ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用及其表达载体

摘要

本发明提供了一种ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。所述ARHGEF19反义核苷酸序列的靶向序列为位于ARHGEF19上的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。所述ARHGEF19反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。还提供了一种如前所述ARHGEF19反义核苷酸序列的表达载体。本发明针对目前小细胞肺癌治疗效果欠佳的情况，提供靶向治疗策略，通过ARHGEF19的反义核苷酸序列降低ARHGEF19的表达，从而抑制小细胞肺癌细胞的生长。

权利要求

1.ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其中，所述ARHGEF19反义核苷酸序列通过降低ARHGEF19的表达，从而达到抑制小细胞肺癌生长的目的。

2.根据权利要求1所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的靶向序列为位于ARHGEF19上的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。

3.根据权利要求1所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求1所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，所述小细胞肺癌细胞为ARHGEF19高表达的小细胞肺癌细胞。

6.根据权利要求5所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，所述小细胞肺癌细胞为NCI‑H69细胞或NCI‑H526细胞。

7.根据权利要求1‑6任一项所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，将所述ARHGEF19反义核苷酸序列克隆入沉默表达载体中，用于制备抑制小细胞肺癌细胞生长的药物。

8.一种如权利要求7所述的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制小细胞肺癌细胞生长药物中的应用，其特征在于，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的表达载体是以pLKO.1‑TRC cloning vector载体为基础载体构建得到的。

说明书

ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的

应用及其表达载体

技术领域

[0001] 本发明涉及抑制肿瘤细胞生长技术领域，尤其是涉及一种ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用及其表达载体。

背景技术

[0002] ARHGEF19(Rho guanine nucleotide exchange factor 19，又称为WGEF) 属于Rho鸟苷酸交换因子(RhoGEFs，又称为ARHGEFs)家族，RhoGEFs蛋白可以通过催化Rho‑GDP为
Rho‑GTP使其活化，从而激活Rho蛋白，而Rho蛋白参与细胞内多种信号转导途径，在基因转
录、细胞周期、囊泡运输及血管生成中发挥着重要作用。已有研究报道RhoGEFs家族成员参
与肿瘤的发生与发展，如ARHGEF2在乳腺癌、黑色素瘤及肝癌等肿瘤的转移过程中发挥着促
进作用，而ARHGEF5的高表达会促进肺腺癌的发生及转移。ARHGEF19作为 RhoGEFs家族的成
员，我们之前已经报道，ARHGEF19在非小细胞肺癌中显著高表达，在敲降ARHGEF19可以抑制
非小细胞肺癌的增殖与转移等过程。

[0003] 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，其发生率及死亡率均位列第一。肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，小细胞肺癌占肺癌发病病例的15％‑20％，虽然比例
较非小细胞肺癌低，但与非小细胞肺癌相比，小细胞肺癌的肿瘤增殖速度更快，恶性程度更
高，发生转移的时期更早等特点，而且由于小细胞肺癌诊断时肿瘤有广泛扩散的趋势，小细
胞肺癌往往很难治愈。

[0004] 由于小细胞肺癌转移快，所以只有极少数患者可以进行手术切除，主要治疗手段是联合化疗加胸部放疗，但是往往伴随着毒副作用及耐药反应，使小细胞肺癌患者预后很
差。

[0005] 针对小细胞肺癌的特点，进行特异性治疗来提高小细胞肺癌治疗的特异性和灵敏性，是达到根治的重要策略。通过RNA干扰(RNA interference， RNAi)抑制ARHGEF19的表
达，从而抑制小细胞肺癌的生长，可应用于制备抑制小细胞肺癌生长的药物。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用，针对目前小细胞肺癌治疗效果欠佳的情况，提供靶向治疗策略，通过
ARHGEF19的反义核苷酸序列降低ARHGEF19的表达，从而抑制小细胞肺癌细胞的生长。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。

[0008] 优选地，所述ARHGEF19反义核苷酸序列通过降低ARHGEF19的表达，从而达到抑制小细胞肺癌生长的目的。

[0009] 优选地，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的靶向序列为位于ARHGEF19上的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。

[0010] 优选地，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

[0011] 优选地，所述ARHGEF19反义核苷酸序列的正反两条序列分别如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

[0012] 优选地，所述肿瘤细胞为ARHGEF19高表达的小细胞肺癌细胞。

[0013] 优选地，所述小细胞肺癌细胞为NCI‑H69细胞或NCI‑H526细胞。

[0014] 优选地，将所述ARHGEF19反义核苷酸序列克隆入沉默表达载体中，用于制备抑制小细胞肺癌细胞生长的药物。

[0015] 本发明还提供了一种如前所述ARHGEF19反义核苷酸序列的表达载体，所述表达载体是以pLKO.1‑TRC cloning vector载体为基础载体构建得到的。

[0016] 本发明针对ARHGEF19高表达的小细胞肺癌，选择NCI‑H69和NCI‑H526 细胞系为研究对象，用ARHGEF19的反义核苷酸序列与靶基因的信使RNA (message RNA，mRNA)结合来抑
制ARHGEF19的基因表达，结果表明ARHGEF19 的反义核苷酸可以降低其RNA及蛋白的表达，
从而抑制小细胞肺癌细胞的生长。

附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。

[0018] 下面结合附图和具体实施方式对本发明的ARHGEF19反义核苷酸序列在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用及其表达载体作进一步的详细描述。

[0019] 图1为ARHGEF19‑shRNA‑1质粒的测序结果，表明载体构建成功；

[0020] 图2为ARHGEF19‑shRNA‑2质粒的测序结果，表明载体构建成功；

[0021] 图3为Scramble‑shRNA质粒的测序结果，表明载体构建成功；

[0022] 图4为qPCR检测NCI‑H69敲降细胞中ARHGEF19的mRNA表达；

[0023] 图5为western blot检测NCI‑H69敲降细胞中ARHGEF19的蛋白表达水平；

[0024] 图6为qPCR检测NCI‑H526敲降细胞中ARHGEF19的mRNA表达；

[0025] 图7为western blot检测NCI‑H526敲降细胞中ARHGEF19的蛋白表达水平；

[0026] 图8为NCI‑H69敲降细胞的生长曲线；

[0027] 图9为NCI‑H526敲降细胞的生长曲线；

[0028] 图10为流式细胞术检测NCI‑H69细胞的细胞周期分布。

具体实施方式

[0029] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施
例的组件能够以各种不同的配置来布置和设计。

[0030] 因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通
技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范
围。

[0031] 实施例1.构建pLKO.1‑ARHGEF19‑shRNA慢病毒载体

[0032] (1)合成以下含有ARHGEF19的反义核苷酸序列的正反两条寡核苷酸序列(oligos，5’→3’)：

[0033] ARHGEF19‑shRNA‑1‑Forward：

[0034] CCGGGCCCAGTGTGTCTGGACCTTTCTCGAGAAAGGTCCAGACACACTGGGCTTTTTG(如SEQ ID NO.3所示)；

[0035] ARHGEF19‑shRNA‑1‑Reverse：

[0036] AATTCAAAAAGCCCAGTGTGTCTGGACCTTTCTCGAGAAAGGTCCAGACACACTGGGC(如SEQ ID NO.4所示)；

[0037] ARHGEF19‑shRNA‑2‑Forward：

[0038] CCGGCCAGTCTCGATTCCTCCTTAACTCGAGTTAAGGAGGAATCGAGACTGGTTTTTG(如SEQ ID NO.5所示)；

[0039] ARHGEF19‑shRNA‑2‑Reverse：

[0040] AATTCAAAAACCAGTCTCGATTCCTCCTTAACTCGAGTTAAGGAGGAATCGAGACTGG(如SEQ ID NO.6所示)；

[0041] 并同时合成以下在基因组上无任何对应序列的杂乱序列的正反两条寡核苷酸序列(5’→3’)作为对照：

[0042] Scramble‑shRNA‑Forward：

[0043] CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG(如SEQ ID NO.7所示)；

[0044] Scramble‑shRNA‑Reverse：

[0045] AATTCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTG(如SEQ ID NO.8所示)。

[0046] (2)寡核苷酸退火

[0047] 用灭菌去离子水溶解合成的寡核苷酸，终浓度为100nM，在微型离心管中配制以下反应体系：

[0048]

[0049] 100℃水浴中煮5min，然后在水浴中缓慢降温至室温。

[0050] (3)pLKO.1‑TRC cloning vector(以下简称pLKO.1)慢病毒载体的酶切

[0051] 慢病毒载体可以有效地将外源基因整合到宿主基因组上，从而实现持久表达，目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中，具有高效敲降基因、可以长期阻断基因的表达等
优点，因此具有广泛的应用前景。pLKO.1慢病毒载体具有嘌罗霉素(Puromycin)抗性基因，
可以快速得到稳定细胞株。pLKO.1 载体(Addgene公司，货号#10878，质粒全长8901bp)，含
有Age I和EcoR I限制性酶切位点，用这两个酶对该载体进行双酶切，得到含有粘性末端的
线性化载体，双酶切反应体系如下所示：

[0052]

[0053] 37℃水浴孵育2‑3h，然后跑琼脂糖凝胶电泳，用凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切产物，得到线性化载体片段。

[0054] (4)寡核苷酸退火产物与线性化的pLKO.1载体连接重组

[0055] 连接反应体系如下所示：

[0056]

[0057] 16℃孵育1h。

[0058] (5)连接产物的转化

[0059] 从‑80℃环境中取出DH5α感受态细胞，待其融化后加入10μl连接产物，轻轻混匀，然后冰上放置30min；42℃水浴中热激90s，然后迅速在冰上放置2‑3min；加入600μlLB液体
培养基(不含抗生素抗性)，放在37℃摇床中振荡培养45‑60min；3000rpm离心2min，用100μl
上清液重悬沉淀，均匀涂布在含有氨苄青霉素(Ampicillin)的LB固体培养皿中，待菌液完
全被培养基吸收后倒置培养皿放置在37℃恒温培养箱培养过夜。

[0060] (6)挑取单克隆并进行测序验证

[0061] 培养皿培养14h后即可长成单克隆菌落，每个挑取2‑3个单克隆菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃摇床240rpm振荡培养15h；提取质粒，送至公司进行二代测序，将测序的
序列与设计的序列进行Blast同源性比对分析，选择比对正确的单克隆进行后面的实验，图
1、图2和图3分别是三个质粒测序的结果图。

[0062] 实施例2.构建稳定敲降ARHGEF19的小细胞肺癌细胞

[0063] (1)慢病毒的包装

[0064] 首先将HEK293T细胞以每孔5×105个细胞铺在六孔板中，培养过夜；第二天细胞密度为60‑70％时进行转染，转染质粒的比例为pLKO.1载体∶ psPAX.2∶pMD2.G＝4∶3∶1，转染
TM
过程按照Lipofectin 2000转染试剂说明书进行；转染8h后更换新鲜培养基，换液后48h收
集上清即为慢病毒液。

[0065] (2)慢病毒感染小细胞肺癌细胞及稳定细胞系的筛选

[0066] 用包装的慢病毒液感染小细胞肺癌细胞系NCI‑H69和NCI‑H526细胞，感染48h后加入嘌呤霉素(Puromycin)进行稳定筛选，筛选5天左右，使空白对照组细胞全部死亡，而感染
慢病毒的细胞存活下来。

[0067] (3)稳定细胞系的鉴定

[0068] 将上述筛选后的细胞，分别提取RNA和蛋白，进行qPCR和Western blot 验证mRNA水平和蛋白水平的敲降效果。

[0069] qPCR检测mRNA水平的敲降效率：筛选得到的细胞，用TRIzol  Reagent (ThermoFisher Scientific)提取总RNA，然后用EasyScript One‑Step gDNA Removal and 
cDNA Synthesis SuperMix(TranGen Biotech)试剂盒逆转录合成cDNA，反应条件为42℃
15min，85℃5s，4℃∞。合成的cDNA用灭菌去离子水稀释10倍，进行qPCR，检测ARHGEF19的
mRNA水平。由NCBI Gene 数据库获得ARHGEF19的基因序列，应用Primer 5设计基因特异性
引物，并由睿博公司合成，引物序列如下：

[0070] ARHGEF19‑qPCR‑F：5’‑TGAAGAGGACAGAGGAAC‑3’(SEQ ID NO.9所示)

[0071] ARHGEF19‑qPCR‑R：5’‑GAAGAGGTGGAGGTAGAC‑3’(SEQ ID NO.10所示)

[0072] qPCR结果分析采用GAPDH作为内参对照，用‑2ΔΔc(t)法计算ARHGEF19相对表达量，用SPSS软件进行统计学分析。结果如图4和图6所示，在两种小细胞肺癌细胞中，两条shRNA
都可以在mRNA水平显著敲降ARHGEF19。

[0073] Western blot检测蛋白水平的敲降效率：分别用蛋白裂解液(lysis) 收取筛选得到细胞的总蛋白，充分裂解后离心取上清进行蛋白定量，定量方法按照BCA蛋白含量检测试
剂盒的方法进行，提取20μg总蛋白进行 Western blot实验。结果如图5和图7所示，以GAPDH
蛋白为内参蛋白，在两种小细胞肺癌细胞中，与Scramble‑shRNA相比，两条ARHGEF19 shRNA
在蛋白水平也显著敲降ARHGEF19。

[0074] 经过qPCR和Western blot验证，发现与Scramble‑shRNA相比， ARHGEF19‑shRNA‑1和ARHGEF19‑shRNA‑2都可以显著敲降ARHGEF19，可以用于后续实验。

[0075] 实施例3.ARHGEF19敲降对小细胞肺癌细胞生长的影响

[0076] 对上述验证好的细胞进行计数，细胞稀释为1×105个细胞/ml，接种在六孔板中，5
每孔接种1ml，即1×10个细胞/孔，每组细胞共接种7个孔，放在培养箱中继续培养。第二天
取每组各一个孔的细胞进行计数，每次计三次，取平均值作为该组的细胞数目。继续计数，
共统计7天每组细胞的数目。重复三次，以时间(天数)为横轴，每天的细胞数目为纵轴，绘制
细胞生长曲线，用SPSS软件进行统计学分析。图8和图9分别为NCI‑H69和NCI‑H526 细胞敲
降ARHGEF19后，细胞的生长曲线，表明shRNA抑制ARHGEF19表达后，这两种细胞的增殖能力
显著降低。

[0077] 实施例4.ARHGEF19敲降对细胞周期的影响

[0078] 收集构建好的NCI‑H69敲降细胞系，1000g左右离心3min沉淀细胞，小心吸除上清，加入1ml预冷的PBS重悬细胞，并将细胞转移至1.5ml离心管中，再次离心，小心弃去上清。用
300μl预冷的PBS重悬细胞，然后在旋涡振荡器上一边低速涡旋，一边缓慢加入700μl预冷的
无水乙醇，使其混合均匀，放在4℃固定过夜。第二天用1000g离心细胞3min，然后用预冷的
PBS洗涤细胞两次，然后用碘化丙啶染色液(Propidium Iodide，PI)染色30min，然后用流式
细胞仪在488nm的激发波长处检测荧光。用ModFit 软件分析细胞周期各个时期的细胞分布
情况，结果如图10和下表所示。

[0079] ARHGEF19敲降后NCI‑H69细胞的细胞周期分布情况

[0080]

[0081] 结果表明，ARHGEF19基因敲降后，细胞处在S期的比例升高，说明细胞被阻滞在S期。

[0082] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。