上活化2代后，洗下孢子接种于种子培养基中，

30℃和120 r/min振荡培养2 d；

2）制备GN‑01△ctnR红曲菌原生质体，并通过PEG介导的方法将过表达质粒PBC‑Hygro‑mokC导入到红曲菌原生质体中，得到mokC过表达菌株；

步骤（4）和（7）的菌株验证包括采用引物进行PCR验证及缺失菌株发酵验证。

3.一种如权利要求1所述的菌株在提高洛伐他汀产量中的应用。

说明书

一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法。

背景技术

[0002] 红曲霉属真菌门（Eumycophyta）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、不整子囊菌纲（PIectomycetes）、红曲科（Monascaceae），本科仅有一属，即红曲霉属（Monascus）。中国红曲米的生产地主要分布在我国福建、浙江、江苏和台湾等地，由红曲霉在大米等粮食中进行发酵而获得。红曲霉能合成一种天然色素‑红曲色素，同时还能合成多种丰富的次级代谢产物，如莫纳可林K（MonacolinK），又叫洛伐他汀，是红曲霉次级代谢产物中有益人体健康的主要功能成分，具有降血脂、降血压和抑制癌细胞增殖等多种功效；然而红曲霉在次级代谢中还可同时分泌高水平的高毒性真菌毒素——桔霉素（Citrinin），该毒素具有很强的肾脏毒性，还能致畸、诱发肿瘤和致突变等，限制了红曲产品的使用，国标对红曲产品中桔霉素含量具有十分严格的限定要求。 因此，获得不产桔霉素和高洛伐他汀产量的红曲霉菌株具有重要的实际应用价值。

[0003] 红曲霉细胞中桔霉素和洛伐他汀的生物合成均以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为起始结构单元，经不同聚酮合成反应代谢路径实现两者的全合成。分子生物学研究发现红曲霉ctnR基因是桔霉素合成基因——聚酮合酶基因（pksCT）的必需转录激活因子，通过同源重组的方法将ctnR基因敲除，可以抑制pksCT基因的转录，从而抑制桔霉素及相关聚酮类化合物的生物合成，实现红曲霉桔霉素的含量的消除。同时，红曲霉菌中的洛伐他汀合成关键基因mokC表达的P450单氧酶能够将4a,5‑dihydromonacoline L转化为Monacolin J，是洛伐他汀合成的重要前体物质，通过基因工程方法实现mokC基因在红曲菌株中过表达，可有效提高红曲霉菌洛伐他汀产量。作为聚酮类化合物，桔霉素和洛伐汀他合成的结构前体物质相同，容易导致碳代谢流存在竞争关系，然而目前已报道的论文或公开专利都只是通过单一的基因遗传操作来降低红曲霉菌桔霉素水平或提高其洛伐他汀产量，并未同时在一株红曲霉菌中实现ctnR基因的敲除和mokC基因的过表达，以考察桔霉素和洛伐他汀两者代谢水平的关联变化。本发明通过运用双遗传操作系统，以红色红曲霉菌GN‑01为出发菌株，实现红曲霉ctnR基因的敲除及 mokC基因的同步过表达，为高产洛伐他汀的功能红曲产品的生产提供安全高效的红曲菌株。

发明内容

[0004] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高红色红曲霉洛伐他汀产量且同时不产或低产桔霉素菌株的构建方法。本发明采用的技术方案是：

[0005] 一株高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株，其分类命名为：红色红曲霉（Monascus ruber），于2020年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No. 19361，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为中国，北京，朝阳区北辰西路1号院3号。

[0006] 高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法为：通过将GN‑01菌株中的ctnR基因敲除，同时过表达mokC基因获得。

[0007] 包括以下步骤：

[0008] （1）从红曲米中分离获得一株红色红曲霉菌株GN‑01；

[0009] （2）构建ctnR基因敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；

[0010] （3）构建ctnR基因敲除菌株GN‑01△ctnR；

[0011] （4）敲除菌株GN‑01△ctnR的验证；

[0012] （5）构建mokC基因过表达质粒；

[0013] （6）在基因敲除菌株GN‑01△ctnR中导入mokC基因过表达质粒，获得mokC过表达菌株；

[0014] （7）mokC过表达菌株的验证。

[0015] 步骤（2）所述ctnR基因敲除质粒的构建方法为：

[0016] （1）利用ctnR‑up‑F/R和ctnR‑dn‑F/R两对引物分别扩增出ctnR基因上下游同源臂；

[0017] （2）通过酶切连接将ctnR基因上下游同源臂分别构建到pGKO2‑Neo空质粒上，构建得到基因敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn。

[0018] 步骤（3）所述基因敲除菌株GN‑01△ctnR的构建方法为：

[0019] （1）将敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn电击导入农杆菌AGL‑1中，在卡那霉素筛选平板上获得含敲除质粒的农杆菌转化子AGL‑1‑ pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；

[0020] （2）将农杆菌转化子在含有乙酰丁香酮的诱导培养基IM中培养至OD600为0.5，与7
浓度10个/mL的红色红曲菌GN‑01孢子等体积混匀，涂布于含乙酰丁香酮的共生培养基上，
25℃下避光培养2‑3 d；

[0021] （3）洗下共生板上菌丝，涂布于含300 μg/mL头孢噻肟和50 μg/mL新霉素的PDA平板上，30℃下培养4‑5 d获得敲除转化子；

[0022] （4）将转化子挑到含300 μg/mL头孢噻肟和50 μg/mL新霉素的PDA平板上进行复筛，获得敲除菌株GN‑01△ctnR。

[0023] 步骤（5）所述构建mokC基因过表达质粒的方法为：

[0024] （1）设计mokC基因上下游引物mokC‑F/R；

[0025] （2）从红色红曲菌GN‑01基因组中扩增得到mokC基因；

[0026] （3）将扩增得到的mokC基因通过酶切连接，构建到PBC‑hygro原核表达载体上，获得PBC‑Hygro‑mokC过表达质粒。

[0027] 步骤（6）所述mokC过表达菌株的构建方法为：

[0028] （1）将GN‑01△ctnR菌株在PDA固体培养基上活化2代后，洗下孢子接种于种子培养基中，30℃和120 r/min振荡培养2 d；

[0029] （2）制备GN‑01△ctnR红曲菌原生质体，并通过PEG介导的方法将过表达质粒PBC‑Hygro‑mokC导入到红曲菌原生质体中，得到mokC过表达菌株。

[0030] 步骤（4）和（7）所述的菌株验证包括采用引物进行PCR验证及缺失菌株发酵验证。

[0031] 进一步地，将构建得到的菌株应用于提高洛伐他汀产量的试验中。

[0032] 本发明的有益效果：

[0033] 由于桔霉素和洛伐汀他合成的结构前体物质相同，容易导致碳代谢流存在竞争关系，本发明解决了目前只能通过单一的基因遗传操作来降低红曲霉菌桔霉素水平或提高其洛伐他汀产量的技术难题，同时在一株红曲霉菌中实现ctnR基因的敲除和mokC基因的过表达，通过代谢水平验证，构建的GN‑01△ctnR基因缺失菌株已不产桔霉素，GN‑01△ctnR‑mokC过表达菌株产Monacolin K的能力较出发菌株提高了30%，达到267 mg/L。

[0034] 附图说明：

[0035] 图1为敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn酶切验证电泳图，M：1 Kb DNA Ladder；泳道1：空质粒pGKO2 （kpnI/SalI）双酶切；泳道2：敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn （kpnI/SalI）双酶切上游同源臂；泳道3：空质粒pGKO2 （BamHI / XbaI）双酶切；泳道4：敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn （BamHI / XbaI）双酶切下游同源臂。

[0036] 图2为敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn双酶切电泳图。M：1 Kb DNA Ladder；泳道1：空质粒pGKO2（kpnI/ XbaI）双酶切；泳道2：敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn （kpnI/ XbaI）双酶切上、下游同源臂。

[0037] 图3为空质粒pGKO2‑Neo图谱示意图

[0038] 图4为敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn图谱示意图

[0039] 图5为引物ctnR‑F/R PCR验证。M：5000 bp DNA Ladder；泳道1和2：原始菌株GN‑01作对照；泳道3‑10：ctnR基因敲除转化子。

[0040] 图6为引物△ctnR‑F /R PCR验证。M：5000 bp DNA Ladder；泳道1和2：原始菌株GN‑01作对照；泳道3‑10：ctnR基因敲除转化子。

[0041] 图7为原始菌株和敲除菌株发酵后桔霉素产量HPLC检测图。

[0042] 图8为mokC过表达质粒双酶切验证图。M：5000 bp DNA Ladder；泳道1：PBC‑hygro（NotI / SmaI）双酶切；泳道2：PBC‑hygro‑mokC过表达质粒（NotI / SmaI）双酶切。

[0043] 图9为引物YZmokC‑F/R PCR验证。M：5000 bp DNA Ladder；泳道1：原始菌株GN‑01作对照；泳道2‑11：mokC基因过表达转化子。

[0044] 图10为原始菌株和过表达菌株洛伐他汀产量HPLC检测图。具体实施例

[0045] 实施例1 构建GN‑01△ctnR敲除质粒（pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn）[0046] （1）设计ctnR上下游同源臂引物各一对

[0047] ctnR‑up‑F:：5’‑GGGGTACCGGTACCTTGAGGGAATGGAGC‑3’ （kpnI）；

[0048] ctnR‑up‑R： 5’‑ACGCGTCGACGTACTGCAGACATCGGCGAG‑3’ （SalI）；

[0049] ctnR‑dn‑F：5’‑CGGGATCCTAACTAGGAAACGCGCAGGTC‑3’（BamHI）；

[0050] ctnR‑dn‑R： 5’‑GCTCTAGACAAAGTAATCGACGATGTGCG‑3’ （XbaI）；

[0051] （2）通过PCR扩增出ctnR上下游同源臂

[0052] PCR扩增体系：10×TransStart FastPfu Buffer 5 μL，High Pure dNTPs(2.5 mmol/L) 4 μL，DNA模板 1 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O补至50 μL。

[0053] PCR反应参数：98°C预变性2 min；98°C变性15 s，55°C退火15 s，72°C延伸1 min，35个循环；72°C保温5 min；4°C保存。

[0054] 上下游同源臂DNA序列测定结果如下：

[0055] 红色红曲霉ctnR上游同源臂碱基序列（5’ →3’）：

[0056] cttgagggaatggagccgggtcaaaaacgttcgcttccccagtggactgagtcctatcccagcttgggggggcgcagtcgatgtatgcaagttgtagcaatctctgatggacagcgggaatacccgcctaccaagatgatcagagttcgaagcgagcgaccaagcgtgcatatattccccttccattgcacgatgcagatgcaagttctgtaacatcgcgtagcaggtaagcactagtgcacacctgggcggcgccgaaggacacgtagtacaccggcgcgcttttcttggcagcatctagatctcacattccccagagctcatccatcatactagctccatctataaagtccgcaaagtcagtgccaggcgtcggctgcatccactgccagtgattggaaggatattgctcccttggctcaagtcgtcgcgtgatgctctctcacgagatggcctccaccgcacatcgacagccctcccggcccacgacgagacagcgacaacggacaggaagagcgtgcgaggaatgccggcgacgcaaactacgctgtgacggacagcaaccgcggtgcggagtttgtgtggattcgggtgtaacctgcgaggtcaacagccaacggcggcctaggggcccgaagaaaggctacctgacggcgttgatgaatcgagtcggtatatctgcgatgcctccagactgttatggcgcgggtgttaattgagatttatcccagcgatgctcgagacgcgtctgccggcccagcatctcgttgggcccttgtccgagttcaacccattgtcaactcccctgaccaacgaccatcatgatggctgcagtgtctccagcgcgtcgagccgttccgactcgaatccgcctccaacggtctccgagccagacatgtcattgccgaacacgacgacgagtgtcagttcggctccgtcgttcgcgacgtgcagcaaggacatcggtggagctgaaccgataacggaattggtgcaggcagaattgtaagtggcgcgagccccctcgttggcaaggtatggctgatggtcgtgtcagaaaccaactgtactttgatcgagttcacccgtccatccagatacttcaccagcgtcgttatctaggctgggccagaaatgccgcgaagaagacatctcgccgatgtctgcagtacg；

[0057] 红色红曲霉ctnR下游同源臂碱基序列（5’ → 3’）：

[0058] gggggatcctaactaggaaacgcgcaggtccatcccctcatgcccatcccattgttgctctgcgccgaatttctatacagtaatcgaggatcggatgcggcatttaactctctgcttcaagagctcctgcagattttccgtcaactcaaaaatgccaacgatccaagtcgaagttatatacatttattagagctctcatgtaccacagcgtcgatgagcttggtaagagaacactctaatgcaccatgattgtatatatatgggtcctatgatgatgtactggtcaaaatgaataaatgattgcgttcataaggttggttatcattggcatggcttctacttatgttcattttccgctgaaagtatatagcatctccggaattccacttcctgaggaagagaccagtagagagcagcagatcgctacgattactttactttgagattgtaagtggtggttgtgcgctccaacatatgttcctccacagtgagagtatcttcctcgtcccaattctgcccaacgcgatccagcggccttagcctgtagtccaggttgccatcgaagaaaaacactacactgtaacgatcggtcagattctggttgatgacgcggtgaatgctactcttgtaatgacccctggtgattctgctcatcatatctcccaggttgaccacgtaagcgtctttgttcggaggaactccaatccactcccccgtttcgcagtcctgaacctcaagcccggaatgatcatcttgcaagagaagcgtgatggctccaaagtccgtatgcgcactactgcccagctggcgacccttggccacatccggtgcgggagcgggcggataatggagcagtcgaagtgggcatgcaggatcgttttccttgaactcatcgaagacatggggcccgtacggcaatgtggccgcgacaaggtccaacactacccagcacagcttcagcatggcctggtagtattcttcaatggggcggcggaagtttgcctccggcagcagctcgctcggcggccatgcgttctgtcccatgaagaaccgctggctcgccactcgtggatcgtcgaggggaatgtctttcccggcaatgaagccttcttttaggtctgggaggactcccagttcgtacgactgcgaggccatggggtcgtaccctcggaagccgacgttcctgcagcgtgatttgacgtcggagggaagcgcgaagaacttggccgctgcggcgaagacggactgctgcagtgctggggaaatcccatgcccgaggagttggaagaaccctgtagaggtgcacgcagctcgcacatcgtcgattactttgtctagagcg。

[0059] （3）为获得不同抗性质粒，本实验室以pGKO2质粒为骨架，从质粒pCDNA3.0中扩增得到新霉素抗性基因，再用HindIII /AflII双酶切pGKO2空质粒和得到的新霉素基因neo，利用连接酶获得含neo基因的重组质粒pGKO2‑Neo。用Thermo KpnI/ SalI双酶切ctnR上游同源臂和pGKO2‑Neo空质粒（图3，实验室构建保存），再胶回收进行酶连，取酶连产物加入到100 μL E.coli DH5a感受态细胞中，轻微吹打混匀后冰浴30 min；42℃热激45‑90 s，于冰上放置2 min；加入800 µL LB培养基，37℃和200 r/min培养45‑60 min；6000 ×g 离心2 +
min，吸取80 μL上清重悬菌体，涂布在LB（含50μg/mL Kana）平板上，37℃培养12 h。挑取克隆子，进行菌落PCR验证，然后将验证正确的菌落扩大培养，提取质粒进行双酶切验证。重复上述操作，将ctnR下游同源臂连接到上游同源臂构建好的质粒pGKO2‑Neo‑ctnR‑up上，完成ctnR敲除质粒（pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn）的构建（图4）。将构建完成的ctnR敲除质粒进行双酶切验证（图1、2），电泳结果显示均有切出目的片段大小的条带，表明ctnR敲除质粒构建完成。

[0060] 实施例2 GN‑01菌株的转化

[0061] 将构建好的敲除质粒（pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn）电击导入农杆菌（AGL‑1）中，在含100 μg/mL卡那霉素的Luria‑Bertani平板上获得含敲除质粒的农杆菌转化子（AGL‑1‑ pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn）。将含敲除质粒的农杆菌在含有200 μmol/L乙酰丁香酮的诱导培
7
养基（IM）下培养9‑10 h，OD600为0.5左右，与红色红曲菌GN‑01孢子（浓度10个/mL）等体积混匀，涂布于含乙酰丁香酮的共生培养基上，25℃下避光培养2‑3 d。洗下共生板上菌丝，涂布于含300 μg/mL头孢噻肟和50 μg/mL新霉素的PDA平板上，30℃下培养4‑5 d获得敲除转化子。再将转化子挑到含300 μg/mL头孢噻肟和50 μg/mL新霉素的PDA复筛平板上，形成单菌落并接种液体PD培养基，30℃培养3‑4 d，收集菌丝，提取基因组，通过PCR验证红曲基因组上桔霉素合成基因的缺失，并进行后续发酵确认减除红曲桔霉素的产量。

[0062] 实施例3 GN‑01△ctnR敲除菌株验证

[0063] （1）设计引物进行PCR验证

[0064] 将在新霉素抗性板上长出来的转化子连续传5代，筛选出稳定遗传的转化子。提取转化子的基因组DNA并以其为模板，分别在上、下游同源臂上设计引物ctnR‑F和ctnR‑R；在 ctnR基因缺失区域内设计△ctnR‑F和△ctnR‑R引物来进行PCR验证。如果用引物ctnR‑F和ctnR‑R，转化菌株扩增出的条带为1500 bp左右，而对照扩增出的条带为1200 bp左右（图5）；用引物△ctnR‑F和△ctnR‑R，对照菌株能扩增出900 bp左右的条带，而转化菌株不能扩增出条带（图6），则初步证明该转化子已成功进行了置换型同源重组，ctnR缺失菌株构建成功。

[0065] 验证引物序列为：

[0066] ctnR‑F：5’‑AGAAATGCCGCGAAGAAGAC‑3’；

[0067] ctnR‑R：5’‑GCATCCGATCCTCGATTACTG‑3’；

[0068] △ctnR‑F：5’‑ACATCTTCAAGACTCCTTCTACC‑3’；

[0069] △ctnR‑R：5’‑TGTCAGCCCTTTTGCTAGCTT‑3’；

[0070] （2）缺失菌株发酵验证

[0071] 将PCR验证正确的转化子，划线PDA平板，30℃培养5‑6 d，用无菌水洗下孢子，再用7
血球计数板进行计数，将计数后的孢子悬液接种种子培养基 A1，每瓶接种约10个孢子，30℃和120 r/min振荡培养2 d，以10%的接种量将种子液接种到发酵培养基，25℃和150 r/min培养15 d。以原始菌株GN‑01作为对照，通过HPLC检测发酵液中的桔霉素含量，发现ctnR基因缺失菌株GN‑01△ctnR不产桔霉素（图7）。所提及的种子培养基A1配方：葡萄糖3%，蛋白胨2%，酵母膏2%，黄豆粉1%，甘油5%（w/w），MgSO4·7H2O 0.1%，NaNO3 0.2%，ZnSO4·7H2O 
0.2%，KH2PO4 0.1%，pH自然。所提及的发酵培养基配方：甘油3%，黄豆粉1.5%，ZnSO4·7H2O 
0.66%，KH2PO4 0.017%，MgSO4·7H2O 0.15%，培养基初始pH 5左右，装液量50 mL/250 mL。

[0072] 实施例4 构建GN‑01△ctnR和mokC过表达菌株

[0073] （1）mokC过表达质粒构建

[0074] ①设计mokC基因上下游引物：

[0075] mokC‑F：5’‑AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGACAGTTCCGACAGATACG‑3’（NotI）[0076] mokC‑R：5’‑TCCCCCGGGTCAGAGATCTTCGTCCCGAC‑3’（SmaI）

[0077] ②通过PCR扩增红色红曲菌基因组中的mokC基因；

[0078] ③将扩增得到的mokC基因通过酶切连接到PBC‑hygro原核表达载体上，构建PBC‑Hygro‑mokC过表达质粒；构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用Thermo NotI /SmaI进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800 bp左右和1700 bp左右的两段目的片段（图8），与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。

[0079] （2）菌丝培养

[0080] 将GN‑01△ctnR菌株在PDA固体培养基上活化2代后，洗孢子，取浓度为1×105的孢子悬液100 μL转接到50mL种子培养基A1中，30℃和120 r/min振荡培养2 d。

[0081] （3）制备GN‑01△ctnR红曲菌原生质体，并通过PEG介导的方法将过表达质粒PBC‑Hygro‑mokC导入到红曲菌原生质体中，得到mokC过表达菌株。操作方法参考文献Applied Biochemistry and Microbiology, 2018年, 第54卷, 第2期, 页码188–197。

[0082] 实施例5 GN‑01△ctnR和mokC过表达菌株验证

[0083] （1） 设计引物进行PCR验证

[0084] 将在含100 μg/mL潮霉素的PDA平板上长出来的转化子连续传5代，筛选出稳定遗传的转化子。提取转化子的基因组DNA并以其为模板，在PBC‑Hygro质粒多克隆位点两端选取适当的位点设计验证引物YZmokC‑F和YZmokC‑R；用验证引物YZmokC‑F和YZmokC‑R，对照菌株不能扩增出条带，而转化菌株能扩增出1800 bp左右的条带（图9），则初步证明该过表达质粒已成功整合到基因组上，GN‑01△ctnR和mokC过表达菌株构建成功。

[0085] 验证引物序列为：

[0086] YZmokC‑F：5’‑ CTGCAAGGCGATTAAGTTGG‑3’

[0087] YZmokC‑R：5’‑ ACCATGATTACGCCAAGCGC ‑3’

[0088] （2） 过表达菌株发酵验证

[0089] 将PCR验证正确的转化子进行摇瓶发酵，以菌株GN‑01△ctnR作为对照，通过HPLC检测发酵液中的桔霉素和Monacolin K含量，发现过表达后的转化子仍不产桔霉素，且Monacolin K产量较对照提高30%，达到267 mg/L（图10）。